黃 昊，何涓源，賴思婷，陳利忠，馮艷麗，余 翔,*

（1.浙江恒通生物科技股份有限公司，浙江 湖州 313014；2.湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002）

青蝦（Macrobrachium nipponense）學(xué)名日本沼蝦，是我國及東南亞國家特有的經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類，其味道鮮美且具有高蛋白、低脂肪的營養(yǎng)特點[1]，深受消費者的青睞，市場需求量逐年擴增，但新鮮青蝦捕獲離水后極易死亡，且由于其肌肉含水量高、營養(yǎng)豐富，在冷藏過程中極易發(fā)生腐敗變質(zhì)[2]，如何延長其冷藏貨架期是青蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展中面臨的瓶頸問題。

近年來，眾多學(xué)者圍繞蝦類生鮮水產(chǎn)品的保鮮開展了大量的研究，研發(fā)出天然保鮮劑保鮮[3]、氣調(diào)保鮮[4]和輻照保鮮等技術(shù)應(yīng)用于生鮮水產(chǎn)品的保鮮，其中天然保鮮劑以其安全、高效、成本低且容易操作等優(yōu)點備受研究人員關(guān)注，各種具有成膜、抑菌和抗氧化等作用的天然物質(zhì)如殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物、乳酸鏈球菌素（Nisin）、茶多酚等被逐步開發(fā)并應(yīng)用于生鮮水產(chǎn)品的保鮮中，并取得了較好的保鮮效果。但研究也表明，使用單一天然保鮮劑進(jìn)行生鮮水產(chǎn)品保鮮時，往往會出現(xiàn)保鮮劑用量過大但保鮮效果有限的現(xiàn)象，且不能有效的抑制或殺死食品中的腐敗和致病微生物。而根據(jù)柵欄技術(shù)的原理，將不同種類的天然保鮮劑進(jìn)行復(fù)配，可發(fā)揮不同天然保鮮劑的協(xié)同效應(yīng)，使保鮮效果大幅提升[5]。

課題組前期通過正交試驗將殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素（Nisin）四種天然保鮮劑組分進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化，開發(fā)出一種適用于青蝦冷藏保鮮的復(fù)配天然保鮮劑（殼聚糖12.5 g/L、卡拉膠1.75 g/L、迷迭香提取物0.9 g/L、Nisin 0.7 g/L），該保鮮劑可以大幅延長青蝦的冷藏貨架期。為盡快將該青蝦復(fù)配天然保鮮劑應(yīng)用于生產(chǎn)實際中，本試驗對采用該復(fù)配天然保鮮劑涂膜處理的青蝦在冷藏過程中pH 值、揮發(fā)性鹽基氮（Total volatile basic nitrogen, TVB-N）、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（Thiobarbituric acid reactive substances,TBARS）值、菌落總數(shù)等理化指標(biāo)進(jìn)行檢測，同時結(jié)合青蝦肌肉蛋白的SDS-PAGE 電泳研究肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的穩(wěn)定性，全面評價該復(fù)配天然保鮮劑對青蝦保鮮效果的影響，為進(jìn)一步的產(chǎn)業(yè)化實施提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

本研究所用青蝦來自浙江恒通生物科技股份有限公司養(yǎng)殖基地，捕撈后在青蝦處于鮮活狀態(tài)下運輸至實驗室進(jìn)行后續(xù)樣品保鮮處理。

殼聚糖（脫乙酰度＞90%）、迷迭香提取物、卡拉膠和乳酸鏈球菌素（以上均為食品級），購于河南圣斯得實業(yè)有限公司；硼酸、氧化酶、硫酸、氫氧化鈉等化學(xué)試劑，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

K9860 型全自動凱氏定氮儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；BCM-1300A 型生物潔凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；CP114 型電子天平，美國奧豪斯儀器（上海）有限公司；PHS-3C 型pH 計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)配天然保鮮劑的配制及樣品處理方法

1.2.1.1 復(fù)配天然保鮮劑配制方法

參照課題組前期研究所獲得的復(fù)配天然保鮮劑配方（殼聚糖12.5 g/L、卡拉膠1.75 g/L、迷迭香提取物0.9 g/L、Nisin 0.7 g/L）進(jìn)行配制。根據(jù)配方稱取相應(yīng)質(zhì)量的殼聚糖粉末，用1%醋酸溶液溶解制成殼聚糖溶液，再按照配方稱取相應(yīng)質(zhì)量的迷迭香提取物、卡拉膠和乳酸鏈球菌素溶解于殼聚糖溶液中，攪拌均勻制成復(fù)配天然保鮮劑，4 ℃貯藏備用。

