張艷莉 王 穎,2 王 迪 佐兆杭劉淑婷 張 裕 李志芳

(黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院1， 大慶 163319)(國家雜糧工程技術(shù)研究中心，糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室2，大慶 163319)

豆渣是常見的食品加工副產(chǎn)物，常被當做飼料或廢棄物丟棄。最常見的豆渣原料為大豆，近些年來因雜豆加工業(yè)得到重視，以蕓豆、紅豆、綠豆等為主的雜豆豆渣被作為研究對象。蕓豆是我國主要的小宗雜豆之一，作為黑龍江[1]主產(chǎn)雜糧之一，成為飲料[2]、豆沙[3]等食品的加工原料。

豆渣中富含膳食纖維(DF)[4]，按其溶解性可分為可溶性膳食纖維(SDF)和不可溶性膳食纖維(IDF)。研究表明，DF中SDF含量超過10%的可稱為優(yōu)質(zhì)膳食纖維[5]。改性能夠較好地改善、提高DF的物化特性。DF的物化特性直接決定其功能價值，因其較好的持水力、持油性起到控制體重、預防肥胖癥[6]的功效；較好的吸附性[7]、離子交換能力[8]能夠降血糖、血脂[9]進而預防糖尿病[10]、心血管疾病[11]等營養(yǎng)慢性??；特有的發(fā)酵性、溶解性能夠改善腸道菌群[12]。改性常作為提高DF中SDF含量的手段，常見的改性方法包括以酸堿法為主的化學改性[13]；以雙螺桿擠壓[14]、超微粉碎[15]為主的物理改性；以酶法[16]、發(fā)酵[17]為主的生物改性及聯(lián)合兩種單一改性方法的復合改性法。發(fā)酵改性可提高DF中SDF的含量，亦可增加這些可溶性成分原本不存在的功能性質(zhì)，或增強已經(jīng)存在的弱功能性質(zhì)[18]。研究表明植物乳桿菌[19]、嗜酸鏈球菌[20]、雙歧桿菌[21]、鼠李糖乳桿菌[22]能產(chǎn)生多種生物活性酶，具有提高DF中可溶性成分含量的功能，植物乳桿菌是活性最強的纖維素酶菌株之一，其中纖維素酶對IDF有顯著的降解作用。復合菌系[23]能夠更好地提高SDF的含量并改善DF的功能特性，目前研究常以單一菌種進行發(fā)酵改性，復合菌系發(fā)酵鮮有研究。

本研究利用復合菌系對豆渣進行發(fā)酵，提取發(fā)酵膳食纖維(FDF)并分離發(fā)酵可溶性膳食纖維(FSDF)和發(fā)酵不可溶性膳食纖維(FIDF)，通過響應面試驗確定最佳發(fā)酵提取工藝，并探究改性前后的FSDF和FIDF基本結(jié)構(gòu)及物化特性，旨在為蕓豆膳食纖維的功能性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

植物乳桿菌LactobaciLLuspLantarumCGMCC 1.569、嗜酸鏈球菌StreptococcusacidophiLusCGMCC 1.2919、雙歧桿菌BifidobacteriumCGMCC 1.5090、鼠李糖乳桿菌LactobaciLLusrhamnosusCGMCC 1.576；奶白花蕓豆豆渣；95%乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、水楊酸、亞硝酸鈉、膽固醇等均為分析純；堿性蛋白酶(酶活200 000 U/g)、耐高溫α-淀粉酶(酶活200 000 U/mL)。

1.2 儀器與設備

LABSJB-450型數(shù)顯型實驗室攪拌機，DL-360B型超聲波清洗機，C-04B型高速超微粉碎機，DGG-9140A型電熱恒溫干燥箱，LMQ.C-50E型高壓滅菌鍋，LHS-350HC型恒溫培養(yǎng)箱，JIDI-18D型臺式多用途高速離心機，F(xiàn)TIR-1500型傅里葉變換紅外光譜儀，UV759型紫外分光光度計，SU7000型掃描電鏡.

