田明（湖北省榮軍醫(yī)院藥劑科，武漢 430079）

血美安膠囊收載于2020年版《中國藥典》一部成方制劑和單味制劑部分，是由豬蹄甲、赤芍、牡丹皮、地黃4 味中藥加工制成的復(fù)方制劑，具有清熱養(yǎng)陰、涼血活血作用，用于原發(fā)性血小板減少性紫癜血熱傷陰挾瘀癥，癥見皮膚紫癜、齒衄、鼻衄、月經(jīng)過多、口渴、煩熱、盜汗等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明血美安聯(lián)用其他藥物治療特發(fā)性血小板減少性紫癜有較好療效[2-3]，還可用于治療乙型肝炎病毒相關(guān)血小板減少癥[4]。血美安膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有芍藥苷和丹皮酚的含量測定項目，但該標(biāo)準(zhǔn)是2002年申報新藥時制訂的，且芍藥苷和丹皮酚不是同時檢測，耗費時間。因此，有必要對血美安膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升研究。研究表明，豬蹄甲主要含蛋白質(zhì)、氨基酸等成分，赤芍含芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷等活性成分，牡丹皮含丹皮酚、芍藥苷、沒食子酸等活性成分，地黃含梓醇、二氫梓醇、毛蕊花糖苷等活性成分[5-8]。赤芍、牡丹皮、地黃藥材的質(zhì)量控制方法報道較多，但未見同時測定血美安膠囊中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚4 種成分的報道[9-11]。沒食子酸具有抗氧化、保護(hù)心腦血管、抗炎、保肝等藥理活性，氧化芍藥苷、芍藥苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝、保護(hù)神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)靜催眠等多種藥理活性，丹皮酚具有抗動脈粥樣硬化、舒血管與降壓、抗心律失常、抗腦缺血等作用[12-15]。上述4 種成分為赤藥和牡丹皮的主要活性成分，赤芍具有清熱涼血、散瘀止血的功效，牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀的功效，共同發(fā)揮清熱、活血涼血的作用。本研究建立UPLC 法同時測定血美安膠囊中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的含量，為其質(zhì)量控制提供簡便、快速可靠的檢測方法。

1 儀器與試藥

超高效液相色譜儀（型號：ACQUITY UPLC H-CLASS，美國Waters 公司）；XSE205DU 十萬分之一電子天平、ME204T/02 萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；超聲波清洗器（型號：DTC-27，功率：700W，頻率：40 kHz，湖北鼎泰高科有限公司）。

對照品沒食子酸（批號：110831-201906，純度：91.5%）、芍藥苷（批號：110736-202044，純度：96.8%）、丹皮酚（批號：110708-201908，純度：99.8%）（中國食品藥品檢定研究院），氧化芍藥苷[批號：ST132301，純度：98.0%，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司]。血美安膠囊樣品（規(guī)格：0.27 g/粒，批號：190601、190602、190603、190604，湖北民康制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液

精密稱取各對照品適量，加入80%乙醇溶解，配制成含沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚分別為0.84、0.75、1.41、1.18 mg·mL－1的單一對照品儲備液。精密吸取各對照品儲備液適量，用80%乙醇稀釋成含沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚分別為42.05、37.60、70.70、59.05 μg·mL－1的混合對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液

取血美安膠囊適量，稱取約0.5 g，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，再加35 mL 80%的乙醇溶液，超聲（700 W，40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，用80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性樣品溶液

按血美安膠囊的處方工藝制備缺赤芍、牡丹皮的陰性樣品，再按“2.2”項下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.4 色譜條件及系統(tǒng)適用性考察

采用Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，柱溫30℃；以0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相，線性梯度洗脫（0～5 min，6%B；5～6 min，6%→15%B；6～8 min，15%B；8～13 min，15%→18%B；13～15 min，18%～25%B；15～17 min，25%～26%B；17～19 min，26%～27%B；19～24 min，27%～31%B；24～27 min，31%～33%B；27～35 min，33%～37%B；35～38 min，37%～6%B；38～40 min，6%B）；體積流量為0.20 mL·min－1，檢測波長為230 nm，進(jìn)樣量為2 μL。各待測成分的峰之間的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10 000。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液（A）、供試品溶液（B）與缺芍藥、牡丹皮的陰性樣品溶液（C）的UPLC 圖Fig 1 UPLC chromatogram of mixed control（A），sample（B）and negative sample（C）

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1”項下單一對照品儲備液適量，用80%乙醇稀釋成含沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚分別為168.20、150.40、282.80、236.20 μg·mL－1的混合對照品溶液，再吸取混合對照品溶液0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別置于10 mL 的量瓶中，加80%乙醇溶液定容，搖勻，配制成系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液；按“2.4”項下色譜條件分別進(jìn)樣2 μL，測定各成分的峰面積。以各成分的質(zhì)量濃度X（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，平均峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程；以信噪比（S/N）3∶1 和10∶1 為基準(zhǔn)測定，分別計算上述各成分的檢測限和定量限，結(jié)果見表1。

