李 亞，蔡永軍，余沁涵，孔少連，周曉晴，張穎荷

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東湛江524088）

0 引言

柑橘潰瘍病是由柑橘黃單胞柑橘亞種(Xanthomonas citri subsp.citri)引起的一種重要檢疫性病害，是柑橘生產(chǎn)上的重要病害之一[1]。檸檬作為一種營(yíng)養(yǎng)兼藥用價(jià)值較高的保健水果，近年來(lái)深受人們的喜愛，由于柑橘潰瘍病的危害，粵西地區(qū)檸檬的產(chǎn)業(yè)發(fā)展和布局受到極大的限制。柑橘潰瘍病菌因其菌系分化復(fù)雜、發(fā)病率高、傳播途徑廣、傳染速度快、寄主范圍廣對(duì)柑橘生產(chǎn)造成巨大損失[2]。該病害可危害蕓香科數(shù)十種植物，包括橙類、柚類、檸檬等柑橘類品種，其中以甜橙、臍橙、酸橙等橙類品種最為感病[3]。感染柑橘潰瘍病的柑橘枝條、葉片和果實(shí)表面形成類似火山口狀的病斑，輕則影響柑橘樹及柑橘的外觀，引起少量的落果，重則能導(dǎo)致柑橘樹大量落葉、落果甚至枝梢枯死，尤其是果實(shí)染病后，嚴(yán)重影響果實(shí)外觀，極大降低了柑橘作為鮮食商品的價(jià)值[4]。目前對(duì)于柑橘潰瘍病的防治主要以藥劑防治為主，包括鏈霉素、四環(huán)素、中生菌、赤霉素和春雷霉素等農(nóng)用抗生素[5]。對(duì)柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的生防細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等[6]。還有各種無(wú)機(jī)和有機(jī)銅制劑包括波爾多液、氫氧化銅、硫酸銅和噻菌銅等[7-8]。但是藥劑的過多使用會(huì)增強(qiáng)潰瘍病菌對(duì)各類防控藥劑的耐藥性[9]。因此，到目前為止還沒有完全安全有效的方法對(duì)柑橘潰瘍病進(jìn)行徹底清除和防控，致使柑橘潰瘍病逐漸向非疫區(qū)蔓延，危害不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重影響了柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[10]。為了深入研究柑橘潰瘍病菌在檸檬上的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和作用機(jī)制，詳細(xì)調(diào)查研究湛江地區(qū)發(fā)展檸檬種植業(yè)的前景和風(fēng)險(xiǎn)。本文對(duì)檸檬葉片上疑似潰瘍病病菌進(jìn)行了分離鑒定，并在實(shí)驗(yàn)室條件下檢測(cè)5種常用化學(xué)藥劑對(duì)潰瘍病菌的抑制效果，從而篩選出對(duì)柑橘潰瘍病防治效果較好的防治藥劑，為今后開展柑橘潰瘍病菌的致病機(jī)制研究提供試驗(yàn)材料，也為柑橘潰瘍病的田間防治和其它農(nóng)藥復(fù)配劑的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和純化

病原材料：采自湛江市果樹所檸檬園檸檬潰瘍病病葉。

病原菌的分離：取有典型柑橘潰瘍病病斑的檸檬葉片，剪取病健交界處黃色暈圈部位小塊病組織，用75%的乙醇處理30 s后，放入3%次氯酸鈉中浸泡30 s，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次，晾干后挑取3塊約0.5×0.5mm的組織塊放入加有500 μL無(wú)菌水的無(wú)菌研缽中研磨，隨后轉(zhuǎn)入1.5 mL尖底離心管中靜置10 min。用接種環(huán)蘸取組織浸出液接種于NA固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3天，挑取具有典型潰瘍病菌黃色菌落特征的單菌落進(jìn)行2～3次純化后保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)在廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院海洋微生物實(shí)驗(yàn)室，于2018年12月—2019年12月份進(jìn)行。

