武佳琪，黃金海

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

糖基化是最復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程之一，影響蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定性、半衰期、蛋白質(zhì)間相互作用和信號傳導(dǎo)運輸?shù)壬飳W(xué)過程［1］。附著的碳水化合物部分通過天冬酰胺（N-連接）側(cè)鏈的氮原子與肽或通過絲氨酸或蘇氨酸的氧原子（O-連接）連接至肽骨架N-X-S/T（X≠P）［2］，在不同糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，單糖殘基順序添加到目的蛋白上形成完整的糖鏈（圖1）。部分病毒蛋白可以受到糖基化的修飾，糖基化在囊膜病毒結(jié)構(gòu)蛋白的修飾中起重要作用［3］。病毒的糖蛋白可以介導(dǎo)其對宿主細胞的識別，結(jié)合以及入侵的整個感染過程，還可以幫助病毒逃避免疫系統(tǒng)的清除［4］。被感染的細胞也可以通過對病毒表面糖蛋白的識別而誘發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生細胞因子和抗體來殺滅病毒［5］。另外，宿主細胞上同樣存在可以被糖基化修飾的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在病毒侵入中也發(fā)揮重要作用。本文就糖基化修飾在囊膜病毒感染及免疫中的作用機制進行綜述，以期為抗病毒藥物和疫苗研制提供一定的理論基礎(chǔ)。

圖1 糖蛋白代表性的N-糖連接和O-糖連接類型

1 糖基化修飾與囊膜病毒感染

糖基化是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)中常見的修飾，大多數(shù)糖基化反應(yīng)發(fā)生在高爾基體上［6］。盡管初始單糖靶向糖蛋白或糖脂的轉(zhuǎn)移是在ER或ER膜上進行的，但隨后添加不同糖基構(gòu)成成熟聚糖是在高爾基體中發(fā)生的［7］。高爾基體膜上布滿了糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶和核苷酸糖轉(zhuǎn)運蛋白，其排列順序通常是從順式高爾基體到反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)（TGN），這樣每種酶活性都可以作用于通路上較早產(chǎn)生的特定底物上［8］。例如介導(dǎo)糖鏈末端唾液酸化修飾［9］的唾液酸轉(zhuǎn)移酶（Sialyltransferase，ST）家族［10］，它們可以定位于高爾基體上進行糖蛋白的特征修飾，賦予其識別功能。唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST）包含4種酶類（表1）可以特異性地將底物CMP-Neu5Ac（唾液酸胞苷單磷酸酯）上的唾液酸殘基轉(zhuǎn)移至新的糖基受體上。感染初期，病毒必須先借助宿主細胞表面的受體或附著因子來附著細胞。除了可以將病毒粘附到目標(biāo)細胞外，這些感染初期的相互作用通常是決定病毒組織特異性和宿主范圍的關(guān)鍵。在此過程中，唾液酸被廣泛使用，作為大量病毒的初始連接受體［11］。唾液酸在蛋白和脂類糖基化修飾中多以末端糖的形式存在，在病毒感染初期附著和侵染過程中發(fā)揮重要作用［12］。

表1 參與糖蛋白唾液酸化的唾液酸轉(zhuǎn)移酶類型

1.1 免疫逃避作用

宿主細胞為了抵抗外來病原體所采取的重要手段之一是產(chǎn)生中和抗體［13］。相應(yīng)地，一些囊膜病毒為了逃避中和抗體的免疫作用，會采取許多方式來阻斷或降低中和抗體的特異性，其中最常用的方式是利用自身囊膜上的糖蛋白所連接的寡糖遮蔽對應(yīng)的抗原表位，從而逃避抗體的中和作用［14］。例如豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV是一種有囊膜的RNA病毒，感染該病毒會導(dǎo)致豬的肺部癥狀和仔豬死亡，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展。而PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白GP5臨近中和表位，對該表位的糖基化修飾會導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生受阻［15］。

1.2 病毒粒子裝配

糖基化位點的添加或缺失還會改變病毒蛋白的折疊和結(jié)構(gòu)，從而影響病毒的組裝和增殖。使用糖苷酶抑制劑阻斷蛋白質(zhì)的糖基化修飾，會導(dǎo)致該蛋白錯誤折疊，無法發(fā)揮其正常功能［16］。如E1和E2蛋白屬于HCV包膜表面的糖蛋白，當(dāng)這兩種蛋白的糖基化被抑制后，蛋白質(zhì)無法正常轉(zhuǎn)運并分泌。L、M和S蛋白屬于HBV包膜表面的糖蛋白，當(dāng)這些蛋白的糖基化被抑制后，會導(dǎo)致病毒包膜的形成受阻［17］。

