周 俊，張春英，李三華，鐘 櫟，周正平

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 電鏡室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099；4.懷化市第一人民醫(yī)院 病理科，湖南 懷化 418000)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，子宮內(nèi)膜樣癌(Endometrial carcinoma,EC)是其主要組織學(xué)類型。2020年美國子宮內(nèi)膜癌約有65 620例新發(fā)病例，12 590死亡病例，其發(fā)病率每年上升1.3%，到2030年總病例數(shù)預(yù)計(jì)會(huì)達(dá)到1023 290例，在美國女性好發(fā)腫瘤中，子宮內(nèi)膜癌為僅次于乳腺癌的第二大高患病率腫瘤[1-2]。研究證明，子宮內(nèi)膜癌的高危因素主要是長期無孕激素拮抗的高水平雌激素環(huán)境刺激，但其發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制目前尚不清楚，可能與細(xì)胞周期異常調(diào)控、表觀遺傳修飾有關(guān)[3-4]。

p57kip2在細(xì)胞周期調(diào)控過程中，通過阻滯細(xì)胞從G1期到S期轉(zhuǎn)變，從而抑制細(xì)胞增殖[5]。p57kip2在大多數(shù)腫瘤組織中，未見基因突變事件，其異常表達(dá)主要與表觀遺傳修飾有關(guān)，如DNA甲基化和組蛋白乙?；痆6]。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起著重要作用，主要發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島，在甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化下，甲基與5’端的胞嘧啶(C)殘基結(jié)合，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)[7]。

在DNA復(fù)制循環(huán)過程中，通過抑制DNMT活性、酶促5-mc降解等方式脫去甲基，可逐漸下調(diào)基因組甲基化水平[8-9]。在腫瘤中，DNMT抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)通過取代C與DNMT半胱氨酸殘基上的氫硫基(-SH)共價(jià)結(jié)合，使DNMT失活從而下調(diào)腫瘤抑制基因甲基化水平。本實(shí)驗(yàn)使用不同濃度5-Aza-CdR干擾人EC中分化JEC細(xì)胞不同時(shí)間段后，檢測不同甲基化水平的p57kip2對細(xì)胞生長的影響，為指導(dǎo)臨床進(jìn)一步開展子宮內(nèi)膜樣癌的靶向藥物治療提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 JEC細(xì)胞株(中分化)由遵義醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供[10]。5-Aza-CdR購自MACKLIN公司；MTT相關(guān)試劑購自南京凱基公司；WB相關(guān)試劑均購自上海碧云天生物研究所；p57kip2兔抗人單克隆抗體、二抗(山羊抗兔)購自Abcam公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、南美胎牛血清購自美國Gibco公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；倒置顯微鏡CKX41(日本OLYMPUS公司)；掃描電子顯微鏡SU8010(日本日立公司)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)；流式細(xì)胞儀(德國Beckman公司)；BSP 檢測由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 濃度為12.5 μmol/L和15 μmol/L的5-Aza-CdR干擾JEC細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組(A組：12.5 μmol/L；B組：15 μmol/L組；A+、B+組：分別為A、B組于48h追加一次等量5-Aza-CdR)，對照組則加等量不含任何藥物的完全培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2 亞硫酸氫鹽測序(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)法檢測各組JEC細(xì)胞中p57kip2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平 將實(shí)驗(yàn)組和對照組分別培養(yǎng)24、48、72 h后，消化離心后收集細(xì)胞，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成p57kip2基因啟動(dòng)子區(qū)32個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化率檢測。

1.2.3 MTT法檢測各組JEC細(xì)胞增殖 以100 μL/孔接種于96孔板上，每組5個(gè)復(fù)孔，等待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的5-Aza-CdR，分別于24、48、72 h取出對應(yīng)96孔板，吸出孔內(nèi)殘余液體，PBS沖洗后吸盡殘液，避光操作加20 μL MTT溶液，于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)反應(yīng)，4 h后吸出上清溶液，避光分別加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，避光水平避光搖晃10 min，使用酶標(biāo)儀(波長490 nm)檢測OD值。