1.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

1.2.1 病原菌的菌落形態(tài)及鞭毛、莢膜觀察 將純化后的病原菌接種于NA培養(yǎng)基上，48 h后觀察菌落特征。將純化的病原菌在NA試管斜面上連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，取最新純化的菌種放入28℃恒溫箱中培養(yǎng)14 h，用接種環(huán)挑取沾有冷凝水的菌體5環(huán)，移入裝有2 mL無(wú)菌水的離心管中，將其置于28℃恒溫箱中靜置10 min，待其幼齡菌鞭毛松展開，吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端，并將玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，涂片放空氣中自然干燥，用電子顯微鏡觀察莢膜和鞭毛的形態(tài)[11]。

1.2.2 病原菌的革蘭氏染色 參照革蘭氏染色試劑盒（環(huán)凱微生物革蘭氏染色液配套試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）說(shuō)明書對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色并觀察。

1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 病原菌基因組DNA提取 將分離純化后的潰瘍病菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min搖48 h后，取1.5 mL菌液提取其DNA（方法參考TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit）用于后續(xù)PCR鑒定。

1.3.2 病原菌的PCR鑒定 以提取的病原菌DNA為模板，分別用柑橘潰瘍病菌的特異性引物P8/P9[12]、JYF5/JYR5[13]、Xac01/Xac02[14-15]、GGS1F/GGS2R[16]及 27F/1492R(16S rDNA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物序列（見表1）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為96℃，5 min；95℃，45 s，55℃，30 s，72℃，60 s；35個(gè)循環(huán)，72℃，7 min。PCR完成后取5 μL產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓120 V，電泳25 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶。將目的條帶的PCR產(chǎn)物送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。

表1 柑橘潰瘍病菌分子鑒定的特異性引物

1.4 病原菌的致病性測(cè)定

將純化的病原菌在NA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48 h后，用無(wú)菌水稀釋菌懸液濃度至1×108cfu/mL[17]。選取健康檸檬葉片，采用離體葉片接種法對(duì)病原菌的致病性進(jìn)行測(cè)定，將蘸取菌液后的滅菌脫脂棉覆蓋在葉片的針刺部位，以無(wú)菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。將接種后的離體葉片置于28℃、濕度為60%、光照時(shí)間為12 h的培養(yǎng)箱中，2天后將覆蓋葉片的脫脂棉去除，葉片繼續(xù)保持28℃光照保濕培養(yǎng)，每天觀察并記錄發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則對(duì)回接發(fā)病的檸檬葉進(jìn)行病原菌的再分離、純化與鑒定，并與最初的接種菌進(jìn)行比較。

1.5 病原菌的生理生化測(cè)定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]，對(duì)病原菌的不同碳源利用等各項(xiàng)生理生化進(jìn)行鑒定。包括D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、蔗糖、蜜二糖、海藻糖、丙三醇、肌醇、核糖醇、山梨醇、D-甘露醇等的分解代謝情況，并對(duì)其淀粉水解實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶測(cè)定、氧化酶測(cè)定、明膠液化能力、甲基紅實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、V-P測(cè)定實(shí)驗(yàn)等各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.6 室內(nèi)藥劑篩選

1.6.1 供試藥劑 46%氫氧化銅水分散粒劑（美國(guó)杜邦公司）、27.12%堿式硫酸銅懸浮劑（澳大利亞紐發(fā)姆有限公司）、12%中生菌素可濕性粉劑（福建凱立生物制品有限公司）、50%氯溴異氰尿酸可溶性粉劑（江蘇克勝集團(tuán)股份有限公司）、10億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑[撒爾夫（河南）農(nóng)化有限公司]。

1.6.2 毒力測(cè)定方法 將病原菌在NA固體培養(yǎng)基上活化后，轉(zhuǎn)接NB液體培養(yǎng)基28℃振蕩培養(yǎng)24 h[19]。將菌液稀釋成1×108cfu/mL，取1 mL菌液，連同冷卻至40～50℃的NA固體培養(yǎng)基10～15 mL，一起倒入滅菌培養(yǎng)皿中，搖勻后冷卻凝固并做好標(biāo)記。用滅菌的鑷子夾取消毒的濾紙片(d=1.5 cm)分別投入各種待測(cè)藥液中，30 min后把藥液的濾紙片放置于固體培養(yǎng)基中心位置（以水作為對(duì)照），每皿3～4片，在皿底做標(biāo)記，每個(gè)處理重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)48 h后用十字交叉法測(cè)量其抑菌圈直徑，重復(fù)3次取其平均值，并按公式(1)計(jì)算抑制百分率。

