基于標(biāo)準(zhǔn)加入法的改進(jìn)計(jì)算公式測定蘋果中毒死蜱、戊唑醇?xì)埩袅?/h1>
2021-09-01 01:52覃慧麗
現(xiàn)代農(nóng)藥 2021年4期
武 源，覃慧麗
（柳州市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究中心，廣西柳州 545006）
毒死蜱、戊唑醇常用于蘋果病蟲害的防治，屬于蘋果病蟲害化學(xué)防治中的高頻農(nóng)藥[1]。戊唑醇主要用于枝干輪紋病、干腐病、斑點(diǎn)落葉病、褐斑病等病害的防治[2]，毒死蜱常用于桃小食心蟲、蘋果綿蚜等蟲害的防治。農(nóng)藥在保障作物生長、提高作物產(chǎn)量的同時(shí)，也會對環(huán)境和人體產(chǎn)生一定副作用，例如戊唑醇屬于難降解農(nóng)藥，在土壤、水體中的降解半衰期大于180 d[3]，容易引發(fā)農(nóng)藥再殘留問題。中高毒農(nóng)藥毒死蜱在蘋果上的檢出率高，在殘留風(fēng)險(xiǎn)等級中屬于高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥[4]。合理有效的檢測手段有助于農(nóng)藥殘留日常監(jiān)督管理，從而提升食品安全生產(chǎn)質(zhì)量，降低存在的殘留和安全風(fēng)險(xiǎn)。
質(zhì)譜法可提供化合物的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息，由于質(zhì)譜屬于通用型檢測器，在多農(nóng)殘快速篩查領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛[5-7]。食品中農(nóng)藥殘留GC分析領(lǐng)域常見基質(zhì)效應(yīng)，是指待測組分受基質(zhì)共流物的影響而導(dǎo)致響應(yīng)增強(qiáng)或抑制的現(xiàn)象[8-12]。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液替代溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液可以很好地解決基質(zhì)效應(yīng)帶來的定量不準(zhǔn)確的影響[13-15]，但不是所有的樣品都能找到不含待測物的空白基質(zhì)[16]，尤其面對能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)樣品或者待測物為內(nèi)源性物質(zhì)等復(fù)雜多樣的樣品[17-19]。
標(biāo)準(zhǔn)加入法是在待測樣品中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，保證了樣品溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在基質(zhì)效應(yīng)上的一致性，消除了基質(zhì)共流物對分析物的影響，是目前解決基質(zhì)效應(yīng)最為可靠有效的定量方法[20-22]。查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)加入法定量通常將標(biāo)準(zhǔn)工作曲線反向延長至與橫坐標(biāo)延長線相交，交點(diǎn)與原點(diǎn)之間的距離即為待測物的質(zhì)量濃度[23-26]?；跇?biāo)準(zhǔn)加入法測定樣品溶液濃度，傳統(tǒng)計(jì)算公式視待測組分的響應(yīng)值為曲線截距，且忽略了曲線截距與待測組分的響應(yīng)值之間的距離對定量結(jié)果帶來的偏差影響，所得濃度是不夠準(zhǔn)確的。筆者基于標(biāo)準(zhǔn)加入法，對比了傳統(tǒng)計(jì)算公式和改進(jìn)計(jì)算公式所得樣品含量結(jié)果的差異，以“z-比分?jǐn)?shù)”評價(jià)測得結(jié)果的滿意度，為樣品的準(zhǔn)確定量提供新的解決方案。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
提取包5982-5650CH：4 g MgSO4，1 g NaCl，1 g檸檬酸鈉，0.5 g三水合二檸檬酸二鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子；凈化試劑管5982-5256：885 mg MgSO4，150 mg PSA，15 mg GCB，美國安捷倫公司。
乙腈（色譜純），德國Merck公司；丙酮（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙酸乙酯（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；毒死蜱（純度99.89%）、戊唑醇（純度99.30%）、環(huán)氧七氯B（純度98.70%），德國Dr.Ehrenstorfer公司。
1.2 儀器與設(shè)備
7890B-7000D氣質(zhì)聯(lián)用儀、VF-1701MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），美國安捷倫公司；XP26微量電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；IKA VORTEX 4 basic渦旋振蕩器，德國IKA公司；IKA VXR basic圓周振蕩器，德國IKA公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；SIGMA 3-30K離心機(jī)，德國SIGMA公司。
1.3 方法
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
待測物儲備液：精密稱取毒死蜱、戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，丙酮溶解并定容至刻線。
內(nèi)標(biāo)儲備液：精密稱取環(huán)氧七氯B標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，乙酸乙酯溶解并定容至刻線。