表1 4 種成分的線性關(guān)系(n＝6)Tab 1 Linearity correlation of 4 components

2.6 精密度試驗

精密吸取線性關(guān)系第3 點的混合對照品溶液2 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄各成分的峰面積并計算RSD值。結(jié)果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚峰面積的RSD（n＝6）分別為0.64%、0.59%、0.98%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

分別精密稱取血美安膠囊（批號：190601）樣品6 份，按“2.2”項下方法配制6 份試品溶液，各進(jìn)樣2 μL，記錄沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的峰面積，代入“2.5”項下線性回歸方程，計算各成分的含量。結(jié)果樣品中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的平均含量分別為3.23、1.48、4.81、4.07 mg·g－1，RSD依次為0.39%、0.81%、0.21%、0.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液（批號：190601），分別在放置0、3、6、12、18、24 h 后，精密吸取2μL，進(jìn)樣分析，記錄沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚色譜峰的峰面積值，計算得各成分的RSD分別為0.48%、1.1%、0.37%、0.67%，表明供試品溶液中各成分在放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.9 加樣回收試驗

取已知含量的血美安膠囊9 份，每份約0.25 g，精密稱定，每3 份作為一組，分別置50 mL量瓶中，精密加入一定量的沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的對照品儲備液，按“2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.4”項下色譜條精密吸取2 μL，進(jìn)樣分析，記錄各成分的峰面積，計算平均回收率，沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚平均回收率在96.1%～101.5%，RSD均小于1.5%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.10 樣品測定

取不同批次血美安膠囊樣品各3 份，分別制備成供試品溶液，精密吸取2 μL，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并采用“2.5”項下回歸方程計算沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的含量，結(jié)果見表2。

表2 4 種成分的含量測定結(jié)果(mg·g－1，n＝3)Tab 2 Content determination of 4 components (mg·g－1，n＝3)

3 討論

本試驗利用PDA 檢測器分別提取了沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的紫外全波長掃描圖譜，發(fā)現(xiàn)氧化芍藥苷、芍藥苷在230 nm波長處有強(qiáng)吸收，沒食子酸、丹皮酚在230 nm、273 nm 處附近有強(qiáng)吸收，273 nm 波長下，氧化芍藥苷、芍藥苷吸收較弱，230 nm 波長檢測時，基線穩(wěn)定，各成分峰形較好，雜質(zhì)干擾小，因此選擇230 nm 作為檢測波長。

本試驗在流動相系統(tǒng)考察時，發(fā)現(xiàn)等度洗脫時所測的4 個成分與旁邊峰難以達(dá)基線分離；用甲醇作為有機(jī)相時，各成分峰較寬，拖尾嚴(yán)重；用乙腈作為有機(jī)相時，被測4 個成分的分離度符合要求，峰形窄且對稱性好。試驗進(jìn)行耐用性考察時，分別考察了不同流速（0.18、0.2、0.22 mL·min－1）和不同柱溫（25、30、35℃），發(fā)現(xiàn)流速、柱溫的改變對分離效果及含量結(jié)果影響不大；分別考察了Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 柱、Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）柱、ZORBAX RRHD SB-C18（2.1×50 mm，1.8 um）柱及Hypersil GOLD C18（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）柱，發(fā)現(xiàn)不同品牌型號的色譜柱對分離效果影響較大，最終選擇了更合適的Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）柱進(jìn)行檢測分析。

本試驗對血美安膠囊供試品溶液的制備方法進(jìn)行了系統(tǒng)考察，比較了超聲和回流兩種提取方法，發(fā)現(xiàn)回流提取時溶液黏度大，不好濾過，因此采用超聲處理方法，進(jìn)一步對超聲10、20、30、40、60 min 進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min，所測成分基本提取完全，最終確定超聲處理時間為30 min。試驗過程中對乙醇、甲醇、80%乙醇、50%乙醇、水等不同濃度的提取溶劑進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)80%乙醇作為提取溶劑時，提取率高，且水溶性多糖、蛋白質(zhì)、淀粉不被溶出，分析時能避免其堵塞色譜柱，因此選擇80%乙醇作為血美安膠囊供試品的提取溶劑。

本試驗首次采用UPLC 法同時測定血美安膠囊中的4 種成分，結(jié)果所測4 批血美安膠囊樣品沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的平均含量分別為3.03、1.50、4.78、4.13 mg·g－1，總量均大于13.0 mg·g－1，比原標(biāo)準(zhǔn)僅控制芍藥苷和丹皮酚的含量更全面，建立的血美安膠囊含量測定方法簡便、快速，重復(fù)性好，可為血美安膠囊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。