袁敏（山東省中醫(yī)藥研究院，濟(jì)南 250014）

利濕通淋顆粒由黃柏、蒲公英、苦地丁、金錢草、綿萆薢、石韋、益母草、王不留行、皂角刺、川牛膝10 味中藥組成，是在經(jīng)典方五味消毒飲、滋腎通關(guān)丸及程式萆薢消毒飲的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗化裁而來，具有清熱利濕、散結(jié)通淋之功效[1]，為治療濕熱瘀阻型慢性前列腺炎的有效方劑。針對方中各藥材的理化性質(zhì)及藥理作用[2-6]，為使各藥的主要有效成分盡可能多地被提取出來，更好地發(fā)揮藥效，對方中黃柏、石韋、王不留行、皂角刺、川牛膝5 味中藥飲片進(jìn)行醇提，蒲公英、益母草、苦地丁、金錢草、綿萆薢5 味中藥飲片進(jìn)行水煎煮提?。üに嚭Y選另文發(fā)表）。黃柏是清下焦?jié)駸岬募哑?，具有清虛熱、解瘡毒作用，含有多種生物堿成分，其主要成分為小檗堿，研究表明小檗堿可通過誘導(dǎo)周期停滯和細(xì)胞凋亡來抑制前列腺癌細(xì)胞的生長[2]。本文以君藥黃柏中小檗堿轉(zhuǎn)移率和醇提物干膏得率為評價指標(biāo)[7]，采用單因素考察及L9（34）正交試驗設(shè)計對方中醇提藥材進(jìn)行工藝優(yōu)選，為利濕通淋顆粒的深入研究與開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695-2998 高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Diamonsil C18柱（北京迪科馬科科技有限公司）；十萬分子一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，型號：BT125D]；超聲波雙頻清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司，型號：SB5200DTS）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品（批號：0713-9906，供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院）；飲片均購自山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)中藥資源研究室林慧彬研究員鑒定為2015年版《中國藥典》收載的正品；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每100 mL 加十二烷基硫酸鈉0.1 g）；流速：1 mL·min－1；檢測波長265 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加流動相溶解，定容，制得質(zhì)量濃度為0.108 mg·mL－1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

按處方比例稱取黃柏4 g、石韋4 g、王不留行4 g、皂角刺3 g、川牛膝2 g，分別加60%乙醇為飲片總重的10 倍、8 倍、8 倍量，提取3 次，每次1.0 h，合并提取液，120 目濾布過濾，置于500 mL 量瓶內(nèi)，冷卻至室溫，加60%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，精密移取樣品溶液10 mL，置于蒸發(fā)皿中，蒸干，用流動相溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，加流動相適量，超聲處理（250 W，40 kHz）40 min，放至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 黃柏藥材溶液的制備

取黃柏飲片粉末（過三號篩）約0.1 g，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加流動相80 mL，超聲處理（250 W，40 kHz）40 min，放冷，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.5 干膏得率的測定

精密移取“2.3”項下樣品溶液25 mL，水浴蒸干，殘渣于105 ℃干燥3 h，取出，置于干燥器中，放冷至室溫，精密稱定，根據(jù)減失的重量，計算干膏得率（%）。

2.6 缺黃柏陰性樣品溶液的制備

按照處方比例稱取缺黃柏的其他4 味飲片，按照“2.3”項下方法處理，制得缺黃柏陰性樣品溶液。

2.7 專屬性試驗

分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液、缺黃柏陰性樣品溶液各10 μL，進(jìn)樣測定。結(jié)果在與對照品溶液相同的保留時間處，陰性樣品溶液未出現(xiàn)相應(yīng)吸收峰，表明該方法無干擾、專屬性好。結(jié)果見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿對照品（A）、供試品（B）、缺黃柏陰性樣品溶液（C）HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of berberine hydrochloride（A），sample（B），and negative sample without Phellodendri（C）

2.8 方法學(xué)考察

2.8.1 線性關(guān)系考察 按“2.2”項下方法配制并稀釋制得質(zhì)量濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mg·mL－1的小檗堿系列對照品溶液。按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝4.37×106X－3.13×105（r＝0.9999），表明鹽酸小檗堿在0.40～2.40 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.8.2 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積值，得RSD為0.31%，表明儀器精密度良好。

