張萍萍，桂 敏，李慧芳，張美玲，李永忠 ，劉雅婷

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201)

植物病毒病是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，幾乎涉及所有的經(jīng)濟(jì)作物種類，目前侵染植物的病毒超過(guò)1 400 種[1]，植物病毒所造成的植物病害每年造成的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)超過(guò)300 億美元，它們?cè)趯?dǎo)致新發(fā)和再發(fā)植物病害的病原體中占50%[2]。番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)為正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)的代表種，屬于布尼亞病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)。2011年，TSWV 被列為世界十大植物病毒之一，僅次于煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)，位居第二位[3]，可以侵染超過(guò)70 個(gè)植物科的650多種植物[4]。TSWV可以在昆蟲(chóng)媒介薊馬體內(nèi)復(fù)制[5-6]，并且主要通過(guò)薊馬的活動(dòng)在植物間傳播[7]。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)早期是發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)入病毒基因的植物產(chǎn)生對(duì)其他病毒具有抗性的現(xiàn)象[8-9]。近年來(lái)，VIGS 已專門用于指通過(guò)構(gòu)建重組病毒載體來(lái)沉默植物內(nèi)源基因的反向遺傳學(xué)技術(shù)[10-11]，其作用原理是通過(guò)攜帶目的片段的病毒載體侵入植物細(xì)胞后，會(huì)先形成雙鏈RNA，之后會(huì)被特異性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割，形成大約21～24 nt 小分子干擾RNA，之后RNA 聚合酶進(jìn)一步擴(kuò)增siRNA，其與一些蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，之后會(huì)與互補(bǔ)的同源RNA 進(jìn)行配對(duì)，隨后同源RNA 被剪切[12]。VIGS 操作簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備要求低，不像傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因手段需要植物組織培養(yǎng)，傳代純合后才能進(jìn)行深入的基因功能分析，其發(fā)生在RNA 轉(zhuǎn)錄后，不需要遺傳轉(zhuǎn)化，因此大大縮短了植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因功能驗(yàn)證所需要的時(shí)間[13-14]。目前已有大量VIGS 載體應(yīng)用于多種植物，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)植物各個(gè)組織的基因沉默[15-17]。雖然新的基因編輯技術(shù)TALEN[18]以及CRISPR-Cas9[19]已相繼推出，但VIGS 技術(shù)快速簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)決定其在生物研究領(lǐng)域還會(huì)繼續(xù)發(fā)揮作用。煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)介導(dǎo)的VIGS 基因沉默體系與其他病毒載體相比對(duì)寄主影響更小，可以在包括植株生長(zhǎng)點(diǎn)和分生組織的多個(gè)組織器官內(nèi)擴(kuò)散[20]，宿主范圍廣，已廣泛應(yīng)用于茄科植物研究中[21]。TRV 介導(dǎo)的VIGS 體系是將TRV 的基因組RNA1 和RNA2分別構(gòu)入2 個(gè)載體骨架中，沉默載體構(gòu)建只需將目的基因片段插入RNA2 鏈上的多克隆酶切位點(diǎn)區(qū)[22-23]。八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturae，PDS)是類胡蘿卜素合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，該基因沉默后，葉片出現(xiàn)白化癥狀，通常在VIGS 實(shí)驗(yàn)中作為報(bào)告基因[24-26]。

NSm 蛋白是由TSWV 的M RNA 鏈正向編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白，分子量為33.8 ku。早期的定位研究發(fā)現(xiàn)：NSm 蛋白定位于葉片的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及胞間連絲，而在昆蟲(chóng)體內(nèi)主要集中在各個(gè)細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)上和細(xì)胞質(zhì)中的纖維狀聚集體上[27-28]，之后LEWANDOWSKI 等[29]證實(shí)NSm 是TSWV的運(yùn)動(dòng)蛋白，涉及病毒在植物細(xì)胞間的長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)，2015 年LEASTRO 等[30]證明TSWV 的NSm蛋白可以和N 蛋白相互作用形成二聚體，這種相互作用不僅是TSWV 長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵，還會(huì)影響病毒的生命周期。

