王志勇，李德鵬，李惠玲，王繁業(yè)

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266042)

奧美拉唑?qū)儆谫|(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)，是手性亞砜的一種，是一類治療消化系統(tǒng)潰瘍性疾病的有效藥物，其立體構(gòu)型與藥物的藥理活性等密切相關(guān)[1].手性亞砜的合成主要采用化學(xué)氧化法[2]，這種方法存在很多缺點(diǎn)，包括對(duì)環(huán)境不友好及重金屬殘留等[3].由于酶具有對(duì)映體選擇性，區(qū)域選擇性以及反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，使得利用酶促氧化前手性硫化物制備手性亞砜近年來備受關(guān)注[4].手性亞砜是一類具有重要價(jià)值的藥物，利用過氧化物酶催化硫醚的不對(duì)稱氧化制備手性亞砜一直是合成研究的探究熱點(diǎn).一些過氧化物酶，包括辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)[5]、豆殼過氧化物酶(soy husk peroxidase，SHP)[6]、煙曲柳氯過氧化物酶[7]等，通過研究它們的反應(yīng)機(jī)理[8]，證明這些酶均可用于制備手性亞砜.研究發(fā)現(xiàn)單酶[9-10]，肌紅蛋白[11]和細(xì)胞色素[12]可用來催化不對(duì)稱氧化合成亞砜化合物，然而也存在一些嚴(yán)重的缺點(diǎn)，如需要昂貴的輔助因子或輔助因子循環(huán)系統(tǒng)，有些則需使用昂貴且商業(yè)化程度較低的酶源.

本研究首次將從豆莢中提取的豆莢過氧化物酶(soybean pod peroxidase，SPP)用于硫醚的不對(duì)稱亞砜氧化制手性亞砜，SPP價(jià)廉易得，與種皮中的豆殼過氧化物酶(SHP)有所不同.SPP尚未有用于不對(duì)稱氧化的研究報(bào)道.微乳液體系適合于疏水底物的反應(yīng)，而且酶在微乳液中具有超活性.在本研究中，由于疏水底物和產(chǎn)物的存在，因此選用油包水微乳液為反應(yīng)介質(zhì).十六烷基三甲基溴化銨/氯仿/正丁醇/水是常用的油包水微乳液體系，適用于本反應(yīng)體系.

本研究從大豆莢中提取SPP，在十六烷基三甲基溴化銨/氯仿/正丁醇/水構(gòu)成的微乳液中，催化奧美拉唑硫醚氧化生成(S)-奧美拉唑.在酶催化不對(duì)稱氧化反應(yīng)中，影響產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體純度的因素很多，如反應(yīng)溫度、W/O值(水和表面活性劑摩爾濃度之比，即水與CTAB之比)、底物濃度等，為提高(S)-奧美拉唑的收率，將采用RSM優(yōu)化不對(duì)稱亞砜氧化反應(yīng)條件.

1 實(shí)驗(yàn)材料

奧美拉唑硫醚購自濟(jì)南沃德化工有限公司，(S)-奧美拉唑購自蘇州維塔化工有限公司，奧美拉唑購自山東壽光富康藥業(yè)有限公司，鮮豆莢購自蔬菜市場(chǎng).其他試劑均為分析純.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 豆莢過氧化物酶的分離純化

清洗后的新鮮大豆豆莢用高速食品攪拌機(jī)破碎，轉(zhuǎn)速為15 000 r·min-1，然后在4 ℃磷酸鹽緩沖液中浸提2 h，用500目濾布過濾.濾液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的聚乙二醇(PEG 4000)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的K2HPO4構(gòu)成的雙水相體系分離，超濾，利用鋅離子除雜，使用葡聚糖凝膠(Sephadex G-75)分離純化.最后將濃縮液冷凍干燥，制得活性為160 U·mg-1的過氧化物酶粉末.

2.2 過氧化物酶催化油包水微乳中奧美拉唑硫醚制備(S)-奧美拉唑

在25 mL小錐形瓶中，用SPP催化油包水微乳中的奧美拉唑硫醚，加入CTAB(1.265 g)、氯仿(7.8 mL)、正丁醇(1.2 mL)、奧美拉唑硫醚，1 mL磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)，制得W/O值為16的CTAB/氯仿/正丁醇/水油包水微乳液，最終SPP酶活性濃度范圍為240 ～ 3 200 U·mL-1.在微乳中加入H2O2引發(fā)亞砜氧化，反應(yīng)溫度50 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，反應(yīng)5 h.用注射器從反應(yīng)介質(zhì)中取樣，在樣品中加入3倍蒸餾水以分離水相和有機(jī)相，有機(jī)相用于測(cè)定奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率和(S)-奧美拉唑產(chǎn)率.從反應(yīng)混合物中取樣，采用 HPLC測(cè)定H2O2濃度.由于底物、產(chǎn)物在水中溶解度很小，所以，它們?cè)谒袣埩艉苄?