其中A：抑制百分率，B：抑菌圈直徑，C：紙碟直徑。

根據(jù)菌抑制率與其所對(duì)應(yīng)的殺菌劑濃度，計(jì)算殺菌劑對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑制有效中濃度，即為EC50[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離和純化

從湛江市果樹所采集的新鮮檸檬病葉（圖1），病斑部位正反面隆起，初期呈海綿狀，感染后期病部中央破裂逐漸形成木栓化并開裂呈火山口狀，病斑周邊有黃色暈環(huán)。采用稀釋分離法分離病原菌后（圖2），挑取具有典型潰瘍病菌菌落特征的單菌落進(jìn)行純化并保存。病原菌在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，菌落呈蠟黃色，圓形，全緣，表面光滑，有光澤，微隆起，粘稠狀（圖3），將純化保存的病原菌編號(hào)為zlm1908。

圖1 健康檸檬葉片與感病檸檬葉片

圖2 病原菌的分離

圖3 病原菌的菌落形態(tài)

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 鞭毛及莢膜觀察 通過電子顯微鏡觀察，病原菌zlm1908的菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，極生單鞭毛，能游動(dòng)，有莢膜，無(wú)芽孢（圖4）。

圖4 柑橘潰瘍病菌的鞭毛及莢膜電鏡觀察

2.2.2 革蘭氏染色 病原菌zlm1908染色后用100倍油鏡觀察發(fā)現(xiàn)該病原菌呈紅色，為革蘭氏陰性菌（圖5）。

圖5 柑橘潰瘍病菌的革蘭氏染色

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用柑橘潰瘍病菌的特異性引物P8/P9、JYF5/JYR5、Xac01/Xac02和 GGS1F/GGS2R以 及 細(xì) 菌16SrDNA通用引物27F/1492R檢測(cè)所分離到的病原菌的DNA，分別得到符合預(yù)期大小的870 bp，413 bp，582 bp，760 bp和1500 bp的目的條帶（圖6）。將PCR產(chǎn)物測(cè)序后得到的序列與Genbank中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示分離物zlm1908的引物P8/P9擴(kuò)增的序列與strainXcc49相似性為99.08%，strainXcc49的登錄號(hào)為(CP023662.1)。Xac01/Xac02擴(kuò)增的序列與strainXcc49相似性為99.04%，strainXcc49的登錄號(hào)為(CP024031.1)。結(jié)合5對(duì)不同引物PCR擴(kuò)增結(jié)果表明所分離的病原菌為柑橘潰瘍病菌(Xcc)。

圖6 特異性引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 病原菌的致病性測(cè)定

檸檬葉片回接病原菌4～5天左右，刺傷部位正反面均出現(xiàn)海綿狀隆起，接種點(diǎn)周圍出現(xiàn)輕微黃色暈圈。7～9天后葉片海綿狀逐漸形成木栓化，葉片接種點(diǎn)周圍黃色暈圈更為明顯。2周后葉片上接種點(diǎn)周圍形成典型火山口狀病斑，且葉背面更為明顯，對(duì)照組不發(fā)?。▓D7A,B）。通過柯赫氏法則從接種發(fā)病病斑中重新分離病原菌，挑取與黃單胞形態(tài)相似的菌落進(jìn)行純化后得到與接種菌菌落形態(tài)極為相似的病原菌(圖7C,D)。利用柑橘潰瘍病菌的4對(duì)特異性引物P8/P9、JYF5/JYR5、Xac01/Xac02和GGS1F/GGS2R對(duì)分離純化后的接種菌進(jìn)行菌落PCR鑒定，分別得到413 bp、582 bp、760 bp和870 bp與最初接種菌完全一致的特異性目的條帶，因此可以確定從離體葉片發(fā)病部位分離出的病原菌與接種的柑橘潰瘍病菌一致。