本研究通過(guò)構(gòu)建靶向TSWV 的NSm基因的沉默載體pTRV2-NSm，注射辣椒(Capsicum annuumL.)后接種TSWV，辣椒表型顯示注射pTRV2-NSm沉默載體的植株新葉無(wú)癥狀；qRT-PCR 分析結(jié)果顯示：TRV 介導(dǎo)的VIGS 沉默體系對(duì)TSWV的NSm基因確實(shí)起到了沉默作用，且沉默效果很好。本研究旨在為VIGS 技術(shù)在植物病毒防控中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)植物寄主為辣椒(C.annuumL.) (湘研十一號(hào))，TSWV (TSWV-YN)毒源是在本氏煙(Nicotiana benthamiana)上進(jìn)行傳代培育；VIGS體系所用的病毒載體pTRV1 和pTRV2 均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院陳小姣老師惠贈(zèng)。

1.2 辣椒葉片總RNA 提取及目的基因片段擴(kuò)增

用TRNzoL-A+總RNA 提取試劑(天根生化科技有限公司，北京)提取采集葉片樣品的總RNA；選用HiScript Ⅱ 1st strand cDNA Synthesis Kit (諾唯贊生物科技有限公司，南京)對(duì)上述得到的RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI 中TSWV的NSm基因序列(GenBank 登錄號(hào)：JF 960236.1)和辣椒的PDS基因序列(GenBank 登錄號(hào)：X68 058)設(shè)計(jì)引物，本試驗(yàn)選取的插入片段為NSm基因的107～426 bp 和PDS基因的815～1 144 bp，片段上、下游分別加入酶切位點(diǎn)EcoRI 和KpnI，目的片段擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1，并根據(jù)NCBI上TRV2 序列的注釋信息(GenBank 登錄號(hào)：Z36974)合成上游引物 pTRV2-F：TGGGAGATGATACGCTGTT。

表1 目的片段擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for amplification of target fragments

使用Prime STAR Max Premix (2×)高保真酶(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，北京)擴(kuò)增目的片段，PCR 反應(yīng)體系為：Prime STAR Max Premix (2×) 25 μL，正向引物和反向引物各2.5 μL，cDNA 2.5 μL，補(bǔ)充ddH2O 總體積至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性20 s，98 ℃變性10 s，50 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 VIGS 重組載體的構(gòu)建

TSWV 的NSm基因片段擴(kuò)增回收產(chǎn)物、辣椒的PDS基因片段擴(kuò)增回收產(chǎn)物和pTRV2-00，同時(shí)采用限制性內(nèi)切酶EcoRI 和KpnI 進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物分別回收，用T4 DNA 連接酶在16 ℃下反應(yīng)4 h，采用熱激轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α (擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，北京)。PCR 篩選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證(生工生物工程有限公司，上海)，序列正確的載體即為VIGS 所需的重組沉默載體pTRV2-PDS和pTRV2-NSm。

1.4 農(nóng)桿菌注射及TSWV 接種

將沉默載體pTRV2-PDS和pTRV2-NSm通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，在卡那霉素(50 μg/mL)和利福平(25 μg/mL)抗性條件下篩選轉(zhuǎn)化子，PCR 鑒定呈陽(yáng)性的克隆菌液即為本試驗(yàn)所需的農(nóng)桿菌單克隆。

得到VIGS 所需的攜帶有TRV 重組載體的農(nóng)桿菌后，在帶有抗性的YEB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.6 (需2～3 d)，取等體積轉(zhuǎn)入pTRV1的農(nóng)桿菌重懸液分別與帶有pTRV2-00、pTRV2-PDS以及pTRV2-NSm的農(nóng)桿菌重懸液進(jìn)行混合。在辣椒的4 葉期進(jìn)行農(nóng)桿菌葉背注射。為驗(yàn)證VIGS 沉默體系設(shè)計(jì)如下試驗(yàn)：一組辣椒注射帶有pTRV2-00 載體的混合菌液，另一組辣椒注射帶有pTRV2-PDS載體的混合菌液，還有一組辣椒不做任何處理。7 d 后開(kāi)始觀察辣椒植株情況并拍照記錄。