1.3 菌種活化與培養(yǎng)基制備

菌種活化：取植物乳桿菌、嗜酸鏈球菌、雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌(1∶1∶1∶1混合菌種)接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)基采用高壓濕熱滅菌121 ℃、15 min，接種量是從固體培養(yǎng)基里取2環(huán)到3環(huán)至液體培養(yǎng)基)，于37 ℃條件培養(yǎng)24 h，用菌落總數(shù)計數(shù)法，使菌數(shù)含量>1×107CFU/mL[11]，即為培養(yǎng)基發(fā)酵調(diào)節(jié)。

培養(yǎng)基制備：取預處理的豆渣粉，按料液比加脫脂奶粉2%、白砂糖1.5%，料液攪拌、混合均勻，調(diào)節(jié)pH后滅菌后，接菌發(fā)酵后提取DF。

1.4 響應面優(yōu)化膳食纖維制備工藝

脫脂豆渣→接菌發(fā)酵→熱水(70 ℃)漂洗至中性→烘干→超微粉碎→酶解脫蛋白去淀粉→控溫

1.5 IDF持水力、持油力、膨脹力測定

稱取0.5 g樣品計m1于50 mL離心管中，加入30 mL蒸餾水，攪拌30 min后靜置1 h，4 000 r/min，離心10 min，傾倒出上清液，用濾紙吸干離心管壁殘留水分，殘渣計m2，按式(1)計算持水力。稱取0.5 g樣品計m1于50 mL離心管中，加入30 mL食用油，攪拌30 min后靜置1 h，4 000 r/min，離心10 min，傾倒出上清液，用濾紙吸干離心管壁殘留油滴，殘渣計m2，按式(2)計算持油力。稱取1.0 g樣品mo于10 mL量筒中測定其初始體積V1，加入足量蒸餾水，振蕩均勻，室溫下靜置18 h后觀察量筒中物料的自由膨脹體積V2，按式(3)計算其膨脹力。

(1)

式中：m1為樣品質(zhì)量/g，m2為殘渣質(zhì)量/g。

(2)

其中m1為樣品質(zhì)量/g，m2為殘渣質(zhì)量/g。

(3)

其中V1為初始體積，V2為膨脹后體積/mL，m0為樣品質(zhì)量/g。

1.6 IDF吸附能力測定

稱取0.5 g樣品于錐形瓶中，加入膽酸溶液20 mL，37 ℃水浴振搖2 h，4 000 r/min，15 min。準確量取上清液1.0 mL測定殘余膽酸的量，根據(jù)反應前后的濃度差別計算吸附量，按式(4)計算。稱取1.0 g樣品于250 mL的三角瓶中，加入0.1 mg/mL的膽固醇溶液100 mL，調(diào)節(jié)體系pH值至2.0和7.0，置搖床中，37 ℃振蕩，反應一段時間4 000 r/min下離心20 min，吸取0.4 mL上清液，采用鄰苯二甲醛法測定膽固醇含量，按式(5)計算。

(4)

式中：n1為吸附前膽汁酸的量，n2為吸附后膽汁酸的量，m1為樣品質(zhì)量/g。

(5)

式中：n1為吸附前膽汁酸的量，n2為吸附后膽汁酸的量，m1為樣品質(zhì)量/g。

1.7 IDF離子交換能力測定

稱取干燥樣品，用0.1 mol/L HCl進行酸化處理，之后用蒸餾水清洗，用AgNO3溶液滴定去除氯離子，干燥。將干燥后樣品均勻分散于15% NaCl溶液中，以酚酞作指示劑，用0.02 mo1/L NaOH溶液滴定微紅時停止，搖勻再滴直至不再變色。記錄消耗NaOH的體積V，按式(6)計算其陽離子交換能力(CEC)。確稱取0.5 g樣品于250 mL錐形瓶中，加入濃度100 μmol/L的NaNO2溶液100 mL，調(diào)節(jié)體系pH至2.0和7.0，于37 ℃下恒溫磁力攪拌，反應一定時間，準確移取0.1 mL樣液，之后加入2 mL 0.4%氨基苯磺酸，靜置5 min后再加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，顯色穩(wěn)定后在分光廣度計上測538 nm處吸光度，按式(7)計算其陰離子交換能力(AEC)[24]。