2.8.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.3”項下供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 時進(jìn)樣測定峰面積值，得RSD為1.3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.4 重復(fù)性試驗 按“2.3”項下方法平行制備樣品溶液6 份，分別進(jìn)樣測定，結(jié)果小檗堿的平均含量為51.43 mg·g－1，RSD為1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.5 加樣回收試驗 精密移取“2.3”項下樣品溶液5 mL，置于蒸發(fā)皿中，蒸干，用流動相轉(zhuǎn)移至 50 mL量瓶中，精密加入質(zhì)量濃度為0.40 mg·mL－1的鹽酸小檗堿對照品溶液5 mL，按照“2.3”項下方法平行操作6 份，分別進(jìn)樣10 μL，計算得小檗堿的加樣回收率在97.84%～100.4%，RSD為2.1%（n＝6）。

2.9 單因素考察

分別以50%、60%、70%、80%和 90%的乙醇為提取溶劑，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。以小檗堿轉(zhuǎn)移率和干膏得率為主要評價指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)按小檗堿轉(zhuǎn)移率（小檗堿轉(zhuǎn)移率%＝利濕通淋顆粒中小檗堿的含量/黃柏藥材中小檗堿的含量×100%）和干膏得率分別占比60%、40%來計算綜合評分，Y＝X1/X1max×60%×100＋X2/X2max×40%×100，以綜合評分值（Y）對試驗結(jié)果進(jìn)行分析[8]。由試驗結(jié)果可知，60%的乙醇溶液作提取溶劑時，所得小檗堿轉(zhuǎn)移率和干膏得率的綜合評分最高，因此，選用60%的乙醇溶液作為提取溶劑。

2.10 正交試驗研究

2.10.1 因素與水平 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以60%的乙醇溶液作提取溶劑，以60%的乙醇用量、提取次數(shù)、提取時間為考察因素，每個因素考察3 個水平，選用 L9（34）正交試驗表安排試驗[9]，因素水平見表1。

表1 因素及水平Tab 1 Factor and level

2.10.2 方法與結(jié)果 按處方比例稱取各藥材飲片，按照正交試驗表安排試驗，結(jié)果見表2、3。

表2 正交試驗及結(jié)果Tab 2 Orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis

直觀分析結(jié)果表明，各因素對5 味飲片提取的影響程度依次為B＞A＞C，即提取次數(shù)＞乙醇用量＞提取時間。方差分析結(jié)果顯示，因素B對小檗堿的轉(zhuǎn)移率具有顯著影響（P＜0.01），因素A 與因素C 對其不具有顯著影響。綜合直觀和方差分析結(jié)果，從節(jié)能、節(jié)時及降低成本方面綜合考慮，確定最佳提取工藝為A3B3C1，即以60%的乙醇溶液為提取溶劑，溶液用量分別為飲片總重的10 倍、8 倍、8 倍量，提取3 次，每次提取1.0 h。

2.10.3 驗證試驗 按處方比例稱取5 味飲片，平行操作3 份，按照確定的最佳醇提工藝進(jìn)行試驗，計算小檗堿轉(zhuǎn)移率。結(jié)果顯示，小檗堿轉(zhuǎn)移率分別 為48.82%、47.93%、49.24%，RSD為1.4%，干膏得率分別為17.42%、17.13%、17.76%，RSD為1.8%。表明該醇提工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性良好。

3 討論

加權(quán)評分法進(jìn)行處方工藝的優(yōu)選時，權(quán)重系數(shù)的賦予是綜合評分標(biāo)準(zhǔn)是否科學(xué)、合理的直接體現(xiàn)。浸膏作為中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，在遵循中醫(yī)藥理論和確保藥效的基礎(chǔ)上，結(jié)合本處方中藥物有效成分，以黃柏中所含有效成分小檗堿的轉(zhuǎn)移率和醇提物出膏率的綜合評分為評價指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別為0.6、0.4，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交試驗法對利濕通淋顆粒的醇提工藝進(jìn)行了優(yōu)選，從而確保制劑提取工藝的科學(xué)性和準(zhǔn)確性[10]。

本制劑組方有10 味藥材組成，黃柏作為君藥，在提取工藝篩選過程中，課題組曾將黃柏按照處方比例和石韋等其余4 味中藥飲片混合，以60%的乙醇溶液作提取溶劑，又將黃柏按照處方比例和組方中蒲公英、益母草等其余5 味藥材一起水煎煮提取，以同樣的提取溶劑倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)，制備樣品溶液和供試品溶液，經(jīng)高效液相色譜測定，并計算，水煎煮提取的黃柏中小檗堿轉(zhuǎn)移率為14.56%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于60%的乙醇溶液提取的小檗堿轉(zhuǎn)移率48.66%，故將黃柏列入醇提藥材[11-13]。