左文娜，朱 虹，金愛燕

(河北省滄州市中心醫(yī)院 耳鼻喉科，河北 滄州 061001)

鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽黏膜上的惡性腫瘤，是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病年齡大多數(shù)集中在中年人[1]。主要病因與遺傳因素、病毒感染、環(huán)境因素、種族的易感性和免疫因素相關(guān)[2]。該病地域性分布特點明顯，集中發(fā)生在我國的南方地區(qū)廣東和廣西兩個省，常見的臨床癥狀有聽力降低、鼻塞、頭痛和頸部淋巴結(jié)腫大等[3]。鼻咽癌的惡性程度較高，主要采用放射治療、手術(shù)治療、化療治療、免疫治療和中藥治療為主要手段[4]。雖然在治療方面上有了很大的改進(jìn)，但是鼻咽癌復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍然比較高，因此探尋新的分子標(biāo)志，提高鼻咽癌的早期診斷、指導(dǎo)鼻咽癌的治療以及改善鼻咽癌的治療效果具有非常重要的作用。miRNAs是一類高度保守的非編碼基因家族，在人類的多種疾病中表達(dá)升高或降低，參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展，尤其是在腫瘤中發(fā)揮的作用越來越受到關(guān)注[5]。miR-155位于人類21號染色體上，相關(guān)研究表明，miR-155乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌等常見的癌癥中表達(dá)上調(diào)，也在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[6]。卵泡抑素樣蛋白1 (FSTL1)屬于分泌性細(xì)胞外糖蛋白，在細(xì)胞分化和組織損傷中起著重要作用[7]。miR-155和FSTL1基因在鼻咽癌中都出現(xiàn)過相關(guān)報道，但miR-155誘導(dǎo)FSTL1基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞的相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚，因此本研究探討miR-155誘導(dǎo)FSTL1基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞的增殖、凋亡和免疫逃避的作用，以其為鼻咽癌的治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69、鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z購自于中國上海市的吉凱基因化學(xué)公司；miR-155 minics、miR-155 inhibitor上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自合肥Biosharp生物公司； FSTL1、C-caspase3、Bax、 Bcl-2一抗購自于美國Gibco公司；DAB顯色試劑盒購自于南京諾唯贊生物科技有限公司；Trizol試劑購自美國Thereto公司；Annexin V-FITC/PI雙染料購自于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69放在12%的胎牛血清RPMI-1640的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z細(xì)胞放在10%的胎牛血清RPMI-1640的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入1%的青霉素和鏈霉素，放于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液。進(jìn)行細(xì)胞傳代處理，吸出原培養(yǎng)基，PBS充分淋洗，0.25%胰酶消化，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，待細(xì)胞變圓輕拍掉壁時，終止消化，取對數(shù)生長期的CNE2Z細(xì)胞進(jìn)行實驗。轉(zhuǎn)染時共計分3組，分為miR-155 minics組、miR-155 inhibitor組和NC組，將 1瓶25cm2鼻咽上皮細(xì)胞CNE2Z平均分入6孔板中，通過Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染miR-155 minics、miR-155 inhibitor和NC，按照說明書的要求進(jìn)行實驗。