為驗(yàn)證VIGS 體系是否能在辣椒中沉默TSWV的NSm基因并使辣椒產(chǎn)生抗性，設(shè)計(jì)對(duì)比試驗(yàn)：一組辣椒注射帶有pTRV2-00 的混合菌液，另一組辣椒注射帶有pTRV2-NSm載體的混合菌液。4 d 后摩擦接種TSWV，7 d 后開(kāi)始觀察辣椒植株情況并拍照記錄。

1.5 TSWV NSm 基因的沉默效果檢測(cè)

運(yùn)用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)接種TSWV 病毒22 d后新葉(接近生長(zhǎng)點(diǎn))中NSm的表達(dá)量。對(duì)照組為注射帶有pTRV2-00 辣椒植株，重復(fù)4 次。將采集的樣本分別提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以辣椒的cDNA 為模板，對(duì)NSm基因的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，qRT-PCR 采用SYBR?Premix ExTaq? II (Tli RNaseH Plus)試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，北京)，使用辣椒的Actin基因(GenBank 登錄號(hào)：GQ339766.1)做內(nèi)參，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。因?yàn)樘幚斫M的辣椒中轉(zhuǎn)入了NSm基因的107～426 bp片段，設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物擴(kuò)增片段避開(kāi)了這一區(qū)域，具體qRT-PCR 引物見(jiàn)表2。qRT-PCR 反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaqII (2×)加入10 μL，前引物(10 μmol/L)以及后引物(10 μmol/L)各加1 μL，cDNA 模板2 μL，加入0.4 μL 的ROX Reference Dye II (50×)進(jìn)行儀器校正，最后加ddH2O總體積至20 μL。qRT-PCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃30 s，之后95 ℃ 3 s，以及60 ℃ 30 s，循環(huán)次數(shù)設(shè)為40。統(tǒng)計(jì)結(jié)果經(jīng)SPSS 17.0 分析軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量引物Tab.2 Primers for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒總RNA 的提取

采樣后提取樣品的總RNA，并采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由圖1 所示：可以觀察到3 條明亮的條帶(從上至下依次為28S、18S、5S)，說(shuō)明提取的RNA 完整性很好，可進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

圖1 辣椒總RNA)Fig.1 Total RNAs of pepper

2.2 VIGS 重組載體的構(gòu)建

本試驗(yàn)共需構(gòu)建2 個(gè)VIGS 重組載體。靶向辣椒PDS基因的沉默載體pTRV2-PDS以及靶向TSWVNSm基因的沉默載體pTRV2-NSm。擴(kuò)增的PDS片段長(zhǎng)度為330 bp，NSm片段長(zhǎng)度為320 bp。PCR 結(jié)果顯示：2 個(gè)重復(fù)都擴(kuò)增出單一條帶，并且條帶大小與預(yù)測(cè)相符(圖2a)；NSm目標(biāo)片段擴(kuò)增電泳條帶大小與預(yù)測(cè)相符，并且陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出條帶(圖2b)。說(shuō)明PDS和NSm2 個(gè)目標(biāo)片段都擴(kuò)增成功。

圖2 目標(biāo)片段擴(kuò)增)Fig.2 PCR of target fragments

2 個(gè)目標(biāo)片段PCR 產(chǎn)物電泳切膠回收后用限制性內(nèi)切酶EcoRI 和KpnI 進(jìn)行雙酶切，同時(shí)pTRV2 也用EcoRI 和KpnI 進(jìn)行雙酶切，酶切后的2 個(gè)目標(biāo)片段分別與酶切好的pTRV2 病毒載體用T4 DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行PCR 檢測(cè)，PCR 所用的引物為pTRV2-F 和插入的目標(biāo)片段的擴(kuò)增后引物。pTRV2-PDS擴(kuò)增片段為505 bp，pTRV2-NSm擴(kuò)增片段為495 bp。電泳結(jié)果(圖3)顯示擴(kuò)增出的單一條帶大小均與預(yù)期相符。將pTRV2-PDS載體的2#、3#和4#單克隆與pTRV2-NSm載體的1#、2#和3#單克隆進(jìn)行測(cè)序(生工生物工程有限公司，上海)，測(cè)序引物為pTRV2-F，測(cè)序結(jié)果顯示：2 個(gè)載體的3 個(gè)單克隆峰圖單一且序列完全正確，說(shuō)明載體pTRV2-PDS和pTRV2-NSm均構(gòu)建成功。

