杜思穎，歐陽華（.重慶市人民醫(yī)院，重慶 40004；2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院，福建 廈門 36004）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的慢性炎癥性疾病，以侵蝕性和對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，與全身性自身免疫相關(guān)。若未得到及時(shí)有效的控制，不僅會(huì)累及患者心臟、肺等其他器官，還會(huì)致殘、致畸，病情嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[1]。目前，我國RA 患者已高達(dá)500 萬人，給個(gè)人、家庭和社會(huì)都帶來巨大負(fù)擔(dān)[2]。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）于1948年發(fā)現(xiàn)，最初以大劑量（高達(dá)1 g）治療急性白血病等癌癥用于臨床[3]。1985年開始以低劑量（5～25 mg/周）用于RA 的治療，顯示出良好的療效和安全性，成為國內(nèi)外治療RA 的首選藥物[4-7]。

然而，RA 患者對(duì)MTX 的臨床反應(yīng)表現(xiàn)出顯著的個(gè)體差異，超過1/3 的患者治療無效，10%～37%的患者因不良反應(yīng)而終止治療[8]。MTX 起效較慢，一般在治療3 個(gè)月后方顯現(xiàn)出明顯療效。因此如何在RA 早期合理地使用MTX，并預(yù)測(cè)其有效性和安全性，是目前亟待解決的問題。本文對(duì)小劑量MTX 在RA 中的藥動(dòng)學(xué)、胞內(nèi)代謝途徑、臨床反應(yīng)、治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM）以及相關(guān)基因多態(tài)性的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期找到能夠預(yù)測(cè)MTX 早期療效和不良反應(yīng)的標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)RA 患者的個(gè)體化治療。

1 藥動(dòng)學(xué)

MTX（4-氨基-10-甲基葉酸，結(jié)構(gòu)式見圖1）是葉酸的一種修飾形式，分子中有兩個(gè)羧基，在生理?xiàng)l件下幾乎完全解離。由于其親水性，MTX 不太可能通過簡(jiǎn)單擴(kuò)散方式穿過體內(nèi)的生物膜，而是參與了一個(gè)載體介導(dǎo)的運(yùn)輸系統(tǒng)，用于腸道吸收、組織分布和腎臟排泄[9]。

圖1 甲氨蝶呤及其主要代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of methotrexate and its main metabolites

小劑量MTX 經(jīng)口服后，在空腸近端被迅速吸收，在腸道細(xì)菌的作用下有小部分代謝為2，4-二氨基-N10-甲基蝶酸（DAMPA），DAMPA 的量不到MTX 給藥劑量的5%[10]。然后大部分MTX以原形通過肝門靜脈到達(dá)肝臟，其中約10%的MTX 在醛氧化酶的作用下代謝為7-OH-MTX；其余MTX 通過下腔靜脈到達(dá)血液，隨后以兩房室分布，以一級(jí)速率清除[11-12]。在血液中，MTX可轉(zhuǎn)運(yùn)到膝關(guān)節(jié)等作用部位，也可轉(zhuǎn)運(yùn)到紅細(xì)胞中代謝為多聚谷氨酸化甲氨蝶呤（methotrexate polyglutamates，MTXPGs），持續(xù)發(fā)揮藥理作用，這是MTX 非常重要的代謝途徑[13]。MTXPGs的分布容積近似于紅細(xì)胞的體積，并且隨著紅細(xì)胞的破裂而被清除[12]。血液中部分MTX 還可經(jīng)SLCO1B1基因編碼的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（OATP1B1）的運(yùn)輸作用下到達(dá)肝細(xì)胞，繼續(xù)進(jìn)行肝臟代謝[14]。MTX 的血漿蛋白結(jié)合率在50%左右，平均口服生物利用度為64%，個(gè)體間差異較大，范圍為21%～96%[15]。MTX 和7-OH-MTX主要由腎臟（約40%～90%）排出，但也有小部分（小于10%）從膽汁中排出[10]。

