陳思宇，楊 雪，楊靈玲，燕照玲，韓曉玉，李慶倫，李洪連，陳琳琳，孫炳劍，施 艷

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002)

瓜類褪綠黃化病毒(Cucurbitchloroticyellowsvirus，CCYV)主要通過(guò)煙粉虱(Bemisiatabaci)以半持久性方式進(jìn)行傳播，侵染黃瓜、甜瓜等瓜類作物引起葉片褪綠和黃化，但是葉脈仍然保持綠色，嚴(yán)重時(shí)整株植物葉片變黃，已經(jīng)成為制約瓜類作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病原[1-2]。日本最先報(bào)道該病害的發(fā)生[2]。我國(guó)于2011年首次報(bào)道了該病害的發(fā)生[3]。近年來(lái)該病害在我國(guó)迅速蔓延，目前在江蘇、浙江、上海、臺(tái)灣、新疆、湖南、山東、北京、海南、廣西、河南、河北等地區(qū)都有發(fā)生[4-8]。

CCYV屬于長(zhǎng)線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus)?；蚪M由2條正單鏈RNA組成，RNA1長(zhǎng)度為8 607 nt，編碼4個(gè)閱讀框，分別為甲基轉(zhuǎn)移酶(MTR)和RNA解旋酶(Hel)、RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)、P1-6和P22；RNA2長(zhǎng)度為8 041 nt，編碼8個(gè)閱讀框，分別為P4.9、Hsp70、P2-6、P59、P9、CP、CPm和P26[2]。

CCYV P22蛋白位于CCYV RNA1 3′末端，分子質(zhì)量為22 ku。Chen等[9]研究證明了P22作為CCYV編碼的沉默抑制子發(fā)揮作用。已有研究表明，CCYV P22蛋白與黃瓜SKP1LB1蛋白互作，并且確定了F-box like基序(-LKLLI-)是P22發(fā)揮沉默抑制子活性和致病性所必需的區(qū)域[9]。甘薯褪綠矮縮病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus，SPCSV)RNA1 3′端編碼的P22蛋白能夠抑制由雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)的RNA沉默，同時(shí)P22也可以抑制沉默信號(hào)的傳導(dǎo)以及系統(tǒng)性沉默[10-11]。番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)RNA1編碼的P22可以抑制由正義RNA和dsRNA引起的基因沉默，但是不能抑制沉默信號(hào)在細(xì)胞間擴(kuò)散或長(zhǎng)距離移動(dòng)[12]，突變P22蛋白中的鋅指結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)P22的dsRNA結(jié)合能力和沉默抑制子活性不受影響[13]，用缺失P22的ToCV RNA1突變體和完整RNA2侵染本氏煙，依然能夠成功侵染，卻發(fā)現(xiàn)缺失P22會(huì)增加RNA1的積累量，但RNA2的積累量顯著降低，表明P22能夠維持ToCV RNA1和RNA2的平衡[14]。

P22作為病毒的沉默抑制子在病毒的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，目前有關(guān)CCYV P22的研究較少。本研究通過(guò)免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation)篩選與P22互作的候選寄主蛋白，使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)多肽分子進(jìn)行鑒定分析，通過(guò)生物信息學(xué)分析確定下一步研究的8個(gè)蛋白，分別構(gòu)建酵母載體進(jìn)行酵母共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，以確定互作關(guān)系，為闡明P22蛋白在CCYV侵染過(guò)程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物 本氏煙(Nicotianabenthamiana)種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)土傳病害課題組實(shí)驗(yàn)室溫室中。

1.1.2 菌株與載體 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞及農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于莊盟生物公司，酵母Y2H Gold菌株來(lái)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)土傳病害課題組實(shí)驗(yàn)室，均保存于-80 ℃冰箱。pGADT7-T、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGBKT7-P22及pGD3flagP22載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑和儀器 Primerstar Max高保真酶、r-TaqDNA聚合酶、DNA Marker以及抗生素AbA為TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品；一步克隆試劑盒為諾唯贊公司產(chǎn)品；DMSO和高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(eECL Western Blot Kit)為Sigma公司產(chǎn)品；X-α-Gal為北京啟維益成科技有限公司產(chǎn)品；卡那霉素、氨芐霉素、利福平、PVDF膜等為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒為生工生物工程上海股份有限公司產(chǎn)品；其他試劑為進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)分析純。

