楊 麗，蔣成素，韓 磊，肖雁冰

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院 婦科，貴州 遵義 563000)

左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)(Levonorgestrel intrauterine system，LNG-IUS，商品名：曼月樂(lè))被廣泛應(yīng)用于臨床中，但在長(zhǎng)期臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)曼月樂(lè)存在一些不足之處，如環(huán)下移、脫落等現(xiàn)象明顯，一旦環(huán)脫落或縱管內(nèi)的LNG釋放殆盡或明顯衰減后，其治療效果將受到影響甚至沒(méi)有效果，且價(jià)格昂貴。因此，課題組提出研制一種兼具曼月樂(lè)避孕及治療作用，又能克服其不足之處的新型宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)的設(shè)想。前期實(shí)驗(yàn)自制并研究了“鈦鎳記憶合金納米銅硅膠左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)”，簡(jiǎn)稱“記憶合金硅膠宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)”(Memory alloy silicone intrauterine system,MAS-IUS)在無(wú)水乙醇中左炔諾孕酮(Levonorgestrel，LNG)的釋放規(guī)律，發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)問(wèn)題：①LNG釋放穩(wěn)定性欠佳；②LNG單日釋放量較大，難以滿足后續(xù)研究需求。分析原因可能在于MAS-IUS外膜為手工制作和使用無(wú)水乙醇作為實(shí)驗(yàn)溶劑導(dǎo)致了上述現(xiàn)象的發(fā)生[1]。因此，本研究擬采用前期實(shí)驗(yàn)得出理想的制環(huán)參數(shù)、按IUS標(biāo)準(zhǔn)化制作工藝流程制備新型“MAS-IUS優(yōu)化品”，并探究該優(yōu)化品中LNG在模擬宮腔液中的釋放規(guī)律，以期為研制出LNG釋放量理想且穩(wěn)定的宮內(nèi)藥物緩釋系統(tǒng)積累經(jīng)驗(yàn)，研究取得了預(yù)期效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 甲、乙兩種組分的室溫硫化硅膠(東莞市國(guó)創(chuàng)有機(jī)硅膠有限公司)；納米銅(粒徑72 nm，昆山德陽(yáng)新材料科技有限公司)；左炔諾孕酮標(biāo)準(zhǔn)品(北京索來(lái)寶科技有限公司，SL881 0.5 g)；硅膠粘合劑(美國(guó)道康寧公司，型號(hào)QIS -5708)；去離子水；NaCl(重慶江川化工(集團(tuán))有限公司)；KCl(福晨(天津)試劑有限公司)；CaCl2(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；NaHCO3(上海埃彼化學(xué)試劑有限公司)；NaH2PO4·2H2O(隴化工股份有限公司)；葡萄糖(湖南科倫制藥有限公司)。

1.1.2 儀器 雙輥開(kāi)煉機(jī)(東莞市寶品精密儀器有限公司，型號(hào)BP-8175-A)；恒溫循環(huán)水浴箱(江蘇天力醫(yī)療器械有限公司，型號(hào) TL-420型)；超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(UPLC-MS/MS，由Water Acquity超高液相和Applied Biosystems sicex 5500三重四級(jí)桿性離子阱質(zhì)譜儀組成)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 37 ℃超彈性記憶鈦鎳合金絲管架的制備 由蘇州榮千稀有金屬有限公司按本實(shí)驗(yàn)制環(huán)參數(shù)利用特定膜具制成外徑為3 mm的具有超彈性能的鈦鎳合金絲管架，在280 ℃高溫環(huán)境定型30 min 后脫模制成37 ℃記憶鈦鎳合金絲管架，制成本實(shí)驗(yàn)所需規(guī)格：長(zhǎng)度45 mm、內(nèi)徑2.7 mm、外徑3 mm。