(6)

式中：CNaOH為NaOH濃度；V為消耗NaOH的體積；m為樣品質(zhì)量/g。

(7)

式中：n1為吸附前NO2-的量，n2為吸附后NO2-的量，m為樣品質(zhì)量/g。

1.8 SDF抗氧化能力測定

配制9 mmoL/L水楊酸-乙醇，9 mmoL/L FeSO4溶液，8.8 mmoL/L的H2O2溶液，按順序加入到試管中，在37 ℃溫育30 min，于510 nm處測吸光值。每個濃度組平行測定3次，求其平均值，測定清除·OH的能力，測定結(jié)果以清除率表示，按式(8)計算。ABTS溶于水中配成7 mmoL/L的ABTS溶液，該溶液與2.45 mmoL/L過硫酸鉀在室溫下避光反應12 h，后用pH 7.4，0.2 mmoL/L的PBS稀釋60倍。在2.5 mL不同濃度的可溶性膳食纖維溶液中加入2 mL ABTS溶液，避光反應6 min，以蒸餾水為空白，在734 nm波長下測定其吸光度Asample。同時測定2.5 mL蒸餾水與2.0 mL ABTS溶液的吸光度(Acontrol)，計算清除率，按式(9)計算[25]。

(8)

式中：AX為樣品吸光度值，A0為模型對照組的吸光度值，AX0為模型對照組的吸光度值。

(9)

式中：Acontrol為模型對照組的吸光度值，Asample為樣品吸光度值，Aj為模型對照組的吸光度值。

1.9 DF的顯微結(jié)構(gòu)測定

掃描電鏡(SEM)研究方法[26]：試樣干燥至恒重，取少量用雙面膠固定在樣品座上，表面噴金處理后進行電鏡觀察并拍照。電鏡掃描條件：電壓15 kV，放大倍數(shù)1 000、2 500倍。

1.10 DF的紅外光譜測定

傅里葉紅外光譜(FTIR)的測定方法[27]：取1～2 mg干燥至恒重的DF于研缽中，加入100 mg左右的干燥的光譜純嗅化鉀，研磨混勻至細微的粉末狀，裝入并使其均勻平鋪于壓片模具中，抽氣加壓，保持3 min左右，將制成的透明薄片迅速放入儀器進行分析掃描，掃描次數(shù)：32次，分辨率：4 cm-1，掃描范圍：500～4 000 cm-1。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差(SD)表示，并通過t檢驗和Tukey-Kramer的進行多重比較測試，SPSS 20和Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵前后膳食纖維含量

由表1可看出發(fā)酵后的蕓豆豆渣IDF含量較未發(fā)酵的蕓豆豆渣降低了2%，發(fā)酵后的蕓豆豆渣SDF含量較未發(fā)酵的蕓豆豆渣提高了11.84%，發(fā)酵后DF質(zhì)量分數(shù)提高了2.81%。發(fā)酵過程中利用細菌等微生物，消耗原料中的碳源、氮源，以消除原料中的植酸，減少蛋白質(zhì)、淀粉等成分，最后得到膳食纖維。植物乳桿菌等菌類會在發(fā)酵過程中產(chǎn)生半纖維素酶等酶類物質(zhì)，從而將IDF中的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成SDF中的小分子單糖類物質(zhì)。

表1 發(fā)酵前后豆渣膳食纖維質(zhì)量分數(shù)