1.2.1.2 樣品處理方法

試驗組：將50 尾大小一致的新鮮青蝦洗凈、瀝干，將青蝦在復(fù)配天然保鮮劑溶液中浸漬10 min，料液比為1∶2（g/mL）。撈出后于4 ℃瀝干30 min，逐只用小號保鮮袋分裝，4 ℃冷藏備用。

對照組：將50 尾大小一致的新鮮青蝦洗凈、瀝干，分裝至保鮮袋，4 ℃冷藏備用。

冷藏當(dāng)天，取6 尾清洗、瀝干后的新鮮青蝦，去頭、剝殼后取尾部肌肉進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定，所測值作為青蝦原料保鮮初始值。從冷藏第1 天起，每日分別從試驗組和對照組各取6 尾青蝦，取其尾部肌肉進(jìn)行相關(guān)保鮮指標(biāo)測定。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 pH 值

參照GB 5009.237—2016[6]規(guī)定的方法對樣品進(jìn)行測定。

1.2.2.2 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值

參照GB 5009.228—2016[7]規(guī)定的方法，采用自動凱氏定氮法對樣品進(jìn)行測定。

1.2.2.3 硫代巴比妥酸反應(yīng)物含量（TBARS）值

參照GB/T 35252—2017[8]規(guī)定的方法對樣品進(jìn)行測定。

1.2.2.4 菌落總數(shù)

參照GB 4789.2—2016[9]規(guī)定的方法對樣品進(jìn)行測定。

1.2.2.5 肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的穩(wěn)定性檢測

青蝦肌肉蛋白的提?。簠⒖糚ang 等[10]的方法，將青蝦尾部肌肉取出絞碎，準(zhǔn)確稱取1 g 置于50 mL 離心管中，加入10 mL 50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.2,0.55 mol/L KI）, 勻漿后置于4 ℃搖床上浸提20 h，然后以4 200 r/min 離心30 min，收集上清液即青蝦肌肉蛋白提取液，備用。

肌肉蛋白質(zhì)SDS-PAGE 電泳：參考Pang 等[10]的方法，采用SDS-PAGE 分析復(fù)配天然保鮮劑涂膜處理對青蝦冷藏過程中肌肉蛋白質(zhì)變化的影響。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的分離膠和4%的濃縮膠對青蝦肌肉蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析, 電泳結(jié)束后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察蛋白質(zhì)條帶變化。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件的One-way ANOVA 程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏過程中青蝦肌肉pH 值的變化

pH 值是衡量肉質(zhì)新鮮程度的重要依據(jù)[11]，復(fù)配涂膜試驗組青蝦冷藏過程中pH 值的變化見圖1。青蝦新鮮原料初始pH 值為7.15，在冷藏第1 天，對照組和復(fù)配涂膜組青蝦樣品的pH 值均略微下降，可能與冷藏初期青蝦經(jīng)歷僵直和解僵過程，體內(nèi)糖原和ATP 分解產(chǎn)生乳酸、磷酸等酸性物質(zhì)，使得肌肉pH值下降有關(guān)[12]，復(fù)配涂膜組青蝦pH 值低于對照組，可能是在青蝦涂膜和冷藏過程中，復(fù)配天然保鮮劑中的少量醋酸組分滲透進(jìn)蝦肉所致。從冷藏第2 天開始，兩組青蝦樣品的pH 值均開始呈現(xiàn)上升趨勢。眾多研究證明，在肉品自溶期開始后，肌肉內(nèi)源及微生物來源蛋白酶的共同作用促使肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解產(chǎn)生胺類等堿性物質(zhì)，引起肌肉pH 值上升，是肉品開始腐敗變質(zhì)的重要特征[13-14]。冷藏的2～8 d，復(fù)配涂膜組青蝦肌肉pH 值均低于對照組，說明復(fù)配天然保鮮劑中的殼聚糖、迷迭香提取物和Nisin 等抗菌組分對青蝦內(nèi)腐敗微生物的生長具有抑制作用，延緩了冷藏過程中由于微生物生長導(dǎo)致的青蝦腐敗現(xiàn)象的發(fā)生。甘暉等[15]研究表明，殼聚糖和茶多酚等天然保鮮劑能改變南美白對蝦冷藏中的微生物區(qū)系，降低腐胺、尸胺等堿性物質(zhì)含量，抑制南美白對蝦冷藏過程中的品質(zhì)惡化，本研究結(jié)果與其一致。

圖1 4 ℃冷藏期間青蝦肌肉pH 值的變化Fig.1 The variation of muscle pH value of M.nipponense muscle stored at 4 ℃