2.3 高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析

采用手性HPLC測(cè)定S構(gòu)型和R構(gòu)型的奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率和(S)-奧美拉唑產(chǎn)率.采用Agilent 1200 LC型液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，檢測(cè)波長(zhǎng)為302 nm，柱溫為30 ℃，手性色譜柱為Amyose-SA(規(guī)格250 mm×4.6 mm，填料粒徑5 μm，日本維美希公司生產(chǎn)).流動(dòng)相為體積比15∶85的乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)，流速0.6 mL·min-1.測(cè)定H2O2濃度的色譜柱為Inertsil ODS-SP(規(guī)格為15 mm × 4.6 mm，填料5 μm)，流動(dòng)相為體積比2∶8的甲醇和水，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速0.5 ml·min-1.(S)-奧美拉唑的保留時(shí)間為6.96 min，(R)-奧美拉唑的保留時(shí)間8.28 min.

2.4 (S)-奧美拉唑核磁譜圖數(shù)據(jù)

1H NMR (500 MHz，DMSO-d6)，δ:8.10 (s，1H)，7.51 (d，J=7.5 Hz，1H)，7.09 (d，J=1.3 Hz，1H)，6.97 (dd，J=7.5，1.3 Hz，1H)，5.00 (s，1H)，4.76 (s，2H)，3.87 (s，3H)，3.69 (s，3H)，2.23 (s，3H)，2.16 (s，3H)．

13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)，δ：166.19 (s)，164.25 (s)，158.20 (s)，150.87 (s)，149.70 (s)，140.20 (s)，139.29 (s)，127.52 (s)，126.29 (s)，116.18 (s)，114.20 (s)，99.81 (s)，61.27 (s)，59.86 (s)，55.56 (s)，12.94 (s)，11.28 (s)．

反應(yīng)制得(S)-奧美拉唑的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)[13]數(shù)據(jù)相符.

3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析

通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定了SPP在油包水微乳液中催化亞砜氧化的主要影響因素.選取W/O值、H2O2濃度和溫度三個(gè)因子作為自變量，底物奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率作為因變量進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)，分別用A、C、T、Y表示.用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，表1給出設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案的因素及水平.

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

4.1 SPP催化奧美拉唑硫醚生物氧化制備(S)-奧美拉唑

SPP催化奧美拉唑硫醚生物氧化生成(S)-奧美拉唑的反應(yīng)式為：

.

根據(jù)選定實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的條件，利用SPP催化奧美拉唑硫醚，測(cè)定奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示.

利用RSM確定了最優(yōu)擬合模型(式1)，表3給出回歸分析結(jié)果，分析了W/O值(A)、H2O2濃度(C)和溫度(T)對(duì)奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率(Y)的影響.

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)和RSM產(chǎn)量結(jié)果Tab.2 Box-Behnken design and RSM output results

Y=93.16-0.37A+0.54C-0.84T+

0.47AC+0.43AT-0.50CT-3.86A2-

3.13C2-5.68T2，

(1)

式中，A為W/O值的水平，C為H2O2濃度的水平，T為反應(yīng)溫度的水平，Y為奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率.

回歸模型式1中，系數(shù)為正時(shí)，表明該因素與響應(yīng)值相應(yīng)值正相關(guān)；反之，系數(shù)為負(fù)則說明為負(fù)相關(guān).如式1所示：C、AC和AT的系數(shù)為正，表明如果提高這些因素，則奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率增加.在選定的17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的水平下，對(duì)擬合模型和模型中各單項(xiàng)式(如0.54C，—0.50CT)進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表3所示.

表3 擬合模型的方差分析Tab.3 Analysis of variance of the fitted model

續(xù)表3

4.2 各種因素交互作用對(duì)奧美拉唑硫化物轉(zhuǎn)化率的影響

根據(jù)該模型繪制了響應(yīng)面圖，直觀地反映了各因素對(duì)奧美拉唑硫化物轉(zhuǎn)化率的影響.如圖1、圖2和圖3所示，每個(gè)圖都有兩個(gè)目標(biāo)變量，而另一個(gè)變量的編碼值保持為零.W/O值(A)和H2O2濃度(C)對(duì)轉(zhuǎn)化率(Y)的影響如圖1所示：開始時(shí)轉(zhuǎn)化率隨W/O值的增加而增加，直到出現(xiàn)最大轉(zhuǎn)化率61.5% (W/O值約為16)；然后轉(zhuǎn)化率隨W/O值的增加而下降.W/O值直接影響微乳液中水核的尺寸，而水核大小是影響酶活性的關(guān)鍵因素，因而存在一個(gè)最佳W/O值使底物轉(zhuǎn)化率最大.在微乳液中，酶活性與W/O值的關(guān)系曲線形狀一般為鐘形曲線[14].在油包水微乳液中，W/O值對(duì)酶活性的影響很大[15-16].最優(yōu)W/O值表明油包水微乳液中的水核尺寸與酶分子的大小相適應(yīng)，從而使酶表現(xiàn)出超活性.如果W/O值非常小，會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)酶分子不能浸泡在水核中，而是直接在有機(jī)溶劑中失活；而當(dāng)W/O值較大時(shí)，酶活性隨W/O值的增加而降低，這可能是由于微乳液中水分含量的增加所致[17].