小劑量MTX 的血漿半衰期短，口服或靜脈注射24 h 后基本消除，但其細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物MTXPGs 長(zhǎng)期滯留。文獻(xiàn)報(bào)道，血清MTX 的半衰期為5～11 h，而紅細(xì)胞中MTXPGs 的半衰期可達(dá)28 d，達(dá)穩(wěn)態(tài)時(shí)間至少6 個(gè)月[16-17]。目前，關(guān)于血清MTX 的群體藥動(dòng)學(xué)研究較多，但是關(guān)于紅細(xì)胞中MTXPGs 的群體藥動(dòng)學(xué)研究較少，國內(nèi)研究幾乎空白。有文獻(xiàn)報(bào)道，高加索人服用小劑量MTX 后血清MTX 的清除率群體典型值為8.4 L·h－1，而紅細(xì)胞中MTXPGs 的清除率群體典型值為2.94×10－4L·h－1，可見紅細(xì)胞中MTXPGs清除十分緩慢[18]。有研究者對(duì)國外文獻(xiàn)報(bào)道的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，基于半生理特征的藥動(dòng)學(xué)模型獲取MTXPGs 的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，得到MTXPGs的清除率群體典型值為1.03×10－3L·h－1[12]。目前還未有文獻(xiàn)報(bào)道我國RA 患者紅細(xì)胞中MTXPGs的群體藥動(dòng)學(xué)模型，因此很有必要開展這方面的研究，以發(fā)現(xiàn)影響MTXPGs 清除率的因素，這對(duì)于RA 患者的個(gè)體化用藥具有重要意義。

2 胞內(nèi)代謝途徑

MTX 在細(xì)胞膜上還原型葉酸載體RFC1（也稱為溶質(zhì)載體SLC19A1）的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)下進(jìn)入細(xì)胞，然后在葉酰聚谷氨酸合成酶（FPGS）的催化作用下，連接1～6 個(gè)長(zhǎng)度不等的谷氨酸殘基，轉(zhuǎn)變成胞內(nèi)的主要活性形式MTXPGs[19]。MTXPGs 由于其分子結(jié)構(gòu)大，不易透過細(xì)胞膜，因此可以在胞內(nèi)長(zhǎng)期滯留，持續(xù)發(fā)揮抗風(fēng)濕作用。研究證明，MTXPGs 通過不同途徑抑制以下3 種酶，從而達(dá)到治療效果：① 二氫葉酸還原酶（DHFR）；② 胸苷酸合成酶（TYMS）；③ 5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷酸（AICAR）甲酰基轉(zhuǎn)移酶（ATIC）[20]。

相比MTX，MTXPGs 與DHFR 的結(jié)合親和性更高，通過阻礙二氫葉酸（DHF）向四氫葉酸（THF）的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致胞內(nèi)THF 的耗盡[20]。THF是葉酸輔因子5-CH3-THF 的前體，5-CH3-THF 對(duì)同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸至關(guān)重要，而甲硫氨酸反過來又有助于多胺的合成[21]。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是葉酸途徑（folate cycle）中的另一個(gè)關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將5，10-CH2-THF 轉(zhuǎn)化為5-CH3-THF。MTHFR 不 受MTXPGs的直接抑制，但通過THF 對(duì)細(xì)胞內(nèi)葉酸循環(huán)的影響而間接受到MTXPGs 的影響。

除了抑制葉酸途徑外，MTXPGs 還抑制了TYMS，阻礙脫氧尿苷酸（dUMP）甲基化生成脫氧胸苷酸（dTMP），進(jìn)而影響嘧啶的合成。此外，當(dāng)AICAR ATIC 被MTXPGs 抑制時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生AICAR 積聚，AICAR 為腺苷脫氨酶（ADA）的有效抑制劑，從而減少了腺苷的降解，導(dǎo)致血液中腺苷釋放增加。腺苷激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞外受體A2a、A2b和A3，抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素（IL）-6 和IL-8，從而降低E-選擇素在細(xì)胞表面的表達(dá)。同時(shí)腺苷能夠促進(jìn)IL-1 受體拮抗劑mRNA 的轉(zhuǎn)錄，增加IL-10 的分泌，是一種有效的抗炎藥[19]。

與MTX 相比，細(xì)胞內(nèi)MTXPGs 對(duì)ATIC 等酶的結(jié)合親和力更強(qiáng)，在MTX 的抗炎作用中起重要作用[22]。因此，細(xì)胞內(nèi)MTXPGs 被認(rèn)為在抑制細(xì)胞免疫和體液免疫以及通過抑制DNA 合成或氨基酸代謝方面發(fā)揮著重要的抗炎和免疫抑制作用。

MTXPGs 也可在細(xì)胞內(nèi)γ-谷氨酰水解酶（GGH）的作用下裂解谷氨酸殘基，使長(zhǎng)鏈變成短鏈，最終水解成原形MTX，再通過三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體（主要是ABCB1 和ABCC1-4，也稱為多藥耐藥蛋白）的運(yùn)輸作用，流出細(xì)胞[22]（見圖2）。

