佘安俊，劉代順，田 靜，歐浪浪

(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

膿毒癥是由各種微生物和病毒引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征[1]，很容易導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS)，膿毒性休克，甚至臨床死亡[2-3]；目前，膿毒癥的高發(fā)病率仍然是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的主要臨床威脅[4-5]。據(jù)估計(jì)，在美國和歐洲有2%～11%的重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者歸因于膿毒癥[6-7]，它是一種常見的嚴(yán)重臨床綜合征，死亡率在30%至50%[8]。盡管在膿毒癥的診斷和支持治療方面取得了很大的進(jìn)步，但死亡率仍未得到顯著改善[9-11]。因此，迫切需要開發(fā)治療膿毒血癥的新穎和替代策略。

黃酮類化合物是許多天然植物的提取物,是一類多酚類化合物,種類繁多，廣泛存在于自然界中,因其具有治療膿毒癥以及抗病毒、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化等多種生物學(xué)活性而越來越多的引起人們的重視[12]，其主要成分為黃酮醇、黃酮、黃烷酮、異黃酮、花青素等類型。而花青素屬于黃酮類化合物其中的一種類型，它是一種天然水溶性色素,廣泛存在于谷物，蔬菜和水果中，如葡萄，漿果，可可和蘋果[13]，具有抗炎，抗氧化等多種生物學(xué)活性[14]，另有研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽花青素(GSP)可以改善2,4-二硝基氟苯誘導(dǎo)的過敏性超敏反應(yīng)及免疫毒性作用[15]。然而，花青素在體內(nèi)外膿毒癥模型中的抗炎作用和機(jī)制知之甚少。因此，本研究將通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠和細(xì)胞模型，探究葡萄籽原花青素在其中發(fā)揮的作用，以及對其中機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 GSP提取物，購自天津JF-NATURE研究所(中國天津)，其純度為95%，它含有90%的多酚，由超過85%OligomericProantho Cyanidins(OPCs)和超過7%(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素的成分組合而成；脂多糖(LipopolysaccharidLPS)，二甲基亞砜Dimethyl SulfoxideDMSO)，Griess試劑，新生小牛血清(FBS)，青霉素和鏈霉素購自Sigma(St.Louis，MO)；RAW 264.7是一種鼠巨噬細(xì)胞系，獲自ATCC，Manassas，VA，USA。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)購自(Sigma，Gillingham，UK)；鼠IL-1β和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒獲自eBioscience(San Diego，CA)；NF-kB p65，p-NF-kB p65，β-肌動(dòng)蛋白一抗和抗兔IgG辣根過氧化物酶(HRP)-綴合的第二抗體購自Cell SignalingTechnology(Danvers，MA，USA)。

1.2 分組與造模 腹膜巨噬細(xì)胞分離在無特定病原體的Balb / c小鼠腹腔注射體積為10 mL的RPMI；5 min后，抽出培養(yǎng)基并以180×g，4 ℃離心10 min；PBS洗滌后，以1×106個(gè)細(xì)胞/ mL的密度重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中。最后，將細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中溫育3 h，以使細(xì)胞粘附。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 亞硝酸鹽分析 在LPS(11 μg/ mL)存在的情況下，用濃度分別為2.5、10、40 mg/kg處理培養(yǎng)的RAW巨噬細(xì)胞；24 h后，從每個(gè)孔收集上清液，然后，使用Griess試劑亞硝酸鹽(NO的氧化產(chǎn)物)在培養(yǎng)的上清液中進(jìn)行分光光度計(jì)評(píng)估。簡而言之，將100 μL上清液與相同量的Griess試劑(0.1%N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽和1%磺酰胺在5%磷酸中)混合并溫育10 min；在室溫下，在540 nm處，使用Synergy Mx讀板儀測量吸光度。參考使用NaNO2獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行亞硝酸鹽濃度的計(jì)算。對于每種不同的處理，進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.2 細(xì)胞活力測定 MTT染色法用于評(píng)估細(xì)胞的活力。將細(xì)胞以每孔8×103的密度接種到96孔板中并使其生長過夜。將GSP溶于DMSO中并用培養(yǎng)基稀釋至終濃度為2.5、10、40 mg/kg。在MTT測定之前，將細(xì)胞與異內(nèi)酯一起溫育24 h，使用Synergy Mx讀板儀在570 nm下測量吸光度。對于每次處理，進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.3 細(xì)胞因子分析 根據(jù)試劑盒制造商的說明，通過ELISA分析測定培養(yǎng)基或血清中的IL-1β和TNF-α水平。將小鼠腹膜巨噬細(xì)胞和RAW 264.7巨噬細(xì)胞以每孔400,000個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板中。用GSP(2.5、10、40 mg/kg)預(yù)處理細(xì)胞1h，然后用LPS(0.5 mg / mL)刺激24 h。處理后，收集培養(yǎng)基以測量IL-1β和TNF-α水平。將培養(yǎng)基中炎性細(xì)胞因子的總量標(biāo)準(zhǔn)化為活細(xì)胞沉淀的總蛋白量。

