劉峰，趙榮麗，王璐（.四川省藥品檢驗(yàn)研究院，成都 673，.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，成都6003）

利奈唑胺（linezolid）是美國(guó)Pfizer 公司研發(fā)的第一個(gè)噁唑烷酮類抗菌藥物，化學(xué)名為N-[[（5S）-3-[3-氟-4-（4-嗎啉基）苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]乙酰胺，其2000年獲得美國(guó)FDA 批準(zhǔn)，用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染，包括由金黃色葡萄球菌引起的疑似或確診院內(nèi)獲得性肺炎、社區(qū)獲得性肺炎、復(fù)雜性皮膚或皮膚軟組織感染以及耐萬古霉素腸球菌感染。利奈唑胺為細(xì)菌蛋白質(zhì)合成抑制劑，作用于細(xì)菌50S 核糖體亞單位的作用部位。由于其作用部位和方式獨(dú)特，故不易與其他抑制蛋白合成的抗菌藥物發(fā)生交叉耐藥，在體外也不易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[1-3]。利奈唑胺臨床應(yīng)用文獻(xiàn)報(bào)道較多，臨床關(guān)注度高，但其藥學(xué)研究尤其質(zhì)量控制內(nèi)容較少。

利奈唑胺有多條合成路線，（S）-N-（2-乙酰氧基-3-氯丙基）乙酰胺（[（2S）-1-acetamido-3-chloropropan-2-yl]acetate，以下簡(jiǎn)稱ACPA）是原研工藝中的關(guān)鍵中間體，利奈唑胺多通過這個(gè)關(guān)鍵中間體合成[2-4]。ACPA 的合成會(huì)用到（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇，該物質(zhì)具有基因毒性警示結(jié)構(gòu)[4-9]，可能在ACPA 中殘留，導(dǎo)致在終產(chǎn)品利奈唑胺中殘留。目前（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇的測(cè)定方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道[10-13]，本文所建方法靈敏度高、方法簡(jiǎn)便可靠、適用性強(qiáng)，可為利奈唑胺的質(zhì)量控制提供參考，采用遺傳毒性雜質(zhì)過程控制和終產(chǎn)品控制的質(zhì)控理念，充分保障利奈唑胺臨床使用的安全性。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-30 系列高效液相色譜儀（日本島津公司）；API 4000 三重四極桿質(zhì)譜儀，軟件版本：Analyst Version：1.6.3（美國(guó)AB Sciex 公司）；CPA255D 十萬分之一天平（德國(guó)賽多利斯公司）；XA205DU 十萬分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；BioHit 移液槍（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 試藥

（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽對(duì)照品（PCL 公司，批號(hào)：PCL-#-Am2333，含量：100%）；ACPA 樣品（成都海亞特科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：170901、181101、190101）；利奈唑胺樣品（四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：171001、171002、171003）；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸甲醇溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，20%B；2～6 min，20%→90%B；6～8 min，90%B；8～9 min，90%→20%B；9～10 min，20%B），流速0.3 mL·min－1，柱溫35℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源正離子模式（ESI＋），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）測(cè)定，氣簾氣30 psi，GS1 50 psi，GS2 50 psi，IS 5500，TEM 500℃，定量離子對(duì)為質(zhì)荷比（m/z）110.0→91.9，DP 41，CE 14，CXP 5，EP 8，定性離子對(duì)為m/z110.0→56.1，DP 41，CE 20，CXP11，EP 8。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱?。⊿）-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽對(duì)照品11.04 mg [相當(dāng)于（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇8.36 mg]，用50%甲醇溶液溶解并稀釋制成（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇質(zhì)量濃度約為0.8 mg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用50%甲醇溶液稀釋成約0.04 μg·mL－1的對(duì)照品溶液。

2.3.2 靈敏度試驗(yàn)溶液的制備 精密量取對(duì)照品溶液1 mL 置10 mL 量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度試驗(yàn)溶液。