1.3 qRT-PCR檢測miR-155和FSTL1的表達(dá) 取對數(shù)生長期的鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z細(xì)胞放入Trizol細(xì)胞裂解液，提取RNA,采用Biodrop uLITE分光光度計進(jìn)行RNA濃度的測定，按照RNA濃度計算1 μg RNA所需的體積，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用熒光定量PCR檢測試劑盒，反應(yīng)體系：miR-155 mRNA上游5'-ACATTGATTATACGTGCTCGG-3'，下游5'-GCTCGGCCGAAGTTTAG-3'；FSTL1 mRNA上游5'-GTTGCGTTATCTACG-3'，下游5'-TGTTGCGTAATCTACGAT-3'；U6作為內(nèi)參，引物序列為上游5'-AGTTGCGAATCTACCTACA-3'，下游5'-GATTGCGTCTACCAGTG-3',反應(yīng)條件為93 ℃，6 min、92 ℃退火30 s、62 ℃延伸20 s，45個循環(huán)，用相對定量2-ΔΔCT計算各組鼻咽癌上皮細(xì)胞系中miR-155和FSTL1 mRNA水平。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 使用CCK-8試劑盒檢測鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE2Z的增殖情況，CNE2Z細(xì)胞以1×103個/孔接種在96孔板中，轉(zhuǎn)染miR-155 minics、miR-155 inhibitor和NC，分別在24、48、72、96 h將CCK-8溶液添加到每個孔中，37 ℃下孵育1 h，記錄450 nm的吸光度(OD)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)實驗檢測細(xì)胞凋亡 常規(guī)消化，收集完整細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞的密度為1.5×105個/mL，加入到6孔板中，12 h后加入轉(zhuǎn)染試劑，進(jìn)行離心處理，3 000 r/min，離心10 min，離心半徑為9 cm，離心后，棄去上清，重懸細(xì)胞，加入熒光染料Annexin V-FITC/PI雙染色染料，上流式細(xì)胞儀的檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析熒光值。

1.6 Western blot檢測 鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE2Z預(yù)冷，PBS沖洗3次，加入300 μL RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，置于1.5mL離心管內(nèi)，進(jìn)行離心處理，參照BCA蛋白濃度測試試劑盒測蛋白濃度，采用酶標(biāo)儀確定蛋白質(zhì)樣本的濃度，SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜，取出PVDF膜，TBST洗滌，添加一抗FSTL1(稀釋比例1∶500)、C-caspase3(稀釋比例1∶500)、Bax(稀釋比例1∶500)、Bcl-2(稀釋比例1∶500)蛋白，GAPDH(稀釋比例1∶1 000)為內(nèi)參，孵育一抗過后12h，取出PVDF膜，孵育二抗(1∶1 000)。構(gòu)建pcDNA3.1-FSTL1表達(dá)載體和pcDNA3.1空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE2Z轉(zhuǎn)染中，分別為FSTL1組和對照組，按照上述方式檢測ITCH(稀釋比例1∶500)和MAVS蛋白(稀釋比例1∶500)，上機(jī)檢測，覆蓋新鮮ECL工作液，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光顯影。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗 使用IFNγ ELISA試劑盒檢測IFNγ水平，按照制造商的使用說明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 miR-155和FSTL1在鼻咽上皮細(xì)胞和鼻咽癌上皮細(xì)胞中的表達(dá) 人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69、鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z中miR-155 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.01±0.03、3.42±0.33、3.37±0.34、3.19±0.24、2.78±0.19和2.34±0.21，與人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69相比，鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z中miR-155 mRNA表達(dá)量明顯升高(P均<0.05)；人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69、鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z中FSTL1 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.00±0.01、0.17±0.02、0.26±0.04、0.28±0.05、0.32±0.07和0.39±0.06，與人正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69相比，鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE1、CNE2、HONE1、HK-1和CNE2Z中FSTL1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P均<0.05)，CNE2Z中FSTL1 mRNA表達(dá)量最高，所以選擇鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE2Z進(jìn)行后續(xù)的實驗。

2.2 miR-155對鼻咽癌上皮細(xì)胞CNE2Z增殖的影響 與NC組相比，miR-155 inhibitor組細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，與miR-155 inhibitor組相比，miR-155 minics組細(xì)胞增殖能力顯著上升(P<0.05，見表1，圖1)。

表1 miR-155對鼻咽癌上皮細(xì)胞增殖的影響

*：與NC組相比， P<0.05；#：與miR-155 minics組相比，P<0.05。圖1 miR-155對鼻咽癌上皮細(xì)胞增殖的影響

2.3 miR-155對鼻咽癌上皮細(xì)胞凋亡的影響 NC組、miR-155 minics組和miR-155 inhibitor組細(xì)胞凋亡率分別為(14.19±2.07)%、(6.27±0.94)%和(27.53±4.75)%，miR-155 inhibitor組細(xì)胞凋亡率顯著高于與NC組(P<0.05)，miR-155 minics組細(xì)胞凋亡率明顯低于miR-155 inhibitor組(P<0.05，見圖2)。