2.2 冷藏過程中青蝦肌肉TVB-N 值的變化

TVB-N 是動物源水產(chǎn)品在酶和微生物的作用下，使其肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生腐敗而分解產(chǎn)生的氨及胺類等堿性物質(zhì)，是評價動物性水產(chǎn)品新鮮程度的重要參數(shù)之一[16]。我國相關(guān)水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，淡水魚蝦TVB-N≤20 mg/100 g 為可接受范圍，其中TVB-N≤10 mg/100 g 為一級鮮度標(biāo)準(zhǔn)[17]。復(fù)配涂膜試驗組青蝦冷藏過程中TVB-N 值的變化見圖2。新鮮青蝦TVB-N 值為6.80 mg/100 g，符合一級鮮度要求。冷藏過程中對照組和復(fù)配涂膜組的TVB-N 值均呈上升趨勢。冷藏第4 天時，對照組青蝦的TVB-N 值達(dá)到20.40 mg/100 g，已失去食用價值，而復(fù)配涂膜組在冷藏第7 天其TVB-N 值為19.49 mg/100 g，仍在國家標(biāo)準(zhǔn)的限定范圍內(nèi)。該結(jié)果表明，在青蝦冷藏過程中，復(fù)配天然保鮮劑抑制了微生物的生長繁殖，降低了因微生物腐敗造成的氨和胺類等堿性物質(zhì)的產(chǎn)生，延長了青蝦冷藏貨架期。Liu 等[18]將殼聚糖、丁香精油和曲酸復(fù)配涂膜南美白對蝦，在冷藏過程中，試驗組青蝦TVB-N 值的增長被抑制，這與殼聚糖能抑制腐敗微生物的生長，進(jìn)而延緩肌肉蛋白質(zhì)腐敗降解有關(guān)。相關(guān)的一些研究也證明，迷迭香提取物[19]和Nisin[20]具備較好的抑菌性能，用于水產(chǎn)品冷藏中具有較好的保鮮效果。

圖2 4 ℃冷藏期間青蝦肌肉TVB-N 值的變化Fig.2 The variation of muscle TVB-N value of M.nipponense stored at 4 ℃

2.3 冷藏過程中青蝦肌肉TBARS 值的變化

水產(chǎn)品肌肉中含有大量不飽和脂肪酸組分，在冷藏過程中容易發(fā)生脂肪氧化進(jìn)而影響水產(chǎn)品感官和肉質(zhì)品質(zhì)，因此，在水產(chǎn)品冷藏過程中控制其脂肪氧化程度是保鮮的關(guān)鍵。硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid, TBA）可與脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的的丙二醛（Malondialdehyde,MDA）形成穩(wěn)定的紅色物質(zhì)，通過顯色反應(yīng)可以定量評價水產(chǎn)品脂肪氧化的程度[21]。目前，我國尚沒有明確規(guī)定水產(chǎn)品中TBARS 限量標(biāo)準(zhǔn)，但國外相關(guān)研究推薦水產(chǎn)品中丙二醛的含量閾值為1～2 mg/kg[22]。復(fù)配涂膜試驗組青蝦冷藏過程中TBARS值的變化見圖3。隨著冷藏時間的延長，對照組和復(fù)配涂膜組青蝦的TBARS 值均呈上升趨勢，但復(fù)配涂膜組青蝦的TBARS 值始終低于對照組。冷藏第6 天時，對照組青蝦肌肉TBARS 值達(dá)到2.04 mg/kg，超過建議限量標(biāo)準(zhǔn)；而復(fù)配涂膜組青蝦冷藏第8 天，其TBARS 值為1.81 mg/kg，仍在建議限量范圍內(nèi)。以上結(jié)果表明，該復(fù)配天然保鮮劑處理能有效延緩青蝦肌肉中的脂肪氧化速率，有利于青蝦的冷藏保鮮。分析原因有以下兩點：首先，復(fù)配天然保鮮劑中的殼聚糖組分具有良好的成膜性，能在青蝦表面形成致密的可食性膜，隔絕了青蝦肌肉與氧氣的接觸。其次，復(fù)配天然保鮮劑中迷迭香提取物富含迷迭香酚、鼠尾草酚和鼠尾草酸等組分，對脂肪的抗氧化效果良好。Ozogul等[19]和劉金昉等[23]的研究也證明了這一觀點。

圖3 4 ℃冷藏期間青蝦肌肉TBARS 值的變化Fig.3 The variation of muscle TBARS value of M.nipponense stored at 4 ℃