圖2 甲氨蝶呤細(xì)胞內(nèi)代謝途徑Fig 2 Methotrexate intracellular metabolic pathway

3 臨床反應(yīng)

3.1 療效的影響因素

盡管小劑量MTX 因其長(zhǎng)期有效性和安全性而成為最常用的改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARDs），但患者對(duì)MTX 的反應(yīng)是高度可變的，相同劑量下，只有約2/3 的患者治療有效[8]。導(dǎo)致接受小劑量MTX 治療臨床反應(yīng)變異性的因素通?？煞譃椋孩?與患者相關(guān)，如年齡、性別、種族、吸煙狀況、合并癥、肝腎功能和遺傳多態(tài)性；② 與疾病相關(guān)，如疾病持續(xù)時(shí)間；③ 與治療相關(guān)，如MTX 的給藥特點(diǎn)（劑量、治療持續(xù)時(shí)間和給藥途徑）和合并用藥[10]。

3.2 不良反應(yīng)

在小劑量MTX 的臨床應(yīng)用中，觀察到的MTX 相關(guān)毒性通常較小，最常見報(bào)告的是胃腸道（如腹痛、腹瀉）、血液系統(tǒng)（如白細(xì)胞減少、中性粒細(xì)胞減少）和肝膽道不良反應(yīng)[23]。Meta 分析顯示，接近13%的RA 患者出現(xiàn)肝酶升高（超過正常上限的2 倍）；3.7%的患者因肝毒性永久停止使用MTX[8]。葉酸（1～5 mg·d－1）的補(bǔ)充被認(rèn)為有助于預(yù)防MTX 相關(guān)毒性[23]。Meta 分析表明，葉酸與MTX 的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MTX 的療效沒有影響，同時(shí)還可以減少M(fèi)TX 的胃腸道不良反應(yīng)和肝毒性等[24-25]。最新的美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）指南[7]和我國《甲氨蝶呤在風(fēng)濕性疾病中的應(yīng)用中國專家共識(shí)》[6]中均建議在MTX 服用期間補(bǔ)充葉酸。

4 治療藥物監(jiān)測(cè)

MTX 治療RA 的方案是小劑量每周給藥。由于RA 的治療效果可以維持在幾周內(nèi)，而血液中MTX 的半衰期卻只有幾個(gè)小時(shí)，MTX 血漿濃度不能直接反映對(duì)RA 患者的治療效果。因此，科研人員將注意力集中在細(xì)胞內(nèi)MTXPGs 濃度作為MTX治療反應(yīng)的潛在預(yù)測(cè)因子上[26]。Dervieux 等[27]觀察226 個(gè)RA 患者后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)紅細(xì)胞MTXPGs 濃度小于60 nmol·L－1時(shí)臨床療效差；Takahashi等[28]報(bào)道，RA 患者紅細(xì)胞中MTXPGs 的濃度范圍為80～100 nmol·L－1時(shí)，療效好且肝毒性小。MTXPGs 濃度受眾多因素影響，包括MTX 的劑量、給藥途徑和療程、并發(fā)疾病、合并用藥、患者年齡、腎功能和吸煙狀況等[29]。治療藥物監(jiān)測(cè)是優(yōu)化患者臨床反應(yīng)的最常用策略之一。MTXPGs 治療范圍狹窄以及患者間存在變異性，因此通過監(jiān)測(cè)紅細(xì)胞中MTXPGs 濃度，尋找合適的治療窗可能是預(yù)測(cè)MTX 長(zhǎng)期療效較好的方法。

目前，MTXPGs 的檢測(cè)方法主要有酶分析法、放射化學(xué)配體結(jié)合分析法、高效液相色譜法（HPLC）、熒光偏振免疫分析法（FPIA）和液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）的檢測(cè)方法[30-34]。抑制DHFR的酶分析法最先在1985年建立，該法特異性不強(qiáng)，易受到內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。放射化學(xué)配體結(jié)合分析法早在1986年建立，該法靈敏度高、特異性強(qiáng)，能夠?qū)⒚糠NMTXPG 單獨(dú)分離，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要放射性同位素，不便于臨床開展。HPLC 法是2003年由美國學(xué)者Dervieux 等[35]首次建立，該法專屬性強(qiáng)，但是制備相對(duì)繁瑣，且需要昂貴的在線光化學(xué)反應(yīng)器，同時(shí)靈敏度不夠。FPIA 法是2008年由日本學(xué)者Hayashi 等[36]首次報(bào)道，該法具有較高的靈敏度，但需要特定的試劑盒，成本較高。HPLC-MS/MS 法是當(dāng)下最適用于臨床測(cè)定MTX 或MTXPGs 濃度的方法，該法不僅具有較高的靈敏度、選擇性和鑒別性，還具有縮短分析時(shí)間，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，并且定量下限可達(dá)到1 ng·mL－1[37-38]。