2.4 miR-155對FSTL1、C-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白的影響 miR-155 inhibitor組FSTL1蛋白水平明顯高于NC組(P<0.05)，miR-155 minics組FSTL1蛋白水平顯著低于miR-155 inhibitor組(P<0.05)；miR-155 inhibitor組C-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平明顯低于NC組(P<0.05)，miR-155 minics組C-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平顯著高于miR-155 inhibitor組(P<0.05，見表2，圖3)。

A：NC；B：miR-155 minics；C：miR-155 inhibitor。圖2 miR-155對鼻咽癌上皮細(xì)胞凋亡的影響

表2 miR-155對FSTL1、C-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白的影響

圖3 miR-155對FSTL1、C-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白的影響

2.5 FSTL1的表達(dá)對免疫功能的影響 對照組和FSTL1組中的ITCH蛋白表達(dá)分別為3.46±0.69和1.22±0.37，F(xiàn)STL1組中ITCH蛋白表達(dá)顯著低于對照組(P<0.05)；對照組和FSTL1組中的MAVS蛋白表達(dá)分別為1.06±0.21和2.75±0.48，F(xiàn)STL1組中MAVS蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05)；對照組和FSTL1組中IFNγ水平分別為(25.79±7.84)ng/mL和(136.19±22.63)ng/mL，F(xiàn)STL1組中IFNγ水平明顯高于對照組(P<0.05，見圖4)。

圖4 ITCH、MAVS和IFNγ蛋白的表達(dá)

3 討論

鼻咽癌是鼻咽部上皮組織的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率位于頭頸部惡性腫瘤之首[8]。目前認(rèn)為鼻咽癌的發(fā)病原因可能與遺傳因素、環(huán)境因素以及病毒因素具有一定的關(guān)系[9]，但鼻咽癌病理至今尚無定論。鼻咽周圍遍布重要器官和神經(jīng)，因為該病具有解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，所以鼻咽癌發(fā)生局部浸潤生長就不宜進(jìn)行手術(shù)治療[10]。目前對于鼻咽癌的治療，臨床仍然首先為放療，其次是化療。新型生物的治療在鼻咽癌治療方面發(fā)揮著重要作用，以放療為主的綜合治療是局部中晚期鼻咽癌比較標(biāo)準(zhǔn)的治療手段[11]，盡管隨著醫(yī)療水平的不斷進(jìn)步，放療技術(shù)雖然有了突出性改變，但鼻咽癌的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率依舊是臨床上面臨的嚴(yán)峻問題。

miRNA屬于非編碼RNA，在各種生物學(xué)行中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。miRNAs是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程中的關(guān)鍵基因，包括鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、胃癌等多種癌癥細(xì)胞的周期、增殖、侵襲的過程中發(fā)揮著主要作用[12]。相關(guān)研究表明，miR-106b和miR-17等與鼻咽癌的預(yù)后密切相關(guān)[13-14]。也有研究報道，MiR-20b-5p與前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、大腸癌多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)[15]?；诖?，本研究探討miR-155對鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用，以及與FSTL1基因的相關(guān)性和對免疫逃避的作用。本研究結(jié)果顯示，miR-155 mRNA在正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69中低表達(dá)，在鼻咽癌上皮細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)；FSTL1 mRNA在正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69中高表達(dá)，在鼻咽癌上皮細(xì)胞系中呈現(xiàn)低表達(dá)。通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155表達(dá)，鼻咽上皮細(xì)胞增殖能力顯著降低，過表達(dá)miR-155，鼻咽上皮細(xì)胞增殖能力明顯上升。為了進(jìn)一步驗證miR-155在鼻咽上皮細(xì)胞的作用，我們進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測鼻咽上皮細(xì)胞的凋亡能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155表達(dá)，鼻咽上皮細(xì)胞的凋亡能力明顯增加，過表達(dá)miR-155，鼻咽上皮細(xì)胞凋亡能力顯著降低，說明miR-155通過調(diào)控鼻咽上皮細(xì)胞增殖和凋亡來影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。相關(guān)研究顯示，miR-155在人鼻咽癌組織與細(xì)胞中高表達(dá)，抑制其表達(dá)，可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖，其對于鼻咽癌的治療具有重要意義[16]，與本研究結(jié)果類似。