混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/mL）：精密吸取適量的毒死蜱、戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液于20 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
內(nèi)標(biāo)工作液（5μg/mL）：精密吸取一定量的內(nèi)標(biāo)儲備液，用乙酸乙酯配制成內(nèi)標(biāo)工作液。
系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，精密吸取不同體積混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙酸乙酯稀釋定容，配制成所需混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
標(biāo)準(zhǔn)加入法標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取若干份10 g不含待測物的空白樣品于50 mL離心管，根據(jù)1.3.2樣品前處理步驟制備好回收樣品溶液（0.02、0.05、0.1 mg/kg 3個(gè)添加水平）氮吹近干，加20μL內(nèi)標(biāo)工作液并加入1 mL從0開始遞增的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶。以復(fù)溶加入標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，待測組分定量離子與內(nèi)標(biāo)定量離子響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.2 樣品前處理
準(zhǔn)確稱取10 g待測樣品于50 mL塑料離心管中，加10 mL乙腈并加入提取包5982-5650CH，蓋上離心管蓋，振蕩器劇烈振蕩1 min后于4 200 rpm離心5 min，吸取8 mL上清液至凈化試劑管5982-5256中，立即搖散，渦旋混勻1 min，4 200 rpm離心5 min，準(zhǔn)確吸取1 mL上清液于10 mL試管中，40℃水浴中氮吹至近干，加入20μL的內(nèi)標(biāo)工作液，加入1 mL乙酸乙酯復(fù)溶，0.22μm濾膜過濾后上機(jī)測定。
1.3.3 GC-MS/MS條件
1.3.3.1 色譜條件
1.3.3.2 質(zhì)譜條件
電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：280℃；傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲：3 min；多反應(yīng)監(jiān)測MRM模式?；衔锊杉x子對信息見表1。
表1 化合物定量離子對、定性離子對和碰撞能量
2 結(jié)果與分析
2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
化合物質(zhì)譜分析的子離子選自其在質(zhì)譜離子源轟擊中形成的碎片離子，不同子離子抗干擾能力也有差異。優(yōu)化電壓，選擇抗干擾能力強(qiáng)、豐度值高的離子對有助于提高定量的準(zhǔn)確性和靈敏度，提高化合物在儀器上的響應(yīng)。取1μg/mL溶劑標(biāo)液進(jìn)樣，優(yōu)化化合物離子對參數(shù)。
毒死蜱常見的離子對有313.8/285.5、313.8/257.8、196.7/107.0、313.8/193.8，其中313.8/285.5和313.8/193.8離子對響應(yīng)弱，信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他2對離子對的信噪比。通過優(yōu)化電壓得到最強(qiáng)豐度響應(yīng)，313.8/257.8最適電壓為15 V，196.7/107.0最適電壓為36 V，選擇響應(yīng)最高的313.8/257.8為定量離子對。
戊 唑 醇 離 子 對 有252.0/127.0、250.0/125.0、125.0/99.0、125.0/89.0。4對離子對中，252.0/127.0和125.0/99.0響應(yīng)較弱，不利于定量分析，故選擇250.0/125.0、125.0/89.0為確定離子對。進(jìn)一步優(yōu)化得到250.0/125.0、125.0/89.0的最佳電壓分別是25 V和16 V，選取豐度值最高的250.0/125.0為定量離子對。
同理優(yōu)化得到環(huán)氧七氯B定量離子對為352.8/262.9，電壓為15 V，定性離子對為354.8/264.9，電壓為15 V。
2.2 線性關(guān)系和基質(zhì)效應(yīng)
準(zhǔn)確稱取空白樣品若干份，根據(jù)1.3.2樣品前處理步驟制備得空白基質(zhì)溶液。精密吸取1 mL凈化后的空白基質(zhì)溶液于40℃水浴氮吹近干，加入20μL的內(nèi)標(biāo)工作液，并準(zhǔn)確加入1 mL系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶，以待測組分與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值之比（y）對復(fù)溶加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x）做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。毒死蜱在21.86～874.4 ng/mL線性范圍內(nèi)線性良好，線性方程y=0.021 7x-0.259 1，相關(guān)系數(shù)為0.999 0；戊唑醇在24.16～966.4 ng/mL線性范圍內(nèi)線性良好，線性方程y=0.041 8x-0.236 2，相關(guān)系數(shù)為0.999 2。