2.2 IDF持水力、持油力、膨脹力

由表2可知，經(jīng)過發(fā)酵改性處理后的IDF持水力、持油力和膨脹力都有顯著改善，F(xiàn)IDF的持水力較未改性提高了2倍，F(xiàn)IDF的持油力較未改性提高了6倍，改性后IDF的膨脹力較未改性提高了1.9倍。經(jīng)改性后的IDF，其分子間有大部分極性和非極性基團暴露出來，改變了其與水和油的相互作用[28]，因此FIDF的持水力及持油力顯著提高。

表2 發(fā)酵前后IDF持水力、持油力及膨脹力

2.3 IDF吸附能力

由圖1可知，F(xiàn)IDF吸附膽酸鈉能力顯著優(yōu)于未處理的IDF，隨吸附時間增加，發(fā)酵前后IDF的吸附能力都在升高，這是因為IDF表面有很多活性基團，能吸附鰲合膽汁酸等有機化合物。腸腔內(nèi)，IDF與膽汁酸可能是通過靜電力、氫鍵力或疏水鍵間的相互作用，其中氫鍵力結(jié)合也許是主要的作用形式[18]。圖2可看出，在不同pH環(huán)境下，F(xiàn)IDF對膽固醇的吸附能力都顯著高于未處理的IDF，pH 2條件下IDF對膽固醇吸附能力優(yōu)于pH 7條件下，pH 2條件下FIDF對膽固醇吸附能力顯著優(yōu)于pH 7條件下。說明IDF對膽固醇的吸附作用除了物理作用以外還表現(xiàn)出一定的化學吸附。FIDF粒徑減小，吸附表面積增大，吸附效果變好，粒徑變化還會影響到膽固醇分子滲入纖維其內(nèi)部的路徑長度[29]。

圖1 發(fā)酵前后IDF吸附膽酸鈉能力

圖2 發(fā)酵前后IDF吸附膽固醇能力

2.4 IDF離子交換能力

由圖3可知，發(fā)酵前后的IDF在pH 2時對陰離子的吸附能力皆顯著高于在pH 7時，在pH 2的條件下發(fā)酵前后的IDF的吸附能力較強，大約在吸附后3 h，2種pH條件下IDF的吸附均基本達到飽和。圖4可看出發(fā)酵改性前后IDF對陽離子交換能力均有影響，且皆成上升趨勢，F(xiàn)IDF陽離子交換能力明顯高于IDF，因為豆渣膳食纖維結(jié)構(gòu)中的一些羥基側(cè)鏈基團和羧基基團可以通過和腸道內(nèi)有機陽離子進行可逆性的交換，不但能使之隨食物殘渣排出，而且可以改變離子的瞬間濃度，在起到稀釋作用的同時延緩了它們轉(zhuǎn)換的時間，從而造成腸道內(nèi)氧化還原電位、滲透壓以及pH值發(fā)生改變，形成一個更易于吸收的緩沖環(huán)境[30]。

圖3 發(fā)酵前后IDF陰離子交換能力

圖4 發(fā)酵前后IDF陽離子交換能力

2.5 SDF抗氧化能力

圖5可看出，豆渣SDF對·OH有一定的清除能力，發(fā)酵后的SDF對·OH的清除能力明顯增強，這可能是因為發(fā)酵豆渣SDF后多糖的一級結(jié)構(gòu)上的部分羥基被硫酸基取代后影響多糖對·OH清除力，也可能是取代的硫酸基影響了多糖空間結(jié)構(gòu)或支鏈類型，從而增加了其清除·OH能力。豆渣SDF對ABTS有一定的清除能力，直接提取的SDF清除能力在SDF濃度達到20 mg/mL時被抑制，開始下降，F(xiàn)SDF的清除能力顯著優(yōu)于直接提取的。因為豆渣SDF