2 病毒蛋白糖基化

許多病毒具有嵌合著糖蛋白的脂質(zhì)層，包裹在病毒表面［18］，其中的糖蛋白受到糖基化修飾，并對病毒起保護性抗原的作用［19］。病毒蛋白一般具有糖基化類型各不相同的糖蛋白，經(jīng)過糖基化修飾的病毒蛋白在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，比如識別宿主細胞，促進膜融合，使病毒進入細胞以及介導(dǎo)病毒的免疫逃逸現(xiàn)象［20］。PRRSV在粘附和侵染PAM的過程中都對病毒囊膜表面的唾液酸具有依賴性［21］。存在其他類型的病毒與之相反是通過識別宿主細胞表面的唾液酸介導(dǎo)粘附的，例如一些輪狀病毒、冠狀病毒、腺病毒、JC病毒、呼吸道腸道病毒和鼠腦脊髓炎病毒等［22］。

2.1 識別宿主細胞表面受體

在病毒侵入細胞的過程中，識別并結(jié)合細胞表面受體是必不可少的環(huán)節(jié)，這個過程可以通過病毒囊膜表面蛋白的糖基化修飾介導(dǎo)。之前的研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染細胞是通過細胞表面受體識別病毒表面的唾液酸進行的，用于識別的唾液酸殘基并非位于宿主細胞膜上［23］。移除PRRSV非唾液酸的N端結(jié)合聚糖對感染無明顯影響，而移除PRRSV的N-糖苷鍵后可以降低PRRSV感染。研究表明，PRRSV囊膜表面的唾液酸與豬肺泡巨噬細胞上的唾液酸黏附素（pSn）有相互作用關(guān)系，而pSn可以通過其唾液酸依賴性介導(dǎo)PRRSV粘附［24］。PRRSV病毒入侵是通過囊膜上的多聚體與宿主細胞膜上的CD163受體結(jié)合來進行的［25］。PRRSV有4種功能性糖蛋白，分別為GP2a、GP3、GP4和GP5［26］。之前有研究表明，病毒侵入是通過PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP2和GP4結(jié)合細胞表面CD163受體所介導(dǎo)的［27］。GP2可以與其他2個糖蛋白GP3和GP4結(jié)合，形成多聚體復(fù)合物并結(jié)合宿主表面受體，在病毒增殖中發(fā)揮重要的作用［28］。

2.2 細胞膜融合

融合蛋白是一種位于病毒表面的糖蛋白，它可以介導(dǎo)病毒被膜和靶細胞質(zhì)膜的融合過程，從而幫助病毒粒子進入細胞［29］。許多病毒表面都有對應(yīng)的融合蛋白來介導(dǎo)膜融合。如副粘病毒的F蛋白（fusionprotein）有多個糖基化位點，而其中有4個位點（85、366、471、191）受到了糖基化修飾，去除前3個位點會降低病毒的膜融合活性［30］，導(dǎo)致膜融合受阻。表明糖基化修飾可以調(diào)節(jié)病毒的細胞膜融合活性［31］。

3 宿主蛋白糖基化

對于宿主細胞來說，宿主蛋白糖基化對自身的抗病毒功能至關(guān)重要。一些糖基化修飾可以抑制病毒的增殖和侵入，而一些糖基化修飾反而會促進病毒的侵染［32］。病毒被膜上的受體可以介導(dǎo)它與宿主細胞糖蛋白的識別作用，例如流感病毒表面具有唾液酸受體［33］，宿主細胞膜的糖鏈上帶有唾液酸殘基，它們可以特異性結(jié)合流感病毒［34］，并協(xié)助病毒進入宿主細胞。

3.1 先天免疫與適應(yīng)性免疫

在病毒侵染細胞的過程中，巨噬細胞可以分泌多種細胞因子來增強吞噬功能以及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)來發(fā)揮抗病毒作用［35］。白細胞介素、干擾素等均為炎癥相關(guān)細胞因子，其中一些細胞因子對炎癥反應(yīng)起促進作用，主要包括TNF-α、IL-1β等［36］。這些炎性因子大部分都是糖基化修飾的對象，在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，這些糖蛋白上的糖基被有序添加，延伸出糖鏈，并獲得相應(yīng)的生物學(xué)功能，在巨噬細胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮作用［37］。IL-1β、IL6等在病原體入侵后可以促發(fā)炎癥反應(yīng)，抵抗病毒增殖［38］。