1.2.2 硅橡膠的準(zhǔn)備 甲組硅橡膠：甲基乙酰硅橡膠(含鉑催化劑)485 g，納米銅粉15 g，雙輥開(kāi)煉機(jī)混煉15次；乙組硅橡膠：甲基乙酰硅橡膠(含氧硅油)485 g，納米銅粉15 g，雙輥開(kāi)煉機(jī)混煉15次；甲乙組混合硅橡膠：分別取甲組、乙組硅橡膠各200 g，用雙輥開(kāi)煉機(jī)混煉至充分混勻。

1.2.3 含納米銅硅膠模的MAS-IUS優(yōu)化品的制備 ①將混合后的硅橡膠(甲乙組混合物)放入擠出機(jī)，調(diào)整口模(口模外徑3.5 mm)和引芯位置，均勻擠出套管，確保擠出套管雙層壁厚為1.0 mm。套管經(jīng)6 m烘道加熱固定成型(烘道溫度280℃)，再將固定成型的套管放入恒溫烘箱中，經(jīng)180 ℃、2 h硫化，硫化后，裁切成本實(shí)驗(yàn)所需規(guī)格。②裝入鈦鎳合金絲管架：將套管放入正己烷中，浸泡1～2 min，使套管充分漲開(kāi)，用鑷子將鈦鎳合金絲管架裝入套管中，待正己烷揮發(fā)結(jié)束后，鈦鎳合金絲管架與套管充分貼合。③裝藥；用硅膠粘合劑將套管一端封口，待粘合劑靜置2～3 h后，粘合劑充分固化，將左炔諾孕酮標(biāo)準(zhǔn)品(52 mg)用增量法裝入套管中，用硅膠粘合劑將另一端(加藥端)進(jìn)行封口，待粘合劑靜置2～3 h后，粘合劑充分固化，將兩端裁切成所需規(guī)格，即制得納米銅硅膠膜厚度為1 mm、銅離子濃度為3.0 g/L、內(nèi)含有52 mg左炔諾孕酮標(biāo)準(zhǔn)品的MAS-IUS優(yōu)化品模型。

1.2.4 配制模擬宮腔液 按表1比例配制模擬宮腔液(g/L)[2]：以HCl或NaOH將配制溶液pH調(diào)至6.8～7.4(人體宮腔液pH6.0～7.9)后保存?zhèn)溆?，?chǔ)存條件為2～8 ℃。

表1 標(biāo)準(zhǔn)模擬宮腔液配制比例

1.2.5 MAS-LUS優(yōu)化品中LNG的釋放試驗(yàn) 將MAS-IUS優(yōu)化品充分洗滌后放入15 mL聚丙烯管中，隨機(jī)分為兩組，試驗(yàn)組加入7.5 mL模擬宮腔液(全面淹沒(méi)MAS-IUS)，對(duì)照組加入7.5 mL生理鹽水，每組5個(gè)樣品；將上述樣品放置于搖床在37℃溫箱孵育；每24小時(shí)取樣1次(1 mL)，連續(xù)31 d，每次取完樣品后，將剩余樣品溶液更換，試驗(yàn)組重新加入7.5 mL模擬宮腔液，對(duì)照組重新加入7.5 mL生理鹽水；取出樣品溶液儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.6 LNG釋放量的測(cè)定 (1)超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)分析條件由Waters Acquity超高效液相和Applied Biosystems Sciex5 500三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀組成。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm 2.1×100 mm Column；流動(dòng)相A：含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B：100%甲醇；柱溫相：Waters Acquity column heater；柱溫相溫度：25 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：10 mL；LQC 0.3 ng/mL，HQC:80 ng/mL。(2)將各樣品溶液解凍，渦旋混勻，取200 μL到2 mL離心管中，加入1 600 μL提取試劑(甲基叔丁基醚：正己烷1∶1)，先振蕩15 min，再于8 ℃、12 000 r/min下離心5 min；取約200 μL上清液轉(zhuǎn)移到96孔板中，于40 ℃下吹干，加入150 μL含有50%甲醇的水溶液，振蕩5 min，在8 ℃條件下進(jìn)樣，用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)上述樣品中左炔諾孕酮的濃度。