2.3.3 利奈唑胺供試品溶液的制備 精密稱取利奈唑胺適量，用50%甲醇溶解并稀釋成約3.5 mg·mL－1的溶液，作為供試品溶液。

2.3.4 ACPA 供試品溶液的制備 精密稱取ACPA 適量，用50%甲醇溶解并稀釋成約為0.1 mg·mL－1的溶液，作為供試品溶液。

2.4 專屬性與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取空白溶劑（50%甲醇溶液）、利奈唑胺供試品溶液、ACPA 供試品溶液、對(duì)照品溶液與靈敏度試驗(yàn)溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果空白溶劑不干擾待測(cè)組分測(cè)定；利奈唑胺在此條件下無質(zhì)譜峰出現(xiàn)，ACPA 有質(zhì)譜峰，但不干擾（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇的測(cè)定；靈敏度試驗(yàn)溶液中定量離子峰的信噪比大于10。

圖1 典型質(zhì)譜圖Fig 1 Typical mass spectrum

2.5 線性關(guān)系考察

取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，得系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析。以（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)（x），相應(yīng)峰面積作為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇在0.836～208.989 ng·mL－1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，y＝5.283×103x＋6.79×103，r＝0.9996。

2.6 檢測(cè)限與定量限考察

精密量取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，以50%甲醇溶液逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣分析，記錄質(zhì)譜圖。以信噪比（S/N）約為3 時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限（LOD），S/N約為10 時(shí)的質(zhì)量濃度作為定量限（LOQ），結(jié)果LOD 為0.279 ng·mL－1，LOQ 為0.774 ng·mL－1。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、“2.6”項(xiàng)下LOQ 溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，考察進(jìn)樣精密度和定量限精密度，結(jié)果（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇峰面積的RSD分別為0.80%、3.6%，表明本法進(jìn)樣精密度、定量限精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、利奈唑胺供試品溶液和ACPA 供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，考察溶液穩(wěn)定性。結(jié)果對(duì)照品溶液中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇峰面積的RSD為2.3%，利奈唑胺供試品溶液和ACPA 供試品溶液中均未檢出（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇，表明各溶液在20 h 內(nèi)均穩(wěn)定。

2.9 加標(biāo)重復(fù)性試驗(yàn)

取利奈唑胺（批號(hào)：171001）樣品，ACPA（批號(hào)：190101）樣品適量，各6 份，按“2.10.1”項(xiàng)下準(zhǔn)確度100%樣品制備方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，考察加標(biāo)重復(fù)性。結(jié)果利奈唑胺中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇平均含量為11.45 μg·g－1，RSD為0.75%（n＝6），ACPA 樣品中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇平均含量為0.041%，RSD為2.3%（n＝6）。表明本法重復(fù)性良好。

2.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密量取“2.3”項(xiàng)下（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置200 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品準(zhǔn)確度溶液①；再精密量取5 mL，置50 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品準(zhǔn)確度溶液②。

2.10.1 利奈唑胺準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱取利奈唑胺樣品（批號(hào)：171001）約35 mg，共9 份，置10 mL 量瓶中，分別精密加入對(duì)照品準(zhǔn)確度溶液②0.5、1.0、1.5 mL，各3 份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備準(zhǔn)確度試驗(yàn)50%、100%、150%的供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。

2.10.2 ACPA 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱取ACPA 樣品（批號(hào)：190101）約10 mg，共9 份，置100 mL量瓶中，分別精密加入對(duì)照品準(zhǔn)確度溶液①0.5、1.0、1.5 mL，各3 份，按“2.3.4”項(xiàng)下方法制備準(zhǔn)確度試驗(yàn)50%、100%、150%的供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。

結(jié)果利奈唑胺中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇的高、中、低濃度平均回收率分別為96.6%（RSD＝1.1%）、97.6%（RSD＝1.3%）、97.5%（RSD＝0.52%）。ACPA 中（S）-1-氨 基-3-氯-2-丙醇的高、中、低濃度平均回收率分別為101.6%（RSD＝1.6%）、101.8%（RSD＝2.2%）、105.6%（RSD＝1.3%）。