圖7 病原菌體外致病性測(cè)定及接種菌的再分離

2.5 生理生化測(cè)定

將分離鑒定的檸檬潰瘍病菌菌株zlm1908與對(duì)照菌株生理生化結(jié)果表明：該病原菌可以利用D-果糖、蜜二糖，不能以D-半乳糖、D-甘露糖、海藻糖、蔗糖、丙三醇、核糖醇、D-甘露醇、肌醇、山梨醇等作為碳源（表2），淀粉酶（陽(yáng)性）、過氧化氫酶（陽(yáng)性）、明膠液化（陽(yáng)性）、硝酸鹽還原（陽(yáng)性）、產(chǎn)氨（陽(yáng)性）、氧化酶（陰性）、吲哚（陰性）、V-P（陰性）、甲基紅（陰性）（表2）。

表2 病原菌zlm1908生理指標(biāo)測(cè)定

表3 病原菌zlm1908生化指標(biāo)測(cè)定

2.6 供試藥劑的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明供試的5種藥劑對(duì)檸檬潰瘍病菌zlm1908都有一定的抑制效果（表4）?？莶菅挎邨U菌在低濃度時(shí)就顯示出較好的抑菌效果，當(dāng)濃度為15 g/L時(shí)，抑制率可達(dá)到59.5%，當(dāng)濃度增加到40 g/L時(shí)，抑菌率達(dá)到68%。46%氫氧化銅的抑菌效果與有效濃度密切相關(guān)，有效濃度越高，抑菌效果越好，當(dāng)有效濃度從16 g/L增加到60 g/L，抑制率從46.9%上升到79.1%。27.12%堿式硫酸銅的抑菌效果，從有效濃度為5 g/L上升到40 g/L時(shí)，抑菌率從34.8%上升到64.3%。50%氯溴異氰尿酸對(duì)該菌的抑制效果也不錯(cuò)，當(dāng)有效濃度為45 g/L時(shí)，抑菌率可達(dá)到55.9%。12%中生菌素有效濃度為25 g/L時(shí)，抑菌率就已經(jīng)達(dá)到的54.1%，但在25～60 g/L時(shí)，抑制率變化較為平緩，保持在54.1%～60.5%之間。

表4 5種殺菌劑對(duì)病原菌zlm1908的室內(nèi)毒力測(cè)定

2.7 供試藥劑對(duì)柑橘潰瘍病菌的毒力回歸方程

由供試藥劑對(duì)檸檬潰瘍病菌的毒力回歸方程可知（表5），供試藥劑濃度的對(duì)數(shù)值與抑制率的機(jī)率值間有良好的線性關(guān)系，除50%氯溴異氰尿酸PX的R2為0.97，其他4種藥劑的R2都在0.99以上。46%氫氧化銅WG、27.12%堿式硫酸銅SC、枯草芽孢桿菌WP、50%氯溴異氰尿酸PX、12%中生菌素WP的EC50值分別為18.45 g/L、14.99 g/L、5.28 g/L、32.81 g/L和14.60 g/L，從EC50的大小可以看出5種殺菌劑的毒力作用的強(qiáng)弱依次為：10億芽孢/g枯草芽孢桿菌WP＞12%中生菌素WP＞27.12%堿式硫酸銅SC＞46%氫氧化銅WG＞50%氯溴異氰尿酸PX。