1.3.4 實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)根據(jù)制造商的方案，使用TRIZOL從RAW 264.7細(xì)胞中提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄和定量聚合酶鏈反應(yīng)均使用兩步M-MLV Platinum SYBR Green定量聚合酶鏈反應(yīng)SuperMix-UDG試劑盒進(jìn)行。 Eppendorf Mastercycler ep realplex檢測系統(tǒng)用于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)分析。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA表達(dá)的相對倍數(shù)變化，其中與對照樣品相比，目標(biāo)擴(kuò)增子的ΔCt值的平均值歸一化為內(nèi)源基因(b-肌動(dòng)蛋白)的平均值。選擇用于分析的基因的引物，即誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)由Invitrogen合成。使用的引物序列如下所示：小鼠iNOS F：5’-CAGCTGGGC-TGTACAAACCTT-3’R：5’-CATTGGAAGTGAAGC-GTTTCG-3’;小鼠b-肌動(dòng)蛋白F：5’-TGGAATCCTGTG-GCATCCATGAAAC-3’，R：5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’。測定每種基因的量并將其標(biāo)準(zhǔn)化為b-肌動(dòng)蛋白的量。

1.3.5 LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型建立和生存率分析 動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)程序根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。對于膿毒癥生存率實(shí)驗(yàn)，注射LPS(10 mg / kg，腹腔注射)前1 h，通過i.p.2.5、10、40 mg/kg GSP處理雄性C57BL / 6小鼠(18-22g);每12小時(shí)監(jiān)測小鼠5 d,在每只小鼠注射LPS后12 h獲得血清和肝、腎、肺組織，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.3.6 組織病理學(xué)分析 用GSP(2.5、10、40 mg/kg)處理C57BL / 6小鼠;然后在腹腔注射LPS(10 mg / kg)1 h后，在實(shí)驗(yàn)后收集組織(肝，肺和腎)并切片并在鹽水中洗滌；將樣品在10%福爾馬林中固定24 h。然后，用不同濃度的乙醇將它們脫水并包埋在石蠟中，使用切片機(jī)獲得5 μM厚度的切片；最后，在切片后，將樣品染色玻璃顯微鏡載玻片上的蘇木精和伊紅(H&E)在20×放大倍數(shù)下使用光學(xué)顯微鏡觀察組織切片中的組織病理學(xué)變化。