2.11 耐用性試驗(yàn)

取利奈唑胺（批號(hào)：171001）和ACPA（批號(hào)：190101）樣品，分別按“2.10.1”項(xiàng)下準(zhǔn)確度100%供試品溶液制備方法配制加標(biāo)供試品，按以下方式處理：① 考察流速0.2、0.4 mL·min－1；② 考察柱溫30、40℃；③ 考察梯度洗脫程序：梯度為0～2 min，15%B；2～6 min，15%→90%B；6～8 min，90%B；8～9 min，90%→15%B；9～10 min，15%B；和梯度為0～2 min，25%B；2～6 min，25%→90%B；6～8 min，90%B；8～9 min，90%→25%B；9～10 min，25%B。結(jié)果利奈唑胺加標(biāo)供試品溶液中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇含量平均值為11.61 μg·g－1，RSD為1.6%；ACPA 加標(biāo)供試品溶液中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇含量平均值為0.040%，RSD為1.9%，表明色譜條件發(fā)生一定變化時(shí)本法耐用性良好。

2.12 毒性雜質(zhì)的含量測(cè)定

取利奈唑胺樣品與ACPA 樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果3 批利奈唑胺均未檢出（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇；170901、181101 批ACPA 中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇含量分別為0.043%、0.006%，190101 批ACPA 中未檢出。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的篩選

（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇分子結(jié)構(gòu)中無生色基團(tuán)，無明顯紫外吸收，且具有基因毒性警示結(jié)構(gòu)。其控制限度較低，故采用靈敏度較高的液質(zhì)聯(lián)用法（UPLC-MS/MS）進(jìn)行測(cè)定。先采用針泵注射進(jìn)樣方式，利用質(zhì)譜儀對(duì)待測(cè)物的準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子的DP、EP、EP、CXP 值分別進(jìn)行優(yōu)化。由于（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇的對(duì)照品為其鹽酸鹽，在溶液中氯離子與（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇解離，因此準(zhǔn)分子離子峰選擇m/z110.0，定量離子選擇豐度較高的m/z91.9，定性離子選擇豐度稍低的m/z56.1。

首先采用Waters ACQuity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱，以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，0.1%甲酸甲醇溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其在該色譜柱上幾乎無保留，在0.5 min 左右即出峰，出峰時(shí)間太早。更換Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，并調(diào)整梯度程序，（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇在約1.7 min 時(shí)出峰，ACPA 在約5.5 min 時(shí)出峰，峰形較好，空白溶劑無干擾，ACPA 與利奈唑胺均無干擾峰，此色譜條件適用于（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇的分析檢測(cè)。另考察了制備供試品溶液的溶劑，APCA 與（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽對(duì)照品在水中溶解性均良好，但利奈唑胺在水中溶解性較差，為了使色譜條件能同時(shí)對(duì)利奈唑胺和ACPA 中的（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇進(jìn)行測(cè)定，簡(jiǎn)化操作流程，最終選用三者溶解性均較好的50%甲醇溶液作為供試品溶液的制備溶劑。

3.2 控制策略

按照ICH M7 和《中國(guó)藥典》2020年版四部通則9306 的相關(guān)要求，均需重點(diǎn)關(guān)注致突變的遺傳毒雜質(zhì)，（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇為潛在遺傳毒雜質(zhì)，一般采用過程（中間）控制、終產(chǎn)品控制以及過程（中間）控制＋終產(chǎn)品控制，由于利奈唑胺的中間體APCA 有部分批次檢出，且檢出量超過采用TTC 法（毒理學(xué)可關(guān)注閾值）計(jì)算出的安全限值15 μg·g－1，而片面控制APCA的純度，可能大幅增加生產(chǎn)成本，不符合藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)的基本要求，因此本品采用了中間控制＋終產(chǎn)品控制的控制策略，規(guī)定在中間體APCA 中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇不得過0.05%，終產(chǎn)品利奈唑胺中（S）-1-氨基-3-氯-2-丙醇不得過15 μg·g－1。