表5 5種殺菌劑對(duì)病原菌zlm1908的毒力回歸方程

3 討論

檸檬屬柑橘類水果，具有獨(dú)特的風(fēng)味，富含多種維生素、類胡蘿卜素、類黃酮等生物活性成分，有生津解暑、助消化、預(yù)防心血管硬化、預(yù)防口腔潰瘍、緩解疲勞及美容養(yǎng)顏等多種功效，除直接鮮食和切片泡水外，檸檬還廣泛用于制作飲料、提取精油和入藥等，是藥食兼用的功能性水果，深受消費(fèi)者喜愛[21]。由于柑橘潰瘍病的危害，檸檬的產(chǎn)業(yè)發(fā)展和布局受到很大的限制，為了深入研究潰瘍病菌在檸檬上的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和作用機(jī)制，詳細(xì)調(diào)查研究湛江地區(qū)大力發(fā)展檸檬種植業(yè)的前景和風(fēng)險(xiǎn)，本文對(duì)檸檬葉片上疑似潰瘍病病菌進(jìn)行了分離鑒定和室內(nèi)防治藥劑篩選。本試驗(yàn)證實(shí)在所有的供試藥劑中，產(chǎn)自撒爾夫（河南）農(nóng)化有限公司的10億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對(duì)柑橘潰瘍病菌的室內(nèi)毒力作用最強(qiáng)，最高抑制率可達(dá)68%。吳明瓊等[22]在篩選柑橘潰瘍病菌拮抗細(xì)菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對(duì)潰瘍病菌都有較好的抑菌效果。Caicedo等[23]認(rèn)為枯草芽孢在植物體內(nèi)抑制柑橘潰瘍病菌的毒力作用可能與細(xì)菌附著及生物膜形成的改變有關(guān)。芽孢桿菌作為最有應(yīng)用前景的生防細(xì)菌，在黃瓜棒孢葉斑病、辣椒疫病、香蕉枯萎病等很多植物病害的防治中表現(xiàn)出良好的抑菌效果[24-26]。關(guān)于枯草芽孢桿菌的抑菌機(jī)制可能與該菌能在植物體內(nèi)及植物生長(zhǎng)的土壤中快速、大量繁衍和定植，并通過營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)有效地阻止病原微生物的繁殖，干擾植物病原微生物對(duì)植物侵染，破壞病原微生物在植物上的定殖，從而達(dá)到良好抑菌效果[27]。隨著人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和品質(zhì)要求的不斷提高，芽孢桿菌將在農(nóng)藥領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用，未來(lái)將在柑橘潰瘍病和其他病害生物防治及農(nóng)藥的安全使用和環(huán)境保護(hù)方面有著良好的應(yīng)用前景。

農(nóng)用抗生素及其衍生物也是生產(chǎn)上用來(lái)進(jìn)行柑橘潰瘍病防治的主要藥劑，主要包括鏈霉素、硫酸鏈霉素、中生菌素、土霉素、四環(huán)素等。不同農(nóng)用抗生素對(duì)柑桔潰瘍病的防治效果因使用地域不同，濃度不同、藥品生產(chǎn)廠家不同等差別較大，尤華峰等[5]進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)72%農(nóng)用鏈霉素WP對(duì)柑橘潰瘍病菌沒抑制活性，但普通的生物試劑鏈霉素、四環(huán)素稀釋32000倍以后持續(xù)抑菌期超過14天。任建國(guó)等[28]發(fā)現(xiàn)來(lái)自重慶成都3個(gè)不同廠家的72%農(nóng)用鏈霉素WP均無(wú)抑菌效果，但購(gòu)于圣豐化學(xué)（河南）有限公司的潰枯寧（有效成分10%農(nóng)用鏈霉素）1000倍稀釋液對(duì)潰瘍病菌有較強(qiáng)的抑制效果。鐘德志等[29]在浙江使用72%農(nóng)用鏈霉素WP發(fā)現(xiàn)抑菌效果非常明顯。除了鏈霉素外，其他農(nóng)用抗生素如0.3%的四霉素AS，3%中生菌素可濕性粉劑室內(nèi)測(cè)定結(jié)果顯示都對(duì)柑桔潰瘍病菌有非常強(qiáng)的抑制效果[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)12%中生菌素WP防治效果僅次于枯草芽孢桿菌，防治效率最高達(dá)60.5%。