以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值考察基質(zhì)效應(yīng)（ME）[27]。由于儀器浮動的影響，當(dāng)斜率比值為0.9～1.1，基質(zhì)效應(yīng)忽略不計(jì)；當(dāng)斜率比值＞1.1，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)斜率比值＜0.9，為基質(zhì)抑制效應(yīng)[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，毒死蜱ME值為7.4，戊唑醇ME值為25.9，毒死蜱和戊唑醇均為基質(zhì)誘導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng)，且戊唑醇基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)大于毒死蜱。蘋果基質(zhì)共流物對毒死蜱和戊唑醇的誘導(dǎo)影響較大，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液可消除內(nèi)源性和外源性共流物對分析物的影響，定量更準(zhǔn)確。對于無法得到空白基質(zhì)的樣品，標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)合本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)計(jì)算公式可準(zhǔn)確獲得陽性樣品溶液濃度。
2.3 回收率、精密度和定量限
準(zhǔn)確稱取若干份10 g空白蘋果樣品，分別加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02、0.05、0.1 mg/kg 3個(gè)添加水平），靜置30 min后，按照1.3.2樣品前處理步驟制備樣品溶液，不同添加水平樣品制備6份平行樣以考察方法可行性及穩(wěn)定性。結(jié)果表明，3個(gè)添加水平下蘋果中毒死蜱回收率在99.3%～106.0%，精密度在3.6%～4.9%；蘋果中戊唑醇回收率在96.3%～103.8%，精密度在3.3%～4.2%，回收率和精密度均符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的要求[29]（表2）。
水利樞紐工程安全監(jiān)測系統(tǒng)在設(shè)計(jì)開發(fā)中，不僅涉及多個(gè)學(xué)科，還會涉及多個(gè)專業(yè)，因而在設(shè)計(jì)過程中能夠集中多個(gè)領(lǐng)域的優(yōu)勢。從專業(yè)知識的角度來說，水利樞紐工程安全監(jiān)測系統(tǒng)設(shè)計(jì)主要設(shè)計(jì)的專業(yè)有傳統(tǒng)的水利專業(yè)、現(xiàn)代的微電子專業(yè)、通信專業(yè)以及自動控制專業(yè)等。水利樞紐工程安全監(jiān)測系統(tǒng)開發(fā)是一項(xiàng)整體的工程，且建成后會發(fā)揮重要的作用。
表2 毒死蜱、戊唑醇線性方程及添加回收結(jié)果（n=6）
以10倍信噪比對應(yīng)的添加水平確定方法定量限。根據(jù)前處理稀釋倍數(shù)及樣品稱樣量，得到蘋果中毒死蜱和戊唑醇方法定量限分別為0.003 mg/kg、0.001 mg/kg，滿足日常檢測的需要[30]。
2.4 標(biāo)準(zhǔn)加入法改進(jìn)計(jì)算公式推導(dǎo)
對陽性待測樣品采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量時(shí)，以加入樣品中標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x軸），待測組分響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y軸）繪制陽性樣品的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1a）。常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算方式[23-26]是將標(biāo)準(zhǔn)曲線反向延長至與x軸相交，交點(diǎn)與原點(diǎn)間的距離對應(yīng)的質(zhì)量濃度即為待測組分的質(zhì)量濃度（y′=0時(shí)所對應(yīng)的x值），詳見常規(guī)式（1）。
式中：C為從基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的待測組分溶液濃度，單位與橫坐標(biāo)一致；b′為標(biāo)準(zhǔn)加入法基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；k′為標(biāo)準(zhǔn)加入法基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。
假設(shè)存在與測定樣品匹配的空白基質(zhì)，則以此空白基質(zhì)溶液同法可配制得陰性樣品的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1b）。比較2條標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，同類樣品基質(zhì)效應(yīng)相同，陰性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與陽性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的加標(biāo)質(zhì)量濃度相同，各點(diǎn)響應(yīng)值差別只有陽性樣品本底值A(chǔ)′。由于同一陽性樣品溶液中質(zhì)量濃度水平恒定，則本底濃度在相同儀器條件下的響應(yīng)值A(chǔ)′保持恒定，因此理論上2條標(biāo)準(zhǔn)曲線是斜率相等，截距不同的平行線段，截距差值即為陽性樣品的響應(yīng)值帶來的本底增量A′。故2條標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系有k′=k0，b0=b′-A′。