電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；控溫?fù)u床購(gòu)自上海精宏有限公司；PCR儀為ABI以及Eppendorf產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Proteinsimple產(chǎn)品；高速離心機(jī)、超顯微紫外分光光度計(jì)以及Nanodrop為Thermo產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 免疫沉淀技術(shù)篩選互作候選蛋白 將表達(dá)載體pGD3flagP22轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，挑取單菌落驗(yàn)證正確后搖菌。將含有表達(dá)載體pGD3flagP22的農(nóng)桿菌菌液浸潤(rùn)本氏煙葉片下表皮，2 d后采集浸潤(rùn)葉片；加入提取緩沖液(10%甘油、25 mmol/L Tris(pH值7.5)、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、150 mmol/L NaCl、2%聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、10 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、1×蛋白酶抑制劑、0.1% 乙基苯基聚乙二醇(NP40))，從約2.0 g的本氏煙葉片中提取總蛋白質(zhì)；振蕩混勻后在水平搖床上80 r/min冰浴30 min，4 ℃離心取上清，加入20 μL的FLA-M2單克隆抗體親和凝膠(Sigma-Aldrich)孵育2 h(加入前吸取部分上清液為后續(xù)的檢測(cè)做對(duì)照)；孵育結(jié)束后離心收集瓊脂糖珠，用IP緩沖液(10%甘油、25 mmol/L Tris(pH值7.5)、1 mmol/L EDTA、150 mmol/L NaCl、0.1% NP40)洗滌至少3次，最后在30 μL IP緩沖液中重新懸浮。將IP樣品在95 ℃下加熱10 min，用anti-Flag抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。

1.2.2 LC-MS/MS分析 將Western Blot檢測(cè)后的剩余蛋白質(zhì)樣品送至上海中新新生命科技有限公司進(jìn)行鑒定分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析 對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析整理，利用在線Gene ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，分別從生物過(guò)程(Biological process，BP)、細(xì)胞組分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)描述寄主蛋白的相關(guān)功能。

1.2.4 候選寄主蛋白的引物設(shè)計(jì) 根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果篩選出P22互作候選寄主蛋白后，基于NCBI已經(jīng)發(fā)表的基因序列，通過(guò)DNAMAN軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)閱讀框且攜帶EcoR Ⅰ和XhoⅠ一步克隆酶切位點(diǎn)的引物(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 互作寄主因子全長(zhǎng)閱讀框的擴(kuò)增 選取生長(zhǎng)健康本氏煙葉片為材料，用TRIzol法提取總RNA[15]。用超顯微紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度與純度，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。使用Primerstar Max高保真酶擴(kuò)增候選寄主蛋白全長(zhǎng)閱讀框序列，PCR反應(yīng)體系為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；72 ℃ 10 min。將所獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)PCR純化回收試劑盒回收純化。

1.2.6 互作寄主因子結(jié)構(gòu)域分析 用SMART在線分析(http：//smart.embl-heidelberg.de)預(yù)測(cè)這8個(gè)候選寄主蛋白(SAMS1、SAMS2、PKA、GAPC1、GAPC2、GAPDH-A、ATG3、ATG7)的功能域。

1.2.7 酵母雙雜交載體的構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切載體pGADT7和PCR產(chǎn)物(SAMS1、SAMS2、PKA、GAPC1、GAPC2、GAPDH-A、ATG3、ATG7)，純化回收后將二者通過(guò)一步克隆法連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，篩選并測(cè)序后得到正確的pGADT7表達(dá)載體。

1.2.8 酵母雙雜交技術(shù)驗(yàn)證互作 將正確的pGADT7表達(dá)載體和pGBKT7-P22共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Y2H Gold，以pGADT7-T+pGBKT7-53為陽(yáng)性對(duì)照，pGADT7-T+pGBKT7-Kam、pGADT7+pGBKT7-P22以及pGADT7 +pGBKT7為陰性對(duì)照，研究重組pGADT7表達(dá)載體與pGBKT7-P22之間的相互作用關(guān)系，將含有對(duì)照及樣品的酵母菌分別涂布于含有SD/-Trp/-Leu及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA/X-α-Gal培養(yǎng)基上。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫沉淀技術(shù)篩選互作候選寄主因子及GO功能分析

將通過(guò)anti-Flag磁珠富集的與P22互作的本氏煙總蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，共獲得128個(gè)寄主蛋白。對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)篩選到的與P22蛋白相互作用的寄主蛋白分為39個(gè)功能組，分別屬于生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分三大類別。在生物過(guò)程(BP)類別中光合作用(6個(gè))、蛋白質(zhì)折疊(5個(gè))、葡萄糖代謝過(guò)程(5個(gè))、碳代謝過(guò)程(5個(gè))、S-腺苷甲硫氨酸生物合成過(guò)程(4個(gè))為主要功能組；從分子功能(MF)角度來(lái)看，篩選到的寄主蛋白主要發(fā)揮ATP結(jié)合(32個(gè))、金屬離子結(jié)合(8個(gè))、轉(zhuǎn)移酶活性(6個(gè))、鋅離子的結(jié)合(5個(gè))、蛋白激酶活性(5個(gè))等功能；在細(xì)胞組分(CC)類別中生物膜(11個(gè))、細(xì)胞質(zhì)(7個(gè))、光系統(tǒng)Ⅱ氧化復(fù)合體(5個(gè))、葉綠體(4個(gè))為主要功能組(圖1)。