2 結(jié)果

2.1 MAS-IUS優(yōu)化品的制備 以具有超彈性能的鈦鎳合金絲盤(pán)旋成一定管徑的合金絲管架，納米銅硅膠混合物為包膜封閉管架外壁形成管腔，其中納米銅膜厚度為1 mm、膜中銅離子濃度為3.0 g/L，將質(zhì)量為52 mg的左炔諾孕酮置于管腔中，按IUS標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝流程制備出了長(zhǎng)度45 mm、內(nèi)徑2.7 mm、外徑3 mm的MAS-IUS優(yōu)化品(見(jiàn)圖1)。

MAS-IUS優(yōu)化品長(zhǎng)度為45 mm。 圖1 按IUS標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝流程制備的新型MAS-IUS優(yōu)化品

2.2 MAS-IUS優(yōu)化品在生理鹽水中LNG的釋放規(guī)律 生理鹽水組各樣品中LNG釋放量如圖2所示。采用重復(fù)設(shè)計(jì)方差分析探究不同時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組中LNG釋放量是否有差異(見(jiàn)表2)，結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)LNG釋放量有顯著性差異(P<0.001)；采用分段線性回歸方法探究15 d前釋放規(guī)律以及15 d后釋放規(guī)律，結(jié)果如表3、4所示。由表3結(jié)果可知：生理鹽水組15 d前LNG釋放量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，孵育時(shí)間的回歸系數(shù)值為-0.058，意味著孵育時(shí)間(d)會(huì)對(duì)左炔諾孕酮釋放量(μg/24 h)產(chǎn)生顯著的負(fù)向影響關(guān)系，孵育時(shí)間每增加1 d，LNG釋放量減少0.058 μg，其釋放模型公式為：LR(μg/24 h)=2.550-0.058×T(時(shí)間)；由表4結(jié)果可以知道，15 d后生理鹽水中LNG釋放量隨時(shí)間變化無(wú)明顯變化(P>0.05)，LNG釋放量逐漸趨于恒定，平均釋放量為1.900±0.110(μg/24 h)。

圖2 MAS-IUS優(yōu)化品在生理鹽水中LNG的釋放量(μg/24 h)

表2 生理鹽水組左炔諾孕酮整體釋放量差異性分析

表3 生理鹽水組15 d前LNG釋放量回歸分析(μg/24 h)

表4 生理鹽水組15 d后LNG釋放量回歸分析(μg/24 h)

2.3 MAS-IUS優(yōu)化品在模擬宮腔液中LNG的釋放規(guī)律 模擬宮腔液組各樣品中LNG釋放量如圖3所示。采用重復(fù)設(shè)計(jì)方差分析探究不同時(shí)間點(diǎn)模擬宮腔液組中LNG釋放量是否有差異(如表5所示)，結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)LNG釋放量有顯著性差異(P<0.001)；由圖3看出，LNG釋放量為非線性回歸，而在15 d處為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，為了探究其釋放規(guī)律，采用分段線性回歸探究15 d前釋放規(guī)律以及15 d后釋放規(guī)律，結(jié)果如表6、7所示。表6結(jié)果顯示：模擬宮腔液組15 d前回歸分析結(jié)果顯示LNG釋放量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，孵育時(shí)間的回歸系數(shù)值為-0.083，意味著孵育時(shí)間(d)對(duì)LNG釋放量(μg/24 h)產(chǎn)生顯著的負(fù)向影響關(guān)系，孵育時(shí)間每增加1 d，LNG釋放量減少0.083 μg，其15 d前釋放模型公式為：LR(μg/24 h)=3.359-0.083×T(時(shí)間)；由表7結(jié)果顯示模擬宮腔液組15 d后的釋放量隨時(shí)間變化沒(méi)有顯著變化(P>0.05)，表明15 d后LNG釋放量基本是恒定的，每24小時(shí)平均釋放量為2.440±0.110(μg/24 h)，藥物釋放基本符合零級(jí)釋放規(guī)律。