銅制劑如堿式硫酸銅和氫氧化銅等因其具有粘附性好、毒性低等特點(diǎn)，也經(jīng)常作為藥物來(lái)抑制各類植物病原菌。有研究表明，金屬離子可作為細(xì)菌蛋白的輔基或輔助因子參與黃單胞桿菌的代謝過程，從而影響該病原菌對(duì)寄主的致病性[31-32]。Heydarpanah等[33]采用離體防治和活體接種兩種方法研究了波爾多混合物、三氯氧化銅和硫酸銅等3種銅制劑對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)波爾多混合物在柑橘潰瘍病的防控方面表現(xiàn)出很好的抑菌效果。Behlau等[34]通過不同時(shí)段噴灑不同的銅制劑探究其對(duì)Xcc的功效發(fā)現(xiàn)，在不同時(shí)間，銅對(duì)柑橘潰瘍病的影響有所差異，但總體上，柑橘潰瘍病在葉片上的發(fā)病率與銅噴霧的總量呈線性反比關(guān)系。在選用27.12%堿式硫酸銅SC、77%硫酸銅鈣WP、20%噻菌銅SC與47%春雷.王銅WP這4種藥劑對(duì)海南瓊中綠橙潰瘍病進(jìn)行田間藥效對(duì)比試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)供試的4種藥劑對(duì)潰瘍病菌的防治效果均高于70%，且春雷.王銅因具有保護(hù)和治療雙重作用，其防效優(yōu)于堿式硫酸銅，因此可在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用[35]。結(jié)合本試驗(yàn)毒力測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明27.12%堿式硫酸銅SC和46%氫氧化銅WG最高防效分別可以達(dá)到79.1%和64.3%，甚至超過枯草芽孢桿菌的最高防治效率，說(shuō)明銅制劑確實(shí)對(duì)柑橘潰瘍病菌株有良好的抑制效果，可作為防控柑橘潰瘍病的有效藥劑。至于不同的銅制劑以及不同實(shí)驗(yàn)中相同的銅制劑表現(xiàn)出的防治效率的差異可能跟與菌株的致病性、菌株所處的環(huán)境、試驗(yàn)條件、或農(nóng)藥生產(chǎn)廠家及農(nóng)藥制作工藝等不同有關(guān)。氯溴異氰尿酸在植物表面釋放的酸類物質(zhì)對(duì)病原菌有一定的抑制作用且對(duì)植物和環(huán)境危害較小，因此該類藥劑可以用在病害初期來(lái)預(yù)防和控制柑橘潰瘍病。據(jù)報(bào)道，在選用50%氯溴異氰尿酸防治柑橘潰瘍病時(shí)發(fā)現(xiàn)該藥劑對(duì)潰瘍病菌有良好的防控作用，其防效最高可達(dá)66.6%[36]。本試驗(yàn)在選用50%氯溴異氰尿酸抑制潰瘍病菌的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該藥劑雖然是所選5種藥劑中抑制效果最弱的，但最高的防治效率仍然可以達(dá)到55.9%。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明從疑似柑橘潰瘍病病斑的檸檬病葉上所分離到的菌株zlm1908，通過對(duì)其形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)測(cè)定和分子生物學(xué)鑒定其為柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種(Xcc)，是引起湛江地區(qū)檸檬上產(chǎn)生柑橘潰瘍病病斑的病原菌。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明供試的5種藥劑對(duì)檸檬潰瘍病菌zlm1908都有一定的抑制效果，從EC50的大小可以看出5種殺菌劑的毒力作用的強(qiáng)弱依次為：10億芽孢/g枯草芽孢桿菌WP，12%中生菌素WP，27.12%堿式硫酸銅SC，46%氫氧化銅WG和50%氯溴異氰尿酸PX。由此可見不同的化學(xué)藥劑在一定程度上對(duì)柑橘潰瘍病菌都有一定的抑制效果，但無(wú)論是生防菌、抗生素還是化學(xué)藥劑在室內(nèi)毒力測(cè)定中EC50都相當(dāng)高，最高防治效率除50%氯溴異氰尿酸外均超過60%。但實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)供試藥劑的防治效率都跟藥品的使用濃度呈正相關(guān)，當(dāng)供試藥劑的濃度設(shè)置較低時(shí)，對(duì)柑橘潰瘍病菌菌株zlm1908的抑制效果不明顯，因此推測(cè)在田間試驗(yàn)中，在環(huán)境條件要求的濃度范圍內(nèi)使用時(shí)，這5種藥劑對(duì)柑橘潰瘍病的實(shí)際防治效果應(yīng)該不理想。雖然室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果可以直接為田間用藥提供理論參考，但是室內(nèi)毒力測(cè)定畢竟是離體情況下測(cè)定殺菌劑對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑制作用，不能等同于大田實(shí)際防治效果，大田使用時(shí)會(huì)因?yàn)椴≡鷿舛炔町?、寄主植物的作用、田間氣候、藥劑的附著及滲透力等因素而表現(xiàn)出與室內(nèi)不同的作用效果，因此這5種藥劑在田間對(duì)柑橘潰瘍病的防治效果，還需要通過進(jìn)一步的田間實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。