2.2 互作寄主因子的KEGG功能分析

由于P22蛋白作為CCYV編碼的沉默抑制子發(fā)揮作用，結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果，根據(jù)富集肽段數(shù)目和蛋白質(zhì)功能篩選出8個(gè)候選寄主蛋白(表2)。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息，對(duì)8個(gè)候選寄主蛋白參與的代謝途徑進(jìn)行注釋。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，8個(gè)候選寄主蛋白可能參與或涉及的代謝通路主要包括次生代謝物的生物合成、微生物代謝、碳代謝、氨基酸的生物合成、糖降解/糖異生、光合生物中的碳固定、HIF-1信號(hào)通路、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝等，大類可以歸為寄主體內(nèi)的碳水化合物代謝、能量代謝以及信號(hào)轉(zhuǎn)移等3個(gè)代謝途徑(表3)。其中與代謝通路相關(guān)的蛋白質(zhì)共有6個(gè)，與次生代謝物的生物合成和氨基酸的生物合成相關(guān)的蛋白質(zhì)有5個(gè)，與微生物代謝、碳代謝及光合生物中的碳固定相關(guān)的蛋白質(zhì)有4個(gè)，與糖降解/糖異生和HIF-1信號(hào)通路相關(guān)的蛋白質(zhì)有3個(gè)。

表2 與CCYV P22互作的本氏煙蛋白Tab.2 Proteins in Nicotiana benthamiana interacting with CCYV P22

表3 互作蛋白代謝途徑分析Tab.3 The metabolic pathways analysis of interacted host proteins

2.3 互作寄主因子全長(zhǎng)閱讀框的擴(kuò)增及結(jié)構(gòu)域分析

以本氏煙cDNA為模板，使用Primerstar Max高保真酶PCR擴(kuò)增互作寄主因子的全長(zhǎng)閱讀框，得到8個(gè)特異性條帶(圖2)，純化回收DNA，將其分別構(gòu)建到酵母載體pGADT7上，獲得重組載體。用SMART在線分析(http：//smart.embl-heidelberg.de)預(yù)測(cè)這8個(gè)候選寄主蛋白的功能域(圖3)。SAMS蛋白由3個(gè)S-AdoMet_synt結(jié)構(gòu)域組成，參與碳代謝途徑(圖3-A、B)；PKA蛋白由PGK結(jié)構(gòu)域組成(圖3-C)；GAPC1和GAPC2蛋白由一個(gè)位于N端的Gp_dh_N結(jié)構(gòu)域和位于C端的Gp_dh_C結(jié)構(gòu)域組成(圖3-D、E)；GAPDH-A蛋白由一個(gè)位于N端的Gp_dh_N結(jié)構(gòu)域和位于C端的Gp_dh_C結(jié)構(gòu)域組成，而且在N端還有一個(gè)低復(fù)雜區(qū)(圖3-F)；ATG3蛋白由位于N端的Autophagy_N結(jié)構(gòu)域、位于中間的Autophagy_act_C結(jié)構(gòu)域和位于C端的Autophagy_C結(jié)構(gòu)域組成(圖3-G)；ATG7蛋白由位于N端的ATG7_N結(jié)構(gòu)域和ThiF結(jié)構(gòu)域，以及位于C端的低復(fù)雜區(qū)組成(圖3-H)。

M.DNA Marker；1.SAMS1 PCR產(chǎn)物(1 173 bp)；2.SAMS2 PCR產(chǎn)物(1 173 bp)；3.PKA PCR產(chǎn)物(1 446 bp)；4.GAPC1 PCR產(chǎn)物(1 023 bp)；5.GAPC2 PCR產(chǎn)物(1 014 bp)；6.GAPDH-A PCR產(chǎn)物(1 206 bp)；7.ATG3 PCR產(chǎn)物(960 bp)；8.ATG7 PCR產(chǎn)物(2 142 bp)。

2.4 酵母雙雜交技術(shù)驗(yàn)證互作

將測(cè)序正確的pGADT7重組載體和pGBKT7-P22共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Y2H Gold，結(jié)果表明，酵母菌在二缺培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，說(shuō)明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母菌中，其中pGBKT7-P22/pGADT7-GAPDH-A及陽(yáng)性對(duì)照能夠在缺陷型培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生長(zhǎng)，說(shuō)明GAPDH-A蛋白與P22蛋白有相互作用。進(jìn)一步將其在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA/X-α-Gal培養(yǎng)基培養(yǎng)并觀察，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照和組合pGADT7-GAPDH-A+pGBKT7-P22可以變藍(lán)并生長(zhǎng)，陰性對(duì)照和其他組合變紅且不生長(zhǎng)(圖4)，表明GAPDH-A和P22能夠互作。