圖3 重組載體菌液PCR 驗(yàn)證)Fig.3 PCR identification of reconstructed vectors

2.3 VIGS 對(duì)辣椒PDS 基因沉默的有效性驗(yàn)證

由圖4 所示：本研究用注射攜帶pTRV2-00 載體農(nóng)桿菌的辣椒植株，培養(yǎng)22 d 后與未處理植株相比無(wú)明顯癥狀，說(shuō)明注射pTRV2-00載體對(duì)辣椒的生長(zhǎng)沒(méi)有產(chǎn)生影響；而注射攜帶有PDS沉默載體的辣椒植株，約22 d 時(shí)植株葉片出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，最開(kāi)始出現(xiàn)在葉脈處，隨著植株的生長(zhǎng)，白化現(xiàn)象逐步擴(kuò)展到整個(gè)葉片，隨著接種沉默載體時(shí)間的延長(zhǎng)新葉全部白化，說(shuō)明病毒載體成功侵入辣椒體內(nèi)，并沉默了辣椒的PDS基因，使葉片白化但對(duì)植株發(fā)育無(wú)明顯影響。

圖4 注射TRV 載體后的辣椒表型)Fig.4 Phenotype of pepper inoculated with TRV vectors

2.4 辣椒注射沉默載體pTRV2-NSm 后對(duì)TSWV抗性表型評(píng)估

由圖5 所示：注射pTRV2-00 載體和pTRV2-NSm沉默載體的辣椒植株在22 d 時(shí)出現(xiàn)了明顯的表型差異，先注射pTRV2-00 載體后接種TSWV辣椒植株的新葉及老葉都出現(xiàn)黃化斑，而先注射沉默載體pTRV2-NSm后接種TSWV 的辣椒植株的新葉無(wú)癥狀，老葉只在葉邊緣出現(xiàn)黃化斑。說(shuō)明注射沉默載體pTRV2-NSm的辣椒植株對(duì)TSWV 表現(xiàn)出一定的抗性。

圖5 注射TRV 沉默載體后接種TSWV 的辣椒植株表型)Fig.5 Phenotype of peppers inoculated with TSWV after injection with TRV vectors

2.5 沉默載體pTRV2-NSm 對(duì)TSWV NSm 基因的沉默效果

利用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)注射了沉默載體pTRV2-NSm的辣椒植株對(duì)TSWVNSm基因的沉默效果，結(jié)果(圖6)表明：注射了沉默載體pTRV2-NSm的辣椒在接種TSWV 后與對(duì)照組相比，NSm的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的4.6%±5.3% (mean±SD)，具有極顯著差異(P＜0.001)。結(jié)果表明：沉默載體pTRV2-NSm在辣椒上能夠高效沉默TSWV 的NSm基因。

圖6 沉默植株中NSm 基因的相對(duì)表達(dá)量)Fig.6 The relative expression of gene NSm in silenced peppers

3 討論

目前，防控植物病毒病的方法很多，但都存在一些缺點(diǎn)。如傳統(tǒng)的田間管理費(fèi)時(shí)耗力，在小農(nóng)經(jīng)濟(jì)中比較實(shí)用，不易大面積推廣；化學(xué)制劑往往使用不易降解的化學(xué)物質(zhì)，存在化學(xué)物質(zhì)的殘留以及污染的風(fēng)險(xiǎn)[31]；生物來(lái)源抗毒物質(zhì)仍處于試驗(yàn)階段，生產(chǎn)應(yīng)用中少有推廣；選育抗性品種就是篩選抗性基因培育優(yōu)良品種，目前篩選抗性基因仍十分困難，針對(duì)TSWV 的抗性基因只有辣椒(C.chinense，PI 152225 line)的Tsw基因和番茄(Lycopersicon esculentum，89R line)的Sw-5基因[32-33]，對(duì)于更多植物病毒這種方法顯得不夠高效；轉(zhuǎn)基因手段能快速獲得性狀優(yōu)良的抗性品種，目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)已非常成熟，轉(zhuǎn)入的病毒基因片段可以使植株得到相應(yīng)的抗性，但轉(zhuǎn)基因手段存在基因漂移的風(fēng)險(xiǎn)，插入1 個(gè)外源片段對(duì)于物種在進(jìn)化上的作用來(lái)說(shuō)短時(shí)間內(nèi)無(wú)法進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的倫理道德問(wèn)題也引發(fā)人們的關(guān)注，因此對(duì)轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度[34-35]。VIGS 的優(yōu)勢(shì)由此得以體現(xiàn)。首先，VIGS 是一種不遺傳的基因沉默技術(shù)；其次，VIGS 導(dǎo)入的不是基因全序列而是小片段，避免基因表達(dá)對(duì)植株的影響；第三，VIGS 體系的基因沉默周期短[36]。因此，將VIGS 應(yīng)用于植物病毒防控具有廣泛前景。