1.2.4 Western blot法檢測各組JEC細(xì)胞中P57kip2蛋白表達(dá) 5-Aza-CdR干擾實(shí)驗(yàn)組和對照組24、72 h，于冰上裂解30min提取蛋白，制膠后電泳，根據(jù)Maker切下57kDa(p57kip2蛋白分子量57kDa)所在范圍的凝膠，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上再封閉，一抗(p57kip2、β-actin稀釋比例分別為1∶500和1∶1 000)4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗(稀釋比例1∶10 000)室溫?fù)u床孵育2 h，再洗膜3次，最后上機(jī)曝光檢測。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析各組JEC細(xì)胞周期分布情況 5-Aza-CdR干擾實(shí)驗(yàn)組和對照組24、72 h，1 000 rpm離心3 min，去上清液，加入70%乙醇于4 ℃冰箱固定，次日將細(xì)胞于3 000 rpm離心5 min，去上清，PBS清洗后再離心，吸盡上清，加入100 μL RNase A溶液，于37 ℃水浴箱反應(yīng)30 min，最后加入400 μL PI染色液，混勻后4 ℃避光孵育30 min后上機(jī)檢測。

1.2.6 光鏡、電鏡觀察各組JEC細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 5-Aza-CdR干擾實(shí)驗(yàn)組和對照組72 h后：①使用倒置顯微鏡觀察JEC細(xì)胞生長情況；②雙重固定、梯度脫水后，臨界點(diǎn)干燥，粘托，鍍膜，掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察JEC細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR干擾后p57kip2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平 和對照組比較，在24、48 h以A、 A+組總體甲基化率下降明顯，在72 h以A+、B+組下降明顯；隨著時(shí)間延長，對照、A、B組持續(xù)升高， A+、B+組在72 h再次下降(見表1，圖1)。

表1 5-Aza-CdR干擾JEC細(xì)胞24、48、72 h后p57kip2基因啟動(dòng)子區(qū)總體甲基化率(%)

圖1 5-Aza-CdR干擾24 、48、72 h后JEC細(xì)胞p57kip2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

2.2 5-Aza-CdR干擾后JEC細(xì)胞生長水平 相同作用時(shí)間：和對照組比較，在24 h，A、A+組細(xì)胞生長水平下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且分別低于B、B+組(P<0.05)，B、B+組下降不明顯(P>0.05)；在48 h，各實(shí)驗(yàn)組均有明顯下降(P<0.05)；在72 h，A、B組無明顯下降(P>0.05)，A+、B+組明顯下降且分別低于A、B組(P<0.05)。

相同藥物濃度：隨著時(shí)間延長，對照組的細(xì)胞生長水平持續(xù)上升(P<0.05)；24 h到48 h各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長水平均上升，僅A+組上升明顯(P<0.05)；48 h到72 h，A、B組持續(xù)上升，僅B組差異有意義(P<0.05)，A+、B+組呈下降趨勢，僅B+組下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 5-Aza-CdR干擾JEC細(xì)胞生長水平

2.3 5-Aza-CdR干擾后JEC細(xì)胞中P57kip2蛋白的表達(dá)情況 相同作用時(shí)間：和對照組比較，在24 h，A、A+組P57kip2蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)且分別高于B、B+組(P<0.05)，B、B+組上調(diào)不明顯(P>0.05)；在72 h，A、B組上調(diào)不明顯(P>0.05)，A+、B+組明顯上調(diào)且分別高于A、B組(P<0.05)。

相同藥物濃度：24 h到72 h，A、B組中P57kip2蛋白表達(dá)均下調(diào)，僅A組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A+、B+組中P57kip2蛋白表達(dá)均有顯著上調(diào)(P<0.05，見表3，圖2)。

表3 5-Aza-CdR干擾JEC細(xì)胞24、72 h后P57kip2蛋白表達(dá)

圖2 不同濃度5-Aza-CdR干擾后JEC細(xì)胞后P57kip2蛋白的表達(dá)情況

2.4 5-Aza-CdR干擾后JEC細(xì)胞周期分布情況 相同作用時(shí)間：和對照組比較，24 h各實(shí)驗(yàn)組中處于G1期的細(xì)胞比例均有大幅度增高(P<0.05)，處于S期的細(xì)胞比例下降，除A組外，其他實(shí)驗(yàn)組均有明顯下降(P<0.05)，處于G2期的細(xì)胞比例下降，僅A、A+組下降明顯(P<0.05)，周期的分布比例在各實(shí)驗(yàn)組之間均無明顯差異(P>0.05)；72 h中A+、B+組G1期細(xì)胞比例明顯增高且分別高于A、B組(P<0.05)，A、B組增高不明顯(P>0.05)，S期細(xì)胞比例下降，除B組外(P>0.05)，其他實(shí)驗(yàn)組均有明顯下降(P<0.05)，且A、A+、B+組分別低于B、A、B組(P<0.05)，G2期細(xì)胞比例增高不明顯(P>0.05)。