色譜分析中，空白基質(zhì)應(yīng)未檢出目標(biāo)物質(zhì)，即陰性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線0點(diǎn)的響應(yīng)值A(chǔ)0=0。在陽性樣品溶液中加入從0開始遞增的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，陽性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線0點(diǎn)的測得響應(yīng)值為A測=A′＋A0=A′＋0=A′。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，將待測物質(zhì)在儀器上的響應(yīng)A測帶入陰性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=k0x＋b0即可得出待測組分溶液濃度[31-32]。根據(jù)上述推導(dǎo)關(guān)系得改進(jìn)的式（2）。未知量k0、b0均轉(zhuǎn)化至已知k′、b′、A測，陽性樣品含量可解。
式中：A測為標(biāo)準(zhǔn)加入法陽性基質(zhì)標(biāo)曲0點(diǎn)的測得響應(yīng)值（內(nèi)標(biāo)法則為待測組分與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值之比）。
根據(jù)“最小二乘法”原則確定回歸方程，A測為標(biāo)準(zhǔn)加入法陽性基質(zhì)標(biāo)曲0點(diǎn)的測得響應(yīng)值，與直線方程存在一定的偏離度[33-34]，A測往往與b′并不重合，即|b′-A測|≠0。傳統(tǒng)計(jì)算公式以b′/k′計(jì)算樣品濃度，直接用截距b′代表陽性樣品響應(yīng)值A(chǔ)測，從而忽略了b′與A測之間差值對定量結(jié)果帶來的誤差，導(dǎo)致所得濃度不夠準(zhǔn)確。改進(jìn)計(jì)算公式克服了上述不足，更好地詮釋了濃度與響應(yīng)值之間的定量關(guān)系，由此得到更準(zhǔn)確的待測組分溶液濃度。
2.5 標(biāo)準(zhǔn)加入法的2種計(jì)算公式對結(jié)果的影響
按照1.3.2樣品前處理步驟，以回收樣品溶液為測定溶液，氮吹近干后加入20μL的內(nèi)標(biāo)工作液，加入1 mL從0開始遞增的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以復(fù)溶加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，待測組分定量離子與內(nèi)標(biāo)定量離子響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用“z-比分?jǐn)?shù)”評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)加入法的2種計(jì)算公式定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，詳見式（3）。
式中：x為樣品測定值；X為指定值（本實(shí)驗(yàn)為添加水平），σ為標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)|z|≤2時(shí)，測得結(jié)果滿意；當(dāng)2＜|z|＜3時(shí)，測得結(jié)果有問題（可疑）；當(dāng)|z|≥3時(shí)，測得結(jié)果不滿意（離群）。
從表3看出，2種計(jì)算公式得到的毒死蜱、戊唑醇樣品含量結(jié)果的z值均小于2，測試結(jié)果均滿意；2種組分根據(jù)改進(jìn)計(jì)算公式得到的z值均小于傳統(tǒng)計(jì)算公式得到的z值，改進(jìn)算法優(yōu)于傳統(tǒng)算法。2種計(jì)算公式得到的z值在低濃度添加水平下（0.02 mg/kg）差異不顯著，但在中高濃度添加水平下（0.05、0.1 mg/kg）z值差異顯著。改進(jìn)的計(jì)算公式得到的z值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)計(jì)算公式計(jì)算的z值，與真值更接近。基于標(biāo)準(zhǔn)加入法采用改進(jìn)公式計(jì)算樣品含量，得到的樣品結(jié)果準(zhǔn)確性更高，可靠性更強(qiáng)，為樣品準(zhǔn)確定量提供了新的解決方案。
表3 標(biāo)準(zhǔn)加入法不同計(jì)算方式對定量結(jié)果的影響（n=6）
3 結(jié) 論
本試驗(yàn)前處理在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.113的基礎(chǔ)上，基于標(biāo)準(zhǔn)加入法建立了蘋果中毒死蜱、戊唑醇?xì)埩袅康姆治觥Ｔ跇?biāo)準(zhǔn)加入法定量方式上，采用2種計(jì)算公式計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，常規(guī)和改進(jìn)計(jì)算公式均能滿足常規(guī)定量使用，但改進(jìn)計(jì)算公式得到的樣品含量準(zhǔn)確性和可靠性更高，適用于果蔬基質(zhì)中農(nóng)殘的準(zhǔn)確定量。當(dāng)前處理方法回收率滿足測定要求，操作穩(wěn)定性好。樣品中待測物質(zhì)溶液濃度在儀器上有較好的響應(yīng)時(shí)，基于標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)合改進(jìn)計(jì)算公式，也可用于能力驗(yàn)證樣品、特殊基質(zhì)樣品和內(nèi)源性物質(zhì)樣品的準(zhǔn)確定量。