本研究通過(guò)VIGS 體系來(lái)沉默TSWV 的NSm基因，驗(yàn)證了沉默載體pTRV2-PDS對(duì)辣椒PDS基因的沉默效果，辣椒葉片在接種沉默載體22 d后開(kāi)始出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，漂白首先出現(xiàn)在新葉附近葉片的葉脈，后逐步擴(kuò)張到整個(gè)葉片，幾天后長(zhǎng)出的新葉全部白化。

本研究表明：先注射pTRV2-00 載體4 d 后接種TSWV 的辣椒植株的新葉以及老葉均出現(xiàn)黃化斑；而先注射沉默載體pTRV2-NSm后接種TSWV 的辣椒植株新葉無(wú)癥狀，只在老葉的葉尖部位出現(xiàn)黃化斑，病斑分布與沉默了PDS基因辣椒的白化區(qū)域互補(bǔ)，可能是由于TRV 介導(dǎo)的VIGS體系在靠近生長(zhǎng)點(diǎn)的位置沉默效果最好[20]，導(dǎo)致靠近這個(gè)位置的白化最明顯，辣椒也是在這一區(qū)域表現(xiàn)為無(wú)病癥。qRT-PCR 結(jié)果顯示：沉默載體pTRV2-NSm能夠高效沉默TSWV 的NSm基因。雖檢測(cè)到有少量的NSm表達(dá)，但新葉無(wú)癥狀，可能是由于雖然有少量NSm 蛋白協(xié)助TSWV進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)，但是TSWV 的積累量較少，因此葉片無(wú)癥狀。在注射pTRV2-NSm沉默載體4 d 后接種TSWV，雖新葉無(wú)癥狀但老葉有癥狀，可能是由于VIGS 沉默體系起作用需要一定的時(shí)間，間隔接種的時(shí)間不同，達(dá)到的沉默效果也會(huì)不同。之前用于植物病毒防控的基因沉默大都是針對(duì)植物內(nèi)源基因[37]或病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[38]，而本研究的沉默載體靶向非結(jié)構(gòu)蛋白基因NSm，接種沉默載體后辣椒對(duì)TSWV 具有抗性，說(shuō)明非結(jié)構(gòu)蛋白基因也可作為防控病毒的靶基因。

通過(guò)TRV 介導(dǎo)的VIGS 體系沉默了TSWV的NSm基因，而如何達(dá)到更好的防治效果需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證，例如VIGS 與病毒接種所需的間隔時(shí)間以及TSWV 基因片段的選擇。本研究還驗(yàn)證：利用NSm的107～426 bp 片段插入TRV 載體對(duì)NSm基因沉默可以起到一定的抗TSWV 效果，使得通過(guò)基因沉默培育抗性品種過(guò)程中篩選目標(biāo)基因以及插入片段過(guò)程變得更加簡(jiǎn)便。研究者們可以先通過(guò)VIGS 快速篩選出最合適的基因片段，然后構(gòu)建轉(zhuǎn)基因抗性植株。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了pTRV2-NSm載體，注射帶有pTRV2-NSm農(nóng)桿菌的辣椒可以高效沉默TSWV的NSm基因，進(jìn)而抑制TSWV 在辣椒上的傳播，使辣椒對(duì)TSWV 產(chǎn)生一定的抗性。