反應(yīng)介質(zhì)可能會(huì)改變過氧化物酶的構(gòu)型偏好.SHP催化硫化物反應(yīng)在水環(huán)境中的不對(duì)稱氧化有利于生成S構(gòu)型，而在有機(jī)溶劑中則有利于生成R構(gòu)型[18].本實(shí)驗(yàn)研究的油包水型微乳液中，反應(yīng)主要發(fā)生在水相，而不是有機(jī)相，因此SPP構(gòu)型偏好應(yīng)與在水中相同，為S構(gòu)型.SPP和SHP的催化性能也可能存在一定的差異.在緩沖液中，SHP催化不對(duì)稱氧化生成手性亞砜，e.e.約為90%[6]，而已有報(bào)道無手性.HRP催化氧化表現(xiàn)出明顯的對(duì)映選擇性，在pH 7.0和4.5下，e.e.為60% ～ 70%[5].

圖2和圖3分別顯示了W/O值與溫度的相互作用以及H2O2濃度與溫度的相互作用.反應(yīng)溫度會(huì)直接影響反應(yīng)的活性和穩(wěn)定性[19].從圖2可見，反應(yīng)的最適溫度為49.67 ℃，轉(zhuǎn)化率為93.75%，HRP通常工作在20～30 ℃之間，說明SPP的熱穩(wěn)定性高于HRP.當(dāng)溫度高于50 ℃后繼續(xù)升高溫度時(shí)，轉(zhuǎn)化率逐漸降低，這是因?yàn)楦邷卦谝欢ǔ潭壬蠒?huì)使酶失活.

圖1 W/O值和H2O2濃度對(duì)奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface graph of the influence of W/O value and H2O2 concentration on the conversion rate of omeprazole sulfide

圖2 W/O值和反應(yīng)溫度對(duì)奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface graph of the influence of W/O value and reaction temperature on the conversion rate of omeprazole sulfide

圖3 H2O2濃度和反應(yīng)溫度對(duì)奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface plot of the influence of H2O2 concentration and reaction temperature on the conversion rate of omeprazole sulfide

圖1和圖3顯示，H2O2的濃度對(duì)奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率有顯著影響.開始時(shí)，轉(zhuǎn)化率隨著濃度的增加而增加，直到濃度達(dá)到22 mmol·L-1，奧美拉唑硫醚與H2O2的物質(zhì)的量比為1∶1.1，奧美拉唑硫醚最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.75%，然后隨著濃度的增加，轉(zhuǎn)化率逐漸下降.當(dāng)H2O2濃度過低時(shí)，無法滿足奧美拉唑硫醚氧化所需要的量，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降；當(dāng)H2O2濃度過大時(shí)，由于過氧化物酶可被H2O2滅活[20]，導(dǎo)致SPP活性受到抑制使得轉(zhuǎn)化率降低.H2O2的氧化作用導(dǎo)致酶中的二硫鍵被破壞和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)喪失[21-23]，從而使酶失活.因此，存在最佳H2O2濃度使得奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率最高.采用響應(yīng)面分析法確定了最佳條件.響應(yīng)面分析和模型計(jì)算得到了最佳工藝條件：W/O值為15.85，H2O2濃度為22.44 mmol·L-1，反應(yīng)溫度為49.68 ℃.在SPP初始酶活性濃度為3 200 U·mL-1，反應(yīng)時(shí)間為50 ℃的條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得到的奧美拉唑硫化物的轉(zhuǎn)化率為93.75%，與預(yù)測(cè)值(93.23%)非常接近，相應(yīng)的(S)-奧美拉唑的收率和EE分別為91.56%和96.08%，表明SPP具有良好的對(duì)映選擇性和較高的熱穩(wěn)定性.

5 結(jié)論

(S)-奧美拉唑抑制胃酸的效果優(yōu)于其他質(zhì)子泵抑制劑，而且對(duì)胃酸相關(guān)性疾病有更好的臨床治療效果[24].采用響應(yīng)面法優(yōu)化了在CTAB/氯仿/正丁醇/水油包水微乳液中SPP催化奧美拉唑硫醚生成(S)-奧美拉唑的反應(yīng)條件.當(dāng)SPP初始酶活性濃度為3 200 U·mL-1時(shí)，獲得的奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率、(S)-奧美拉唑收率及e.e.分別為93.75%、91.56%、96.08%.最佳反應(yīng)條件：W/O值為15.85，H2O2濃度22.44 mmol·L-1，反應(yīng)溫度為49.68 ℃，建立了響應(yīng)面模型，其R2為0.997 0，表明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)值具有較高的預(yù)測(cè)精度.該實(shí)驗(yàn)使用游離酶，無法循環(huán)使用，可對(duì)酶進(jìn)行固定化處理，使得酶可以循環(huán)使用，降低成本.

本研究同時(shí)證明SPP成本低、對(duì)映體選擇性好、熱穩(wěn)定性好，可替代成本較高的HRP用于進(jìn)行生物催化反應(yīng).