圖3 MAS-IUS優(yōu)化品在模擬宮腔液中LNG的釋放量(μg/24 h)

表5 模擬宮腔液組LNG釋放量整體差異性分析

表6 模擬宮腔液組15 d前LNG釋放量回歸分析(μg/24 h)

表7 模擬宮腔液組15 d后LNG釋放量回歸分析(μg/24 h)

2.4 MAS-IUS優(yōu)化品在模擬宮腔液和生理鹽水中LNG釋放量的比較 將模擬宮腔液組和生理鹽水組中LNG平均釋放量的進(jìn)行差異性比較，兩組平均釋放量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表8)。

表8 模擬宮腔液組和生理鹽水組中LNG平均釋放量差異性比較(μg/24 h)

圖4是模擬宮腔液組與生理鹽水組平均釋放量整體性比較，從圖4及表10的均數(shù)上來(lái)看，模擬宮腔液組的平均釋放量(2.560 g/24 h )明顯高于生理鹽水組(1.990 g/24 h)。

圖4 MAS-IUS優(yōu)化品在模擬宮腔液和生理鹽水中LNG平均釋放量(μg/24 h)

3 討論

3.1 MAS-IUS優(yōu)化品理化性能 課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，以納米銅膜厚度為1 mm、膜中銅離子濃度為3.0g/L為制環(huán)參數(shù)，按IUS標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝流程制備出的MAS-IUS優(yōu)化品，其拉伸強(qiáng)度達(dá)到5.96 mPa，扯斷伸長(zhǎng)率156% ，邵氏A硬度58，撕裂強(qiáng)度為18 kN/m，綜合力學(xué)性能達(dá)到由國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布的《無(wú)源外科植入物通用要求》的標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，其熱穩(wěn)定性[5]、力學(xué)性能[6]、吸水性能都達(dá)到了理想醫(yī)用材料標(biāo)準(zhǔn)[7]。

3.2 MAS-IUS優(yōu)化品中LNG釋放規(guī)律 本研究結(jié)果提示，MAS-IUS優(yōu)化品在模擬宮腔液中呈現(xiàn)一種時(shí)間依賴的濃度穩(wěn)定的現(xiàn)象，LNG釋放量15d以前隨時(shí)間變化逐漸下降，15d以后釋放量基本恒定，其釋放模式符合零級(jí)釋放規(guī)律。

課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MAS-IUS在無(wú)水乙醇中LNG釋放穩(wěn)定性欠佳且單日釋放量較大(LNG平均釋放量為243.10±38.000μg/24h)，分析原因可能在于MAS-IUS外膜為純手工制作，其厚度與均一性在制環(huán)過(guò)程中有明顯差異，故實(shí)驗(yàn)誤差較大導(dǎo)致釋放量不穩(wěn)定；再者，前期實(shí)驗(yàn)溶媒介質(zhì)為無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇為有機(jī)溶劑，與MAS-IUS的硅膠外膜和管中的LNG有極好的相容性，與模擬宮腔液相比，溶解度大得多，理論上推測(cè)加速了LNG的釋放，故導(dǎo)致了上述現(xiàn)象的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)LNG釋放量與前期實(shí)驗(yàn)相比，模擬宮腔液體中LNG釋放量(2.560±0.340)μg/24 h較前明顯下降，可能原因?yàn)椋罕緦?shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)溶劑為模擬宮腔液，較無(wú)水乙醇溶解度小，故減小了其釋放量及釋放速率；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)LNG釋放量較穩(wěn)定且波動(dòng)范圍小，分析可能與本實(shí)驗(yàn)采用的是現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)IUS生產(chǎn)工藝流程制備MAS-IUS優(yōu)化品，減少了因制環(huán)過(guò)程均一性不一導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差有關(guān)，加之本實(shí)驗(yàn)封堵了納米銅硅膠膜兩端端口，減少了LNG從管腔兩側(cè)端口釋放，故LNG釋放量較前明顯下降。