2.4 冷藏過程中青蝦菌落總數(shù)的變化

微生物生長是水產(chǎn)品冷藏過程中發(fā)生腐敗變質(zhì)的主要原因，菌落總數(shù)是評價水產(chǎn)品腐敗程度的重要依據(jù)。Cai 等[24]和Manju 等[25]研究表明，水產(chǎn)品中菌落總數(shù)的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)限量值為7 lg(CFU/g)，并建議將該值作為評價水產(chǎn)品貨架期終點的標(biāo)志。復(fù)配涂膜試驗組青蝦冷藏過程中菌落總數(shù)的變化見圖4。隨著冷藏時間的延續(xù)，對照組和復(fù)配涂膜組青蝦的菌落總數(shù)均呈上升趨勢，且復(fù)配涂膜組始終低于對照組。冷藏第6天，對照組青蝦菌落總數(shù)就已達(dá)到7.17 lg(CFU/g)，說明青蝦已不具備食用價值，而復(fù)配涂膜保鮮組青蝦在冷藏第8 天時，其菌落總數(shù)為6.81 lg(CFU/g)，仍在衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，可見該復(fù)配天然保鮮劑對青蝦冷藏過程中微生物的生長繁殖起到較好的抑制效果，有利于青蝦的冷藏保鮮。分析原因可能是由于新鮮青蝦經(jīng)過復(fù)配天然保鮮劑涂膜處理后，保鮮劑中的Nisin組分能夠有效抑制微生物的生長，再加之殼聚糖在青蝦表面形成的可食性膜可最大化地隔絕蝦體與空氣的接觸，抑制好氧微生物的生長。研究表明，鮮蝦原料中腐敗菌主要以假單胞菌、氣單胞菌、不動桿菌和黃桿菌等好氧微生物為主[26-28]，據(jù)此推斷本研究采用的復(fù)配天然保鮮劑對青蝦原料具有非常好的抑菌效果，能極大地延緩冷藏過程中青蝦的腐敗變質(zhì)速度。

圖4 4 ℃冷藏期間青蝦肌肉菌落總數(shù)的變化Fig.4 The variation of total bacterial count of M.nipponense stored at 4 ℃

2.5 冷藏過程中青蝦肌肉蛋白質(zhì)SDS-PAGE 的變化

水產(chǎn)品在冷藏保鮮過程中，受到內(nèi)源和微生物來源的蛋白酶共同作用，其肌肉蛋白質(zhì)會發(fā)生降解產(chǎn)生分子量較小的蛋白質(zhì)、肽類和氨基酸等，導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，因此，可以根據(jù)肌肉蛋白質(zhì)SDS-PAGE 中蛋白條帶的變化來判斷水產(chǎn)品的新鮮程度。圖5 所示，隨著冷藏時間的延長，對照組中肌球蛋白重鏈和副肌球蛋白條帶均逐步變細(xì)，在第5 天兩條蛋白質(zhì)條帶輪廓已不明顯，第8 天均消失。肌動蛋白和肌動蛋白輕鏈條帶在第1 天后基本看不到輪廓，原肌球蛋條帶在整個冷藏期間不斷變淺。說明在冷藏過程中，對照組青蝦肌肉大分子蛋白質(zhì)不斷降解，青蝦品質(zhì)變劣。姚潔玉等[29]對凡納濱蝦的保鮮研究也顯示同樣的結(jié)果。復(fù)配涂膜組青蝦蛋白圖譜中a、b、c、d、e 這5 條蛋白條帶在整個冷藏期間變化不明顯，說明復(fù)配保鮮劑處理能夠延緩青蝦肌肉蛋白質(zhì)降解，有利于其冷藏保鮮。陳賽等[30]研究表明，殼聚糖、茶多酚和溶菌酶的復(fù)配保鮮劑能夠維持草魚肌肉蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的穩(wěn)定性，從而延緩冷藏過程中草魚肌肉質(zhì)量的下降，本研究結(jié)果與之相似。

圖5 4 ℃冷藏期間青蝦肌肉蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 圖譜Fig.5 SDS-PAGE pattern of muscle proteins of M.nipponense stored at 4 ℃

3 結(jié)論

采用復(fù)配天然保鮮劑（殼聚糖12.5 g/L、卡拉膠1.75 g/L、迷迭香提取物0.9 g/L、Nisin 0.7 g/L）處理青蝦，并在4 ℃冷藏，青蝦的pH 值、TVB-N 值、TBARS值和菌落總數(shù)均大幅低于對照組，說明該復(fù)配天然保鮮劑能夠有效抑制青蝦冷藏過程中肌肉蛋白質(zhì)的分解、脂肪的氧化酸敗和微生物的增殖，青蝦冷藏過程中肌肉蛋白質(zhì)SDS-PAGE 結(jié)果也證明，復(fù)配天然保鮮劑有利于維持青蝦肌肉蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的穩(wěn)定性，從而延緩青蝦的腐敗變質(zhì)，保鮮效果十分明顯。本研究在證明該復(fù)配天然保鮮劑的合理性和科學(xué)性的同時，也為其他基于殼聚糖涂膜的復(fù)配天然保鮮劑開發(fā)提供研究思路和借鑒。