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武 源，覃慧麗
（柳州市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究中心，廣西柳州 545006）
毒死蜱、戊唑醇常用于蘋果病蟲害的防治，屬于蘋果病蟲害化學(xué)防治中的高頻農(nóng)藥[1]。戊唑醇主要用于枝干輪紋病、干腐病、斑點(diǎn)落葉病、褐斑病等病害的防治[2]，毒死蜱常用于桃小食心蟲、蘋果綿蚜等蟲害的防治。農(nóng)藥在保障作物生長、提高作物產(chǎn)量的同時(shí)，也會對環(huán)境和人體產(chǎn)生一定副作用，例如戊唑醇屬于難降解農(nóng)藥，在土壤、水體中的降解半衰期大于180 d[3]，容易引發(fā)農(nóng)藥再殘留問題。中高毒農(nóng)藥毒死蜱在蘋果上的檢出率高，在殘留風(fēng)險(xiǎn)等級中屬于高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥[4]。合理有效的檢測手段有助于農(nóng)藥殘留日常監(jiān)督管理，從而提升食品安全生產(chǎn)質(zhì)量，降低存在的殘留和安全風(fēng)險(xiǎn)。
質(zhì)譜法可提供化合物的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息，由于質(zhì)譜屬于通用型檢測器，在多農(nóng)殘快速篩查領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛[5-7]。食品中農(nóng)藥殘留GC分析領(lǐng)域常見基質(zhì)效應(yīng)，是指待測組分受基質(zhì)共流物的影響而導(dǎo)致響應(yīng)增強(qiáng)或抑制的現(xiàn)象[8-12]。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液替代溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液可以很好地解決基質(zhì)效應(yīng)帶來的定量不準(zhǔn)確的影響[13-15]，但不是所有的樣品都能找到不含待測物的空白基質(zhì)[16]，尤其面對能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)樣品或者待測物為內(nèi)源性物質(zhì)等復(fù)雜多樣的樣品[17-19]。
標(biāo)準(zhǔn)加入法是在待測樣品中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，保證了樣品溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在基質(zhì)效應(yīng)上的一致性，消除了基質(zhì)共流物對分析物的影響，是目前解決基質(zhì)效應(yīng)最為可靠有效的定量方法[20-22]。查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)加入法定量通常將標(biāo)準(zhǔn)工作曲線反向延長至與橫坐標(biāo)延長線相交，交點(diǎn)與原點(diǎn)之間的距離即為待測物的質(zhì)量濃度[23-26]?；跇?biāo)準(zhǔn)加入法測定樣品溶液濃度，傳統(tǒng)計(jì)算公式視待測組分的響應(yīng)值為曲線截距，且忽略了曲線截距與待測組分的響應(yīng)值之間的距離對定量結(jié)果帶來的偏差影響，所得濃度是不夠準(zhǔn)確的。筆者基于標(biāo)準(zhǔn)加入法，對比了傳統(tǒng)計(jì)算公式和改進(jìn)計(jì)算公式所得樣品含量結(jié)果的差異，以“z-比分?jǐn)?shù)”評價(jià)測得結(jié)果的滿意度，為樣品的準(zhǔn)確定量提供新的解決方案。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
提取包5982-5650CH：4 g MgSO4，1 g NaCl，1 g檸檬酸鈉，0.5 g三水合二檸檬酸二鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子；凈化試劑管5982-5256：885 mg MgSO4，150 mg PSA，15 mg GCB，美國安捷倫公司。
乙腈（色譜純），德國Merck公司；丙酮（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙酸乙酯（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；毒死蜱（純度99.89%）、戊唑醇（純度99.30%）、環(huán)氧七氯B（純度98.70%），德國Dr.Ehrenstorfer公司。
1.2 儀器與設(shè)備
7890B-7000D氣質(zhì)聯(lián)用儀、VF-1701MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），美國安捷倫公司；XP26微量電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；IKA VORTEX 4 basic渦旋振蕩器，德國IKA公司；IKA VXR basic圓周振蕩器，德國IKA公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；SIGMA 3-30K離心機(jī)，德國SIGMA公司。
1.3 方法
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
待測物儲備液：精密稱取毒死蜱、戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，丙酮溶解并定容至刻線。
內(nèi)標(biāo)儲備液：精密稱取環(huán)氧七氯B標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，乙酸乙酯溶解并定容至刻線。