此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MAS-IUS與左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)中LNG釋放量(釋放量為20 ug/24 h)相比要小得多。分析可能原因?yàn)椋耗M宮腔液與實(shí)際人體宮腔液具有差異性[8-10]，人體宮腔液含有各種有機(jī)物及酶，加上生理動(dòng)態(tài)變化，可能會(huì)加快LNG在宮腔液的釋放,且MAS-IUS的釋藥機(jī)理屬于膜控制釋放[5]，同時(shí)，猜測(cè)MAS-IUS中左炔諾孕酮含量也會(huì)影響其釋放，故各種因素綜合導(dǎo)致上述現(xiàn)象發(fā)生，后續(xù)需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。研究提示，LNG在初期釋放濃度較大，在一定時(shí)間后保持藥物釋放相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，這與課題組另一相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致[11]；而藥物治療疾病是否有效與“有效藥物濃度”[12-13]及藥物“持續(xù)作用時(shí)間”有關(guān)[14-15]。MAS-IUS優(yōu)化品的納米銅硅膠膜控釋系統(tǒng)可確?；颊唧w內(nèi)有相對(duì)恒定的藥物濃度,降低患者用藥次數(shù),延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間,故可保證患者用藥效果，達(dá)到治療效果。

本實(shí)驗(yàn)LNG釋放量前期釋放為非恒定釋放，初期釋放速率較快，15d以后逐漸下降且平穩(wěn)釋放，其釋放過(guò)程基本符合零級(jí)釋放規(guī)律，分析原因可能為：溶液前期儲(chǔ)存在硅膠膜里的納米銅還未釋放，后期納米銅釋放后使得溶液及硅膠膜表面附有銅離子，納米銅的控釋作用使得藥物控釋效果明顯提高；再者猜測(cè)實(shí)驗(yàn)初期納米銅硅膠膜由于裝藥過(guò)程中藥物粉末不慎附著于納米銅硅膠膜表面可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后期經(jīng)反復(fù)更換液體后將表面殘留藥物完全沖洗干凈后，后期藥物釋放表現(xiàn)為恒定釋放；同時(shí)猜測(cè)可能與MAS-IUS加工工藝、LNG的載藥量、溫度、介質(zhì)等多種因素有關(guān)[16]，后期課題組將繼續(xù)優(yōu)化MAS-IUS模型及探索釋放條件及其釋放規(guī)律，以期制得恒定釋放的MAU-IUS優(yōu)化品，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3.3 MAS-IUS優(yōu)化品的改進(jìn)與展望 本實(shí)驗(yàn)中初步制備的MAS-IUS優(yōu)化品外觀模型未達(dá)到理想的宮內(nèi)節(jié)育器IUD外形，后續(xù)的研究中需要進(jìn)一步完善其外形及固定裝置設(shè)計(jì)，使其可以更牢固的置于宮腔，且不易引起環(huán)崁頓、異位等現(xiàn)象的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)研究MAS-IUS優(yōu)化品在模擬宮腔液中LNG的釋放規(guī)律來(lái)推測(cè)其在人體宮腔液中的釋放規(guī)律，實(shí)際上人體是一個(gè)非常復(fù)雜的有機(jī)體，不同部位、甚至是在同一部位的不同時(shí)刻，組織內(nèi)液的成分都是不一樣的；人體宮腔環(huán)境是人體相對(duì)獨(dú)立的環(huán)境，其新陳代謝與人體其他部位有很大的區(qū)別，并且女性生理周期的不同階段，其宮腔環(huán)境也會(huì)有所改變[17]，實(shí)際人體宮腔液的成分是處于動(dòng)態(tài)變化的，具有很大的不確定性，故通過(guò)模擬宮腔液的體外實(shí)驗(yàn)研究無(wú)法完全模擬出真實(shí)宮腔液中LNG的釋放規(guī)律。

MAS-IUS的終極目標(biāo)是著眼于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，最終服務(wù)于臨床，后繼需大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以期為MAS-IUS優(yōu)化品產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。