按照檢測(cè)途徑，測(cè)定紅細(xì)胞中MTXPGs 濃度的方法還可分為直接測(cè)定法[33]和間接測(cè)定法，而間接測(cè)定法又包括紅細(xì)胞間接測(cè)定法和全血間接測(cè)定法[37-39]（見表1）。筆者認(rèn)為全血間接測(cè)定法操作簡(jiǎn)便且較為經(jīng)濟(jì)，該法無需分離紅細(xì)胞，無需購買聚合物MTXPGs 對(duì)照品和外源性水解酶，適用于臨床上服用小劑量MTX 的RA 患者的治療藥物監(jiān)測(cè)。

表1 紅細(xì)胞中MTXPGs 濃度測(cè)定方法的比較Tab 1 Methods for determination of MTXPGS concentration in red blood cells

5 相關(guān)基因多態(tài)性

遺傳變異是影響藥物療效和毒性的重要因素。RA 患者個(gè)體間MTX 療效和毒性的巨大差異可能和參與MTX 轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的酶的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）相關(guān)。在MTX 的細(xì)胞內(nèi)代謝途徑中可能發(fā)現(xiàn)影響MTX 反應(yīng)和毒性的多種基因多態(tài)性，包括RFC1、ABCs、MTHFR、FPGS和GGH等，特別是RFC1，影響MTX 的吸收，是目前研究的熱點(diǎn)[40]。已有研究者從87 項(xiàng)檢測(cè)MTX 療效和毒性的遺傳相關(guān)性研究中選擇RFC180G＞A（rs1051266）進(jìn)行隨機(jī)效應(yīng)薈萃分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RFC180G＞A 與RA 患者的MTX 療效有關(guān)，但與毒性無關(guān)[41]。另一項(xiàng)共納入了68 項(xiàng)RA 患者基因多態(tài)性研究的meta 分析對(duì)所有與MTX 相關(guān)的42 個(gè)基因多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AMPD134C＞T（rs17602729）、ATIC675T＞C（rs4673993）和RFC180G＞A 基因多態(tài)性與療效相關(guān)，而TYMS1494 del6、FPGS（rs10106）的缺失和MTHFR677C＞T（rs1801133）的存在與出現(xiàn)不良事件相關(guān)[42]。

除胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)體和酶的基因多態(tài)性會(huì)影響MTX 治療RA 的療效和毒性以外，OATP1B1 也是需要關(guān)注的。OATP1B1 由SLCO1B1基因編碼，在許多內(nèi)源性物質(zhì)和外源性藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其SNP 對(duì)MTX 的清除率產(chǎn)生顯著的影響，其中以SNP 388A＞G（rs2306283）和521T＞C（rs4149056）研究的最多。國內(nèi)外有很多關(guān)于521T＞C 基因多態(tài)性影響急性白血病患兒MTX 清除的報(bào)道[43-44]，521T＞C SNP 通過影響MTX 向肝臟的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響血漿中MTX 的藥動(dòng)學(xué)。然而關(guān)于RA 患者與SLCO1B1基因多態(tài)性相關(guān)性的研究很少，僅在最近的一項(xiàng)小樣本研究中，觀察到388A＞G SNP 對(duì)MTX 群體清除率CL/F有顯著影響[45]。因此388A＞G 和521T＞C SNP 是否有可能通過影響MTX 的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)而間接影響其細(xì)胞代謝物MTXPGs 的濃度還有待更多的研究。

6 小結(jié)

本文綜述了近年來在RA 治療中涉及小劑量MTX 的藥動(dòng)學(xué)、胞內(nèi)代謝途徑和基因多態(tài)性等方面的研究進(jìn)展。MTX 由于其安全性和經(jīng)濟(jì)性仍是臨床治療RA 最為常用的抗風(fēng)濕藥物。由于MTX 顯著的個(gè)體差異，基因多態(tài)性和群體藥動(dòng)學(xué)的研究是未來的熱點(diǎn)，對(duì)實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療具有重要意義。研究紅細(xì)胞中MTXPGs 濃度與RA 患者療效的相關(guān)性，尋找合適的治療窗范圍以及探討療效的影響因素可能是預(yù)測(cè)MTX 長(zhǎng)期療效和不良反應(yīng)較好的方法。