混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/mL）：精密吸取適量的毒死蜱、戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液于20 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
內(nèi)標(biāo)工作液（5μg/mL）：精密吸取一定量的內(nèi)標(biāo)儲備液，用乙酸乙酯配制成內(nèi)標(biāo)工作液。
系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，精密吸取不同體積混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙酸乙酯稀釋定容，配制成所需混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
標(biāo)準(zhǔn)加入法標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取若干份10 g不含待測物的空白樣品于50 mL離心管，根據(jù)1.3.2樣品前處理步驟制備好回收樣品溶液（0.02、0.05、0.1 mg/kg 3個(gè)添加水平）氮吹近干，加20μL內(nèi)標(biāo)工作液并加入1 mL從0開始遞增的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶。以復(fù)溶加入標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，待測組分定量離子與內(nèi)標(biāo)定量離子響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.2 樣品前處理
準(zhǔn)確稱取10 g待測樣品于50 mL塑料離心管中，加10 mL乙腈并加入提取包5982-5650CH，蓋上離心管蓋，振蕩器劇烈振蕩1 min后于4 200 rpm離心5 min，吸取8 mL上清液至凈化試劑管5982-5256中，立即搖散，渦旋混勻1 min，4 200 rpm離心5 min，準(zhǔn)確吸取1 mL上清液于10 mL試管中，40℃水浴中氮吹至近干，加入20μL的內(nèi)標(biāo)工作液，加入1 mL乙酸乙酯復(fù)溶，0.22μm濾膜過濾后上機(jī)測定。
1.3.3 GC-MS/MS條件
1.3.3.1 色譜條件
1.3.3.2 質(zhì)譜條件
電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：280℃；傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲：3 min；多反應(yīng)監(jiān)測MRM模式?；衔锊杉x子對信息見表1。
表1 化合物定量離子對、定性離子對和碰撞能量
2 結(jié)果與分析
2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
化合物質(zhì)譜分析的子離子選自其在質(zhì)譜離子源轟擊中形成的碎片離子，不同子離子抗干擾能力也有差異。優(yōu)化電壓，選擇抗干擾能力強(qiáng)、豐度值高的離子對有助于提高定量的準(zhǔn)確性和靈敏度，提高化合物在儀器上的響應(yīng)。取1μg/mL溶劑標(biāo)液進(jìn)樣，優(yōu)化化合物離子對參數(shù)。
毒死蜱常見的離子對有313.8/285.5、313.8/257.8、196.7/107.0、313.8/193.8，其中313.8/285.5和313.8/193.8離子對響應(yīng)弱，信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他2對離子對的信噪比。通過優(yōu)化電壓得到最強(qiáng)豐度響應(yīng)，313.8/257.8最適電壓為15 V，196.7/107.0最適電壓為36 V，選擇響應(yīng)最高的313.8/257.8為定量離子對。
戊 唑 醇 離 子 對 有252.0/127.0、250.0/125.0、125.0/99.0、125.0/89.0。4對離子對中，252.0/127.0和125.0/99.0響應(yīng)較弱，不利于定量分析，故選擇250.0/125.0、125.0/89.0為確定離子對。進(jìn)一步優(yōu)化得到250.0/125.0、125.0/89.0的最佳電壓分別是25 V和16 V，選取豐度值最高的250.0/125.0為定量離子對。
同理優(yōu)化得到環(huán)氧七氯B定量離子對為352.8/262.9，電壓為15 V，定性離子對為354.8/264.9，電壓為15 V。
2.2 線性關(guān)系和基質(zhì)效應(yīng)
準(zhǔn)確稱取空白樣品若干份，根據(jù)1.3.2樣品前處理步驟制備得空白基質(zhì)溶液。精密吸取1 mL凈化后的空白基質(zhì)溶液于40℃水浴氮吹近干，加入20μL的內(nèi)標(biāo)工作液，并準(zhǔn)確加入1 mL系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶，以待測組分與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值之比（y）對復(fù)溶加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x）做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。毒死蜱在21.86～874.4 ng/mL線性范圍內(nèi)線性良好，線性方程y=0.021 7x-0.259 1，相關(guān)系數(shù)為0.999 0；戊唑醇在24.16～966.4 ng/mL線性范圍內(nèi)線性良好，線性方程y=0.041 8x-0.236 2，相關(guān)系數(shù)為0.999 2。