相同藥物濃度：24 h到72 h，對照組中S期細(xì)胞比例呈上升趨勢(P<0.05)，G1、G2期無明顯變化(P>0.05)，A、B組G1期細(xì)胞比例呈下降趨勢(P<0.05)，S期細(xì)胞比例呈上升趨勢，僅B組有意義(P<0.05)，A+、B+組G1期細(xì)胞比例呈上升趨勢，其中B+組上升明顯(P<0.05)，S期細(xì)胞比例呈下降趨勢(P<0.05)，各實(shí)驗(yàn)組G2期細(xì)胞比例均有上升，僅A、A+組差異有意義(P<0.05，見表4，圖3)。

表4 5-Aza-CdR干擾JEC細(xì)胞后周期分布情況

A：對照組24 h細(xì)胞周期分布情況； B：對照組72 h細(xì)胞周期分布情況；C：A組24 h細(xì)胞周期分布情況； D：A組72 h細(xì)胞周期分布；E：B組24 h細(xì)胞周期分布情況；F：B組72 h細(xì)胞周期分布情況；G：A+組24 h細(xì)胞周期分布情況；H：A+組72 h細(xì)胞周期分布情況；I：B+組24 h細(xì)胞周期分布情況；J：B+組72 h細(xì)胞周期分布情況。圖3 5-Aza-CdR干擾JEC細(xì)胞后周期分布情況

2.5 5-Aza-CdR干擾后JEC細(xì)胞形態(tài)變化 倒置顯微鏡觀察：JEC細(xì)胞呈不規(guī)則形或長梭形，可見明顯的圍腺腔樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)至72 h，和對照組比較，A、B組的細(xì)胞密度無明顯變化，A+、B+組的細(xì)胞密度明顯減小(見圖4)。

掃描電鏡觀察：JEC細(xì)胞呈球形，培養(yǎng)至72 h，和對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表面微絨毛和分泌泡均更加豐富，其中A+、B+組更明顯(見圖5)。

A：對照組細(xì)胞生長情況；B：A組JEC細(xì)胞生長情況；C： A+組JEC細(xì)胞生長情況；D：B組JEC細(xì)胞生長情況；E： B+組JEC細(xì)胞生長情況。圖4 JEC細(xì)胞72 h后的細(xì)胞生長情況(×100)

A：對照組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；B：A組JEC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；C： A+組JEC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；D：B組JEC細(xì)胞生長情況；E： B+組JEC細(xì)胞生長情況。圖5 5-Aza-CdR干擾72 h后JEC細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

3 討論

表觀遺傳學(xué)的概念最初由英國生物學(xué)家Waddington于1942年提出，它是基因型和表型之間的橋梁，這種修飾現(xiàn)象改變了基因組或染色體的表達(dá)，但沒有改變DNA序列。DNA甲基化是基因表觀遺傳修飾的主要方式，在發(fā)育障礙、衰老和腫瘤形成的過程中都存在DNA甲基化改變[11-12]。

p57kip2作為一種候選的抑癌基因，在胃賁門腺癌、肝細(xì)胞癌、膽囊癌等組織中表達(dá)有明顯下調(diào)[13-15]。過去的研究認(rèn)為，抑癌基因的異常表達(dá)與基因突變有關(guān)，目前通過對抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的過度甲基化研究，認(rèn)為抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的過度甲基化是抑癌基因失活的一個(gè)重要機(jī)制[16-17]，p57kip2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游和下游均富含大量CpG島，從而致使其轉(zhuǎn)錄后易受表觀遺傳修飾[18]。在正常細(xì)胞中，腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島處于低甲基化或非甲基化狀態(tài)，發(fā)揮抑制細(xì)胞周期、防止細(xì)胞異常增殖等功能；當(dāng)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島被高度甲基化，染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，腫瘤抑制基因表達(dá)受抑制，甚至處于沉默狀態(tài)，使細(xì)胞不受控制的增長，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[19]。

Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中，5-Aza-CdR能有效抑制細(xì)胞增殖，隨時(shí)間延長，這種抑制狀態(tài)會(huì)逐漸逆轉(zhuǎn)。5-Aza-CdR通過抑制DNMT的活性從而降低抑癌基因的高甲基化水平并恢復(fù)其表達(dá)[21]，在臨床上主要用于治療骨髓增生異常綜合征(MDS)，5-Aza-CdR聯(lián)合化療的方案已在難治或復(fù)發(fā)的急性髓細(xì)胞性白血病(AML)患者中治療中效果較好[22]。本課題組前期研究[23]發(fā)現(xiàn)：5-Aza-CdR能降低JEC細(xì)胞中p57kip2基因啟動(dòng)子區(qū)的總體甲基化率，其中12.5 μmol/L比15 μmol/L下降更明顯；隨著時(shí)間延長，未追加藥物的12.5、15 μmol/L兩個(gè)濃度組中p57kip2基因啟動(dòng)子區(qū)部分位點(diǎn)出現(xiàn)再甲基化，總體甲基化率上升，本次研究發(fā)現(xiàn)，追加藥物的12.5、15 μmol/L兩個(gè)濃度組總體甲基化率在72 h出現(xiàn)下降，提示5-Aza-CdR能使p57kip2基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化水平下降，但需要追加5-Aza-CdR來維持其去甲基化作用。

Dastjerdi等[24]的研究顯示：使用5-Aza-CdR處理人胰腺癌PNAC-1細(xì)胞可導(dǎo)致RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)部分去甲基化，且5-Aza-CdR去甲基化表現(xiàn)出時(shí)間依賴性、劑量依賴性：隨著試驗(yàn)時(shí)間延長實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出明顯的抑制細(xì)胞生長作用。Perrard等[25]發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR能下調(diào)宮頸癌HPV陽性SiHa和Ca-Ski細(xì)胞中HPV E6蛋白表達(dá)，并具有明顯的時(shí)間依賴性；但E6下調(diào)水平在不同濃度并未發(fā)現(xiàn)差異。我們研究發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中P57kip2蛋白表達(dá)量以及G1期細(xì)胞比例均有不同程度上升，細(xì)胞生長水平均有不同程度下降，這種變化趨勢在24 h中12.5 μmol/L比15 μmol/L表現(xiàn)更明顯(P<0.05)，到72 h后則以追加藥物的12.5、15 μmol/L兩個(gè)濃度組表現(xiàn)更加明顯(P<0.05)，同時(shí)還伴隨S期的細(xì)胞比例下降(P<0.05)、G2期比例上升(P>0.05)、細(xì)胞密度減小以及細(xì)胞表面有更加豐富的微絨毛和分泌泡等促細(xì)胞向好分化方向發(fā)展的表現(xiàn)；從24 h到72 h，未追加藥物的12.5、15 μmol/L兩個(gè)濃度組蛋白表達(dá)、G1期細(xì)胞比例下降，S期和G2期的細(xì)胞比例、細(xì)胞生長水平上升，而追加藥物的12.5、15 μmol/L兩個(gè)濃度組蛋白表達(dá)、G1期細(xì)胞比例上升，S期和G2期的細(xì)胞比例、細(xì)胞生長水平下降(P<0.05)，提示5-Aza-CdR的去甲基化作用存在時(shí)間依賴性，追加藥物能持續(xù)上調(diào)P57kip2蛋白表達(dá)和G1期細(xì)胞比例，從而抑制細(xì)胞生長，且12.5 μmol/L的去甲基化效果比15 μmol/L更好，不具有濃度依賴性，這和Perrard等[25]的研究結(jié)果相似，與Dastjerdi等[24]的研究結(jié)果不一致，這可能與不同組織的腫瘤、不同細(xì)胞系的內(nèi)在基因組表觀特征不同，以及對5-Aza-CdR的敏感性不同有關(guān)。

綜上所述，在JEC細(xì)胞中，5-Aza-CdR能降低p57kip2基因啟動(dòng)子區(qū)總體甲基化水平，但存在時(shí)間依賴性，隨著時(shí)間延長，部分位點(diǎn)會(huì)復(fù)甲基化，追加5-Aza-CdR能維持p57kip2啟動(dòng)子區(qū)的總體甲基化水平，持續(xù)上調(diào)P57kip2蛋白的表達(dá)，從而使更多細(xì)胞被阻滯于G1期，發(fā)揮其負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制JEC細(xì)胞生長的功能，并有促進(jìn)細(xì)胞向更好分化方向發(fā)展的趨勢。