FSTL1基因?qū)儆赟PARC家族蛋白，是由基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞表達(dá)分泌，可以主動調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，發(fā)揮著促進(jìn)或者抑制炎癥的作用[17]。許多腫瘤都是由于慢性炎癥刺激引起的，腫瘤的炎癥微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長、增殖、侵襲和遷移的主要因素[18]。同時，許多先天免疫系統(tǒng)的信號分子也是被腫瘤細(xì)胞招募的，所以推測FSTL1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著抑癌或者促癌的作用。為了進(jìn)一步驗證miR-155與FSTL1的相關(guān)性，本研究通過雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-155野生型FSTL1基因的熒光素酶活性明顯增強(qiáng)；且抑制miR-155的表達(dá)，F(xiàn)STL1蛋白水平明顯升高，C-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平明顯降低。過表達(dá)miR-155， FSTL1蛋白水平顯著降低，C-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平明顯升高。所以說，miR-155可能通過靶向FSTL1基因發(fā)揮著對鼻咽癌細(xì)胞的增殖、凋亡作用。相關(guān)研究報道，miR-155通過靶向PTEN-PI3 KAKT信號通路，發(fā)揮促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖以及抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用，為治療鼻咽癌提供新的靶點[19]。

在腫瘤的發(fā)展過程中，宿主免疫系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞相互影響，相互制約。在正常生理狀態(tài)下，宿主免疫系統(tǒng)起著免疫監(jiān)控的作用，能夠識別腫瘤細(xì)胞的非己抗原，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抑制腫瘤細(xì)胞，從而阻止腫瘤的發(fā)展。于此同時，腫瘤也可以通過多種路徑逃避機(jī)體的免疫監(jiān)控作用，使腫瘤細(xì)胞得以繁衍和發(fā)展，即發(fā)生腫瘤的免疫逃避現(xiàn)象[20]。腫瘤免疫治療目前發(fā)展比較迅速，相關(guān)研究表明，鼻咽癌可通過下調(diào)FSTL1蛋白的旁分泌抑制巨噬細(xì)胞的免疫功能，從而使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫細(xì)胞殺傷作用[21]。免疫系統(tǒng)在殺傷有害物質(zhì)的同時，也需要保證正常的細(xì)胞不受侵害，所以機(jī)體必須保持動態(tài)的免疫平衡，預(yù)防疾病的發(fā)生。ITCH通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞內(nèi)信號通路誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受[22]，相關(guān)研究表明，沉默ITCH基因表達(dá),促進(jìn)T細(xì)胞免疫活性,增強(qiáng)T細(xì)胞對小鼠肺腺癌細(xì)胞 LA795 的體外免疫殺傷效率[23]。MAVS 通過核基因組進(jìn)行編碼，在抗病毒免疫通路中扮演不同的角色，為了維持抗病毒天然免疫的平衡，MAVS 在病毒感染的后期會逐漸降解[24]。IFNγ是Th1 細(xì)胞的代表因子,具有干擾病毒復(fù)制的作用[25]。本研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)FSTL1后的鼻咽癌細(xì)胞中ITCH蛋白表達(dá)明顯降低，MAVS蛋白表達(dá)和IFNγ水平的表達(dá)顯著升高。

綜上所述，抑制miR-155表達(dá)能夠降低鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，miR-155可能通過誘導(dǎo)FSTL1基因參與鼻咽癌的調(diào)控，同時通過誘導(dǎo)FSTL1基因，降低鼻咽癌細(xì)胞中ITCH表達(dá)，增加MAVS和IFNγ表達(dá)量，達(dá)到機(jī)體內(nèi)動態(tài)的免疫平衡。