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡 在60 mm培養(yǎng)皿中，以(2×105個(gè)細(xì)胞/孔)的密度接種RAW 264.7細(xì)胞并孵育過夜以進(jìn)行細(xì)胞附著。 24 h后，用GSP(2.5、10、40 mg/kg)和LPS處理細(xì)胞。通過用PBS洗滌細(xì)胞獲得總蛋白質(zhì)，然后使用冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液裂解并在200 g，4 ℃下離心5 min。將蛋白質(zhì)樣品上樣到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠的孔上進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。然后將它們在室溫下用10%脫脂乳封閉2 h，并在封閉溶液中以1∶500的稀釋度與第一抗體一起在4 ℃溫育過夜，隨后與堿性磷酸酶過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育1 h(室溫下1∶500稀釋)。之后，用TBST洗滌膜并使用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色。使用Image J軟件量化條帶強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 GSP對LPS誘導(dǎo)的小鼠生存率和血清中炎性細(xì)胞因子的影響 本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了GSP是否抑制LPS誘導(dǎo)小鼠的IL-1β，TNF-α產(chǎn)生和提高膿毒癥小鼠生存率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單獨(dú)的LPS相比，各劑量的GSP均抑制了小鼠血清中的TNF-α和IL-1β水平(見圖1B、C，P<0.05，P<0.01，P<0.001)，并且還提高了存活率(見圖1A)。

2.2 GSP對LPS誘導(dǎo)的小鼠肝、腎、肺組織損傷的影響 本研究為了檢查各器官損傷，收集肺，肝和腎樣品并進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示，在LPS組中，H&E染色的肺顯示肺泡壁厚度增加和炎性細(xì)胞浸潤，正常組未見病理改變。與用LPS處理的小鼠相比，用GSP(2.5、10、40 mg/kg)處理的小鼠中肺組織的病理損傷逐漸改善，濃度為40 mg/kg的GSP處理組最為顯著；與肺損傷類似，LPS誘導(dǎo)的肝損傷顯示出明顯的壞死，但GSP處理組減少了肝組織中的壞死；同樣， LPS注射后觀察到腎臟嚴(yán)重的組織病理學(xué)變化，如腎上皮管狀細(xì)胞脫落，給予GSP減少腎小管上皮細(xì)胞脫落和減少腎上皮細(xì)胞損傷(見圖2)。

A：生存率(n=15)；ELISA 檢測血清中；B：TNF-α；C：IL-1β含量。n=6, ###：與Con組相比,P< 0.001；與LPS組相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。圖1 GSP對LPS誘導(dǎo)的小鼠生存率和血清中炎性細(xì)胞因子的影響

HE染色：肝組織、腎組織、肺組織(20×)。圖2 GSP對LPS誘導(dǎo)的小鼠肝、腎、肺組織損傷的影響

2.3 GSP對LPS激活的RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞活力，IL-1β，TNF-α和NO的產(chǎn)生以及iNOS表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，在LPS刺激后，IL-1β，TNF-α和NO水平顯著增加，GSP抑制了IL-1β，TNF-α和NO的產(chǎn)生；在GSP處理組中觀察到劑量依賴性抑制(見圖3B、C、D，P<0.05，P<0.01，P<0.001)，與LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞相比，GSP處理組中iNOS的mRNA和蛋白水平均顯著降低，且表現(xiàn)出劑量依賴性抑制作用(見圖3E、F，P<0.05，P<0.01，P<0.001)。

A：采用MTT法檢測細(xì)胞存活率；ELISA法檢測，B：TNF-α；C： IL-1β；Griess試劑盒檢測，D： NO水平；E：RT-PCR檢測iNOS mRNA表達(dá)水平；F：Western blot檢測iNOS 蛋白水平。n=3,###：與Con組相比,P< 0.001；與LPS組相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。 圖3 GSP對LPS激活的RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞活力，IL-1β，TNF-α和NO的產(chǎn)生以及iNOS表達(dá)的影響

2.4 GSP降低了LPS激活的RAW 264.7細(xì)胞中NF-κB的活化Western blot 結(jié)果顯示，LPS刺激顯著增強(qiáng)了RAW 264.7細(xì)胞的IκB和NF-κB磷酸化,然而通過用GSP(25、100、400 μg/mL)處理顯著抑制了LPS活化的RAW 264.7細(xì)胞中IκB的磷酸化和NF-κB的活化(見圖4)。