病毒入侵細胞后會誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生大量免疫分子來發(fā)揮抗病毒作用［39］。而在免疫過程中釋放的許多免疫分子為糖蛋白，可以受到糖基化修飾，如免疫球蛋白G（IgG）。IgG可分為識別抗原類型的Fab和結(jié)合效應(yīng)分子及細胞的Fc兩部分［40］。IgG具有典型的炎癥效應(yīng)功能，例如抗體依賴性細胞毒性（ADCC）［41］，但是IgG在臨床上也經(jīng)常被用來發(fā)揮抗炎作用［42］。Fc聚糖的唾液酸化可激發(fā)IgG的抗炎活性，一旦其第297位的糖基化位點受到唾液酸轉(zhuǎn)移酶的修飾獲得唾液酸殘基，自身反應(yīng)性IgG便會由引起免疫性疾病的分子轉(zhuǎn)化為抑制炎癥反應(yīng)的蛋白［43］。唾液酸化IgG Fc結(jié)合Ⅱ型FcgR，增加抑制性FcgRIIB在炎癥效應(yīng)中的表達［44］。通過選擇性地對在炎癥部位沉積的IgG進行唾液化，可以減輕自身抗體介導(dǎo)的炎癥，并不影響血液循環(huán)系統(tǒng)中的IgG和循環(huán)中其他糖蛋白蛋白質(zhì)的唾液酸化［45］。因此，體內(nèi)唾液酸化可以幫助抑制病毒感染中適應(yīng)性免疫所引起的自身免疫疾病。

3.2 細胞噬性

細胞表面受體的糖基化修飾，對于病毒特異性靶向的宿主細胞類型有決定作用。不同病毒受體識別的半乳糖和唾液酸連接的形式有差別，而這種不同的連接形式通常因為物種差異而有所區(qū)別。比如SAα2，3Gal型半乳糖唾液酸連接形式通常表現(xiàn)在禽類胃腸道上皮細胞上，而與之相對應(yīng)，SAα2，3Gal型連接是禽流感病毒優(yōu)先結(jié)合的對象。再比如SAα2，6Gal型半乳糖唾液酸連接形式通常表現(xiàn)在人呼吸道上皮細胞上，而與之相對應(yīng)，人源的流感病毒更傾向于結(jié)合SAα2，6Gal型連接［46］。流感病毒具有不同的亞型，但都具有由HA1和HA2兩部分構(gòu)成的血凝素（HA）抗原表位，該表位可以通過結(jié)合靶細胞上的唾液酸實現(xiàn)病毒的入侵過程［47］。流感病毒識別的宿主細胞糖鏈類型，可以隨著病毒糖蛋白上氨基酸殘基的改變而發(fā)生變化［48］。例如將H3型流感病毒表面血凝素（HA）的非結(jié)合位點的205位的絲氨酸殘基改變?yōu)槔野彼釟埢?，病毒只能識別SAα2，6Gal型唾液酸，即使該位點距離受體結(jié)合位點更遠［49］。

PRRSV基于宿主細胞表面的特異性受體類型而對某些巨噬細胞亞群具有特異性，豬肺泡巨噬細胞（PAM）為PRRSV穩(wěn)定增長的細胞系之一［50］。目前已知在PAM上有3種PRRSV的特異性受體，分別是唾液酸黏附素、硫酸乙酰肝素和CD163［51］。細胞表面特異性受體的糖基化修飾，對于病毒的識別與靶向有特殊意義［52］。CD163是一種Ⅰ型跨膜蛋白，可受到糖基化的修飾［53］。CD163的跨膜區(qū)序列較保守，在病毒識別與細胞分化過程中扮演重要角色。硫酸乙酰肝素是一種高度硫酸化的線性多糖，在哺乳動物細胞表面以及細胞外基質(zhì)中普遍存在并調(diào)節(jié)相應(yīng)信號分子［54］。唾液酸黏附素和硫酸乙酰肝素分別介導(dǎo)PRRSV的粘附和入侵，是PRRSV特定靶向于PAM細胞的重要條件［55］。

4 總結(jié)與展望

糖基化修飾在囊膜病毒生物學(xué)中的作用非常廣泛，介導(dǎo)其入侵、裝配、釋放等細胞感染過程。關(guān)于在病毒感染中糖基化修飾的研究不僅能夠深入發(fā)掘病毒的致病機理，也可以為疾病的治療提供依據(jù)。同時，靶向于糖鏈的抗病毒藥物具有不干擾宿主細胞蛋白質(zhì)和核酸正常生成的優(yōu)勢，在抗病毒藥物和疫苗的研制中具有較高的研究價值。本文主要闡述了糖基化對不同類型糖蛋白的修飾以及在病毒感染細胞過程中的機制與功能，以期能為今后的抗病毒研究提供思路。然而，關(guān)于病毒糖基化的具體修飾過程和調(diào)控機制尚不明確，還需要進一步的探究。當(dāng)前隨著技術(shù)方法的不斷成熟，越來越多對糖基化修飾有調(diào)控作用的糖基轉(zhuǎn)移酶等相關(guān)酶類已被鑒定，為后續(xù)的研究提供了可供參考的資源和策略。