圖5 發(fā)酵前后SDF抗氧化能力

組成成分為多糖類物質(zhì)，由于多糖分子構(gòu)象中羥基包裹于分子內(nèi)部，大部分為分子內(nèi)強鍵，因此直接提取的SDF對ABTS有一定的清除作用但清除力有限，F(xiàn)SDF由于引入了硫酸基，多糖分子空間非共價鍵重新分布，糖鏈及空間結(jié)構(gòu)舒展，較多羥基被暴露在外面，此外，硫酸基的存在也使得多糖分子極性增強，因此對ABTS清除力增大[6]。

2.6 DF微觀結(jié)構(gòu)

由圖6a、圖6b可看出FIDF空間結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生改變，由原來的致密狀態(tài)變成松散的空間結(jié)構(gòu)，圖6c、圖6d可以看出與直接提取的SDF相比，F(xiàn)SDF表面褶皺更明顯，結(jié)構(gòu)疏松，帶有明顯的片狀結(jié)，其原因可能IDF經(jīng)改性后，大分子物質(zhì)發(fā)生降解，分子鏈被切斷，分子量相對降低，使得聚合度下降，顆粒變小，微觀結(jié)構(gòu)和分子大小發(fā)生了變化。由圖6e、圖6f可看出，經(jīng)發(fā)酵后豆渣，SDF含量明顯提高，可能因為發(fā)酵過程中產(chǎn)酶的作用，其結(jié)構(gòu)形態(tài)與直接提取的SDF不同，由圖6g、圖6f FSDF顆粒明顯較小，形狀不規(guī)則、結(jié)構(gòu)緊簇且呈密集的蜂窩狀，直接提取的SDF顆粒較大，形狀規(guī)則，呈松散的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，說明發(fā)酵過程能使SDF的微觀結(jié)構(gòu)和分子大小發(fā)生改變。這可能是因為發(fā)酵過程復合菌種會產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶等酶類物質(zhì)，使DF內(nèi)部發(fā)生水解作用，導致IDF轉(zhuǎn)換成SDF，豆渣中原有SDF的直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)被纖維素酶等酶類水解，使得分子質(zhì)量下降，聚合度降低，顆粒變小[31]。

圖6 發(fā)酵前后IDF、SDF掃描電鏡圖

2.7 DF紅外光譜圖

由圖7可看出發(fā)酵前后的IDF各組分吸收峰無明顯差別，在3 500～3 400 cm-1和2 900～2 800 cm-1附近分別出現(xiàn)纖維素和半纖維素分子內(nèi)或分子間羥基、亞甲基相應的伸縮振動峰，1 200～1 000 cm-1處為纖維素、半纖維素C—O—C基的伸縮振動，可表明IDF主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。說明發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶對樣品中的纖維素和半纖維素起到了一定的水解作用，并且促進了羥基基團的暴露[32]。發(fā)酵前后的SDF紅外光譜圖大致相同，為典型的多糖特征紅外圖譜，在3 500 cm-1左右吸收峰更寬更強，表明處于締合狀態(tài)的氫鍵較多，在1 700 cm-1的吸收峰是羰基吸收峰，存在糖醛酸，在900 cm-1處有弱小尖峰，是β-吡喃糖C—H變角振動的特征吸收峰，在750～674 cm-1附近出現(xiàn)的弱的吸收峰，表明多糖中存在α-D-吡喃木糖[26, 33]，可推斷豆渣SDF很可能含有酸性多糖或氨基多糖，并同時由β-D-吡喃葡萄糖，β-D-半乳糖，D-脫氧鼠李糖等成分組成。

圖7 發(fā)酵前后IDF、SDF紅外光譜圖

3 結(jié)論

采用發(fā)酵法制備豆渣膳食纖維，結(jié)果表明，發(fā)酵改性能顯著提高豆渣中SDF含量；發(fā)酵后DF的微觀結(jié)構(gòu)顯著改善，且具備IDF及SDF特有的組分；FIDF的物化特性顯著提高，發(fā)酵后SDF的抗氧化能力較好，發(fā)酵能夠較好地改善DF的表征結(jié)構(gòu)并提高其物化特性。