以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值考察基質(zhì)效應(yīng)（ME）[27]。由于儀器浮動的影響，當(dāng)斜率比值為0.9～1.1，基質(zhì)效應(yīng)忽略不計(jì)；當(dāng)斜率比值＞1.1，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)斜率比值＜0.9，為基質(zhì)抑制效應(yīng)[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，毒死蜱ME值為7.4，戊唑醇ME值為25.9，毒死蜱和戊唑醇均為基質(zhì)誘導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng)，且戊唑醇基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)大于毒死蜱。蘋果基質(zhì)共流物對毒死蜱和戊唑醇的誘導(dǎo)影響較大，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液可消除內(nèi)源性和外源性共流物對分析物的影響，定量更準(zhǔn)確。對于無法得到空白基質(zhì)的樣品，標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)合本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)計(jì)算公式可準(zhǔn)確獲得陽性樣品溶液濃度。
2.3 回收率、精密度和定量限
準(zhǔn)確稱取若干份10 g空白蘋果樣品，分別加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02、0.05、0.1 mg/kg 3個(gè)添加水平），靜置30 min后，按照1.3.2樣品前處理步驟制備樣品溶液，不同添加水平樣品制備6份平行樣以考察方法可行性及穩(wěn)定性。結(jié)果表明，3個(gè)添加水平下蘋果中毒死蜱回收率在99.3%～106.0%，精密度在3.6%～4.9%；蘋果中戊唑醇回收率在96.3%～103.8%，精密度在3.3%～4.2%，回收率和精密度均符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的要求[29]（表2）。
水利樞紐工程安全監(jiān)測系統(tǒng)在設(shè)計(jì)開發(fā)中，不僅涉及多個(gè)學(xué)科，還會涉及多個(gè)專業(yè)，因而在設(shè)計(jì)過程中能夠集中多個(gè)領(lǐng)域的優(yōu)勢。從專業(yè)知識的角度來說，水利樞紐工程安全監(jiān)測系統(tǒng)設(shè)計(jì)主要設(shè)計(jì)的專業(yè)有傳統(tǒng)的水利專業(yè)、現(xiàn)代的微電子專業(yè)、通信專業(yè)以及自動控制專業(yè)等。水利樞紐工程安全監(jiān)測系統(tǒng)開發(fā)是一項(xiàng)整體的工程，且建成后會發(fā)揮重要的作用。
表2 毒死蜱、戊唑醇線性方程及添加回收結(jié)果（n=6）
以10倍信噪比對應(yīng)的添加水平確定方法定量限。根據(jù)前處理稀釋倍數(shù)及樣品稱樣量，得到蘋果中毒死蜱和戊唑醇方法定量限分別為0.003 mg/kg、0.001 mg/kg，滿足日常檢測的需要[30]。
2.4 標(biāo)準(zhǔn)加入法改進(jìn)計(jì)算公式推導(dǎo)
對陽性待測樣品采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量時(shí)，以加入樣品中標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x軸），待測組分響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y軸）繪制陽性樣品的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1a）。常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算方式[23-26]是將標(biāo)準(zhǔn)曲線反向延長至與x軸相交，交點(diǎn)與原點(diǎn)間的距離對應(yīng)的質(zhì)量濃度即為待測組分的質(zhì)量濃度（y′=0時(shí)所對應(yīng)的x值），詳見常規(guī)式（1）。
式中：C為從基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的待測組分溶液濃度，單位與橫坐標(biāo)一致；b′為標(biāo)準(zhǔn)加入法基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；k′為標(biāo)準(zhǔn)加入法基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。
假設(shè)存在與測定樣品匹配的空白基質(zhì)，則以此空白基質(zhì)溶液同法可配制得陰性樣品的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1b）。比較2條標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，同類樣品基質(zhì)效應(yīng)相同，陰性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與陽性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的加標(biāo)質(zhì)量濃度相同，各點(diǎn)響應(yīng)值差別只有陽性樣品本底值A(chǔ)′。由于同一陽性樣品溶液中質(zhì)量濃度水平恒定，則本底濃度在相同儀器條件下的響應(yīng)值A(chǔ)′保持恒定，因此理論上2條標(biāo)準(zhǔn)曲線是斜率相等，截距不同的平行線段，截距差值即為陽性樣品的響應(yīng)值帶來的本底增量A′。故2條標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系有k′=k0，b0=b′-A′。