A:采用Western blot檢測p-p65、p65、p-IκB、IκB蛋白表達(dá)水平；B:p-p65相對蛋白表達(dá)率；C:p-IκB相對蛋白表達(dá)率。n=3,###：與Con組相比,P< 0.001；與LPS組相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。圖4 GSP降低了LPS激活的RAW 264.7細(xì)胞中NF-κB的活化

3 討論

近年來，越來越多的研究表明，從植物或草藥中分離的天然藥物是尋找低毒性新藥的重要資源。中國人使用草藥治療炎癥和感染超過2000年，以前的證據(jù)表明，使用具有抗炎作用的天然藥物是治療膿毒血癥的可行方法[16]。在目前的工作中，我們提供的實(shí)質(zhì)性證據(jù)表明GSP對體外從小鼠分離的RAW 264.7巨噬細(xì)胞和小鼠體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生具有抑制作用。

誘導(dǎo)型NOS(iNOS)產(chǎn)生的一氧化氮(NO)常常與多種炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，NO對炎癥的影響是通過S-亞硝基化作用介導(dǎo);因此，炎癥反應(yīng)中亞硝化反應(yīng)的增加會(huì)導(dǎo)致亞硝化應(yīng)激，最終導(dǎo)致組織損傷和DNA損傷[17]。我們的研究結(jié)果表明，GSP抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7的 NO的產(chǎn)生，并抑制RAW 264.7細(xì)胞中iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)。

據(jù)報(bào)道，免疫系統(tǒng)對抗感染的主要反應(yīng)是炎癥，巨噬細(xì)胞在炎癥過程中起關(guān)鍵作用。活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生許多促炎細(xì)胞因子，當(dāng)這些細(xì)胞因子過量產(chǎn)生時(shí)，它們參與許多疾病過程的預(yù)后。因此，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生可能能夠治療許多炎性疾病，例如多器官衰竭和組織損傷。我們的研究結(jié)果顯示，GSP能夠減弱由細(xì)菌脂多糖(LPS)處理激活的RAW 264.7細(xì)胞以及小鼠血清中的TNFα和IL-1β過量產(chǎn)生。

參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)能夠調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。在靜止?fàn)顟B(tài)下，NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合，當(dāng)用LPS刺激時(shí)，IκB被IKK磷酸化，與泛素蛋白結(jié)合,后經(jīng)蛋白酶體降解,從而將NF-κB釋放到細(xì)胞核中以驅(qū)動(dòng)靶基因的表達(dá)。我們的結(jié)果表明GSP抑制LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中IκB的磷酸化和降低NF-κB活性。從這些結(jié)果，我們證明了GSP對炎癥反應(yīng)的抑制作用是通過LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中的NF-kB途徑介導(dǎo)的。

此外，在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型C57BL / 6小鼠中，我們研究了GSP的治療功效和安全性。促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6是敗血癥的主要炎癥介質(zhì),抑制炎癥介質(zhì)的過量產(chǎn)生對于膿毒癥的治療非常重要。我們結(jié)果表明GSP的處理抑制了LPS攻擊的小鼠中TNF-α，IL-6和NO的產(chǎn)生。此外，MK減少肺，肝和腎中的炎性細(xì)胞浸潤，并抑制LPS攻擊的小鼠中肝細(xì)胞，肺細(xì)胞和腎細(xì)胞的損失?？偟膩碚f，中劑量和高劑量的GSP通過阻斷LPS攻擊的急性期炎癥介質(zhì)來抑制LPS誘導(dǎo)的組織損傷。另外，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)用GSP治療可以積極地提高小鼠的存活率。

總之，我們發(fā)現(xiàn)GSP能夠抑制iNOS的表達(dá);減少NO,TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生;降低NF-kB活性;改善LPS誘導(dǎo)的肺，肝和腎損傷;并且提高了LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型的存活率。這些結(jié)果表明黃酮類化合物可以進(jìn)一步開發(fā)為治療或預(yù)防膿毒血癥的藥物，可能成為膿毒血癥治療的新選擇，具有極大的臨床研究價(jià)值。