3 結(jié)論與討論

CCYV是2010年正式報(bào)道命名的新病毒，該病毒引起的病害發(fā)生重，蔓延快，已經(jīng)成為瓜類作物上的一種重要病害[16]。位于CCYV RNA1 3′末端的P22蛋白已被證實(shí)是CCYV的沉默抑制子[9]，因此，篩選與P22蛋白互作的寄主因子對(duì)明確病毒的侵染機(jī)制有重要意義。

本研究通過(guò)免疫沉淀技術(shù)篩選出8個(gè)互作寄主因子，其中ATG7蛋白未能獲得正確的pGADT7表達(dá)載體，故未進(jìn)行后續(xù)的酵母雙雜交驗(yàn)證。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，篩選到的寄主蛋白涉及10個(gè)具體的代謝途徑分支，其中與代謝通路相關(guān)的蛋白質(zhì)共有6個(gè)，與次生代謝物生物合成和氨基酸生物合成相關(guān)的蛋白質(zhì)有5個(gè)，與微生物代謝、碳代謝及光生物中的碳固定相關(guān)的蛋白質(zhì)有4個(gè)，與糖降解/糖異生和HIF-1信號(hào)通路相關(guān)的蛋白質(zhì)有3個(gè)。說(shuō)明互作的寄主蛋白參與到寄主植物的碳水化合物代謝、能量代謝以及信號(hào)轉(zhuǎn)移等代謝途徑中，從而影響寄主的生長(zhǎng)發(fā)育。

A.SAMS1的功能域；B.SAMS2的功能域；C.PKA的功能域；D.GAPC1的功能域；E.GAPC2的功能域；F.GAPDH-A的功能域；G.ATG3的功能域；H.ATG7的功能域。數(shù)字單位為dal。

圖4 酵母雙雜交檢測(cè)P22與寄主蛋白的相互作用Fig.4 Yeast two-hybrid detection of interaction between P22 and host proteins

通過(guò)酵母雙雜交驗(yàn)證7個(gè)互作寄主因子，結(jié)果顯示，GAPDH-A蛋白與P22蛋白互作。3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是碳代謝中的關(guān)鍵酶之一，催化3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)化為含高能磷酸鍵的1，3-二磷酸甘油酸，進(jìn)一步反應(yīng)生成3-磷酸甘油酸和ATP。近年來(lái)的研究表明，GAPDH具有功能多樣性，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、花粉管萌發(fā)、光合作用和自噬途徑等[17-19]，并且能夠響應(yīng)多種生物和非生物脅迫[20-24]。GAPDH也參與了病毒侵染植物過(guò)程，作為碳代謝中的重要酶，GAPDH促進(jìn)了番茄叢矮病毒(Tomatobushystuntvirus，TBSV)的RNA非正常合成，導(dǎo)致TBSV基因組RNA積累量減少[25]。柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)利用GAPDH與病毒蛋白P23互作，促進(jìn)病毒侵染[26]。同時(shí)，GAPDH還促進(jìn)了黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)復(fù)制酶p1a和p2a的互作[20]。除此之外，木爾坦棉花曲葉病毒衛(wèi)星(CottonleafcurlMultanbetasatellite，CLCuMuB)βC1可以通過(guò)破壞GAPDH與ATP3之間的互作而激活植物自噬[27]。

GAPDH-A蛋白是葉綠體定位GAPDH的一個(gè)亞基，主要位于植物和藻類的葉綠體中，參與卡爾文-本森循環(huán)[28-29]。GAPDH-A可以輔助紅三葉草壞死花葉病毒(Redclovernecroticmosaicvirus，RCNMV)的運(yùn)動(dòng)蛋白MP正確定位于病毒運(yùn)動(dòng)復(fù)制復(fù)合體的膜上，從而完成病毒的侵染[30]。推測(cè)GAPDH-A蛋白可能通過(guò)與P22蛋白互作而促進(jìn)CCYV侵染。同時(shí)P22蛋白與GAPDH-A蛋白互作可能影響其功能，從而影響植物的正常代謝過(guò)程，導(dǎo)致植物出現(xiàn)褪綠黃化癥狀。本研究為進(jìn)一步闡明P22蛋白在CCYV侵染過(guò)程中發(fā)揮的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，有助于解析CCYV的致病機(jī)制。