色譜分析中，空白基質(zhì)應(yīng)未檢出目標(biāo)物質(zhì)，即陰性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線0點(diǎn)的響應(yīng)值A(chǔ)0=0。在陽性樣品溶液中加入從0開始遞增的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，陽性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線0點(diǎn)的測得響應(yīng)值為A測=A′＋A0=A′＋0=A′。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，將待測物質(zhì)在儀器上的響應(yīng)A測帶入陰性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=k0x＋b0即可得出待測組分溶液濃度[31-32]。根據(jù)上述推導(dǎo)關(guān)系得改進(jìn)的式（2）。未知量k0、b0均轉(zhuǎn)化至已知k′、b′、A測，陽性樣品含量可解。
式中：A測為標(biāo)準(zhǔn)加入法陽性基質(zhì)標(biāo)曲0點(diǎn)的測得響應(yīng)值（內(nèi)標(biāo)法則為待測組分與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值之比）。
根據(jù)“最小二乘法”原則確定回歸方程，A測為標(biāo)準(zhǔn)加入法陽性基質(zhì)標(biāo)曲0點(diǎn)的測得響應(yīng)值，與直線方程存在一定的偏離度[33-34]，A測往往與b′并不重合，即|b′-A測|≠0。傳統(tǒng)計(jì)算公式以b′/k′計(jì)算樣品濃度，直接用截距b′代表陽性樣品響應(yīng)值A(chǔ)測，從而忽略了b′與A測之間差值對定量結(jié)果帶來的誤差，導(dǎo)致所得濃度不夠準(zhǔn)確。改進(jìn)計(jì)算公式克服了上述不足，更好地詮釋了濃度與響應(yīng)值之間的定量關(guān)系，由此得到更準(zhǔn)確的待測組分溶液濃度。
2.5 標(biāo)準(zhǔn)加入法的2種計(jì)算公式對結(jié)果的影響
按照1.3.2樣品前處理步驟，以回收樣品溶液為測定溶液，氮吹近干后加入20μL的內(nèi)標(biāo)工作液，加入1 mL從0開始遞增的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以復(fù)溶加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，待測組分定量離子與內(nèi)標(biāo)定量離子響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用“z-比分?jǐn)?shù)”評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)加入法的2種計(jì)算公式定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，詳見式（3）。
式中：x為樣品測定值；X為指定值（本實(shí)驗(yàn)為添加水平），σ為標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)|z|≤2時(shí)，測得結(jié)果滿意；當(dāng)2＜|z|＜3時(shí)，測得結(jié)果有問題（可疑）；當(dāng)|z|≥3時(shí)，測得結(jié)果不滿意（離群）。
從表3看出，2種計(jì)算公式得到的毒死蜱、戊唑醇樣品含量結(jié)果的z值均小于2，測試結(jié)果均滿意；2種組分根據(jù)改進(jìn)計(jì)算公式得到的z值均小于傳統(tǒng)計(jì)算公式得到的z值，改進(jìn)算法優(yōu)于傳統(tǒng)算法。2種計(jì)算公式得到的z值在低濃度添加水平下（0.02 mg/kg）差異不顯著，但在中高濃度添加水平下（0.05、0.1 mg/kg）z值差異顯著。改進(jìn)的計(jì)算公式得到的z值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)計(jì)算公式計(jì)算的z值，與真值更接近。基于標(biāo)準(zhǔn)加入法采用改進(jìn)公式計(jì)算樣品含量，得到的樣品結(jié)果準(zhǔn)確性更高，可靠性更強(qiáng)，為樣品準(zhǔn)確定量提供了新的解決方案。
表3 標(biāo)準(zhǔn)加入法不同計(jì)算方式對定量結(jié)果的影響（n=6）
3 結(jié) 論
本試驗(yàn)前處理在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.113的基礎(chǔ)上，基于標(biāo)準(zhǔn)加入法建立了蘋果中毒死蜱、戊唑醇?xì)埩袅康姆治觥Ｔ跇?biāo)準(zhǔn)加入法定量方式上，采用2種計(jì)算公式計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，常規(guī)和改進(jìn)計(jì)算公式均能滿足常規(guī)定量使用，但改進(jìn)計(jì)算公式得到的樣品含量準(zhǔn)確性和可靠性更高，適用于果蔬基質(zhì)中農(nóng)殘的準(zhǔn)確定量。當(dāng)前處理方法回收率滿足測定要求，操作穩(wěn)定性好。樣品中待測物質(zhì)溶液濃度在儀器上有較好的響應(yīng)時(shí)，基于標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)合改進(jìn)計(jì)算公式，也可用于能力驗(yàn)證樣品、特殊基質(zhì)樣品和內(nèi)源性物質(zhì)樣品的準(zhǔn)確定量。
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