張 亮，向陳艷，袁 紅，譚 麗，易建平

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 醴陵市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 醴陵 412200）

番茄青枯病是茄科拉爾氏桿菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種嚴(yán)重威脅番茄生產(chǎn)的世界性土傳病害，可致番茄產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失以及品質(zhì)明顯降低[1]。該病害廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，在我國(guó)長(zhǎng)江以南各地尤其嚴(yán)重，且呈現(xiàn)由南向北蔓延態(tài)勢(shì)，已成為影響番茄等作物生產(chǎn)的最嚴(yán)重病害之一[2]。對(duì)番茄青枯病進(jìn)行傳統(tǒng)防控，效果均不理想，且存在危害生態(tài)或人體健康等風(fēng)險(xiǎn)，在此背景下，利用有益微生物抑制病原菌為手段的生物防治成為了人們關(guān)注的重點(diǎn)。在番茄青枯病的生物防治研究中，已見報(bào)道的多為無(wú)致病性的有益微生物，諸如多粘芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、假單胞菌等根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）[3-5]。根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性、平衡性是保障作物健康生長(zhǎng)的必要條件，土壤病原微生物的長(zhǎng)期破壞易致土壤細(xì)菌群落特別是有益細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性不再平衡合理，從而病害頻發(fā)、作物減產(chǎn)[6-9]。然而，人們對(duì)于根際促生菌等有益微生物如何影響青枯病害等逆境下微生物組成和功能多樣性演替規(guī)律的研究信息尚顯匱乏。多粘類芽孢桿菌LRS-1篩選于酸性水稻土壤，并在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)疫霉菌、青枯菌等土傳病原菌具有拮抗效果，能夠顯著降低相關(guān)土傳病害的病情指數(shù)，是優(yōu)良的生防菌株材料。筆者在此基礎(chǔ)之上，對(duì)“根際促生菌-番茄-青枯菌-病土壤微生物”的互作效應(yīng)進(jìn)行研究，以期揭示土壤有益微生物對(duì)病態(tài)根際土壤生態(tài)調(diào)控的微生物互作機(jī)制，為保障土壤生物逆境環(huán)境下作物的健康生長(zhǎng)和土壤生產(chǎn)力的可持續(xù)養(yǎng)護(hù)提供十分重要的理論價(jià)值與現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 供試土壤、病原菌與植株

供試土壤為菜園土，pH值5.8，有機(jī)質(zhì)32.76 g/kg，全氮24.3 g/kg，速效磷23.5 g/kg，速效鉀134 g/kg，采集于長(zhǎng)沙縣星港社區(qū)居民自種菜地。

供試生防菌為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）LRS-1(以下簡(jiǎn)稱LRS1)，保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院土壤微生物實(shí)驗(yàn)室；番茄青枯菌（Ralstonia solanacearum）為L(zhǎng)K1，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院分離與提供。

供試番茄品種為紅寶石。

1.2 培養(yǎng)基、試劑盒與引物

細(xì)菌NBY培養(yǎng)基配制：營(yíng)養(yǎng)肉湯粉8 g，酵母提取物2 g，磷酸氫二鉀2 g， 磷酸二氫鉀0.5 g，葡萄糖2.5 g，1mol/L七水合硫酸鎂 1 mL，加去離子水溶解定容至1 000 mL。試劑盒：土壤基因組DNA提取試劑盒（MP Biomedicals公司）。引物：細(xì)菌16S rRNA基因通用引物（奧科鼎盛生物科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

生防菌接種方法：泥炭根部包裹法[10-11]。即盆栽前，將生防菌接種于NBY培養(yǎng)基，并在26℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，隨后經(jīng)6 000 r/min離心及生理鹽水懸?。?09CFU/mL），由輻照滅菌泥炭粉配制成10%（V∶M）生防泥炭（108CFU/mL），備用。

感病土壤制備方法： 接種病原菌在26℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)于NBY培養(yǎng)基48 h，6 000 r/min離心，生理鹽水懸?。?06CFU/mL）后，與過(guò)20目篩土壤按1∶10（V∶M）比例混合制備成病土。

盆栽試驗(yàn)：設(shè)3個(gè)處理，分別為清水對(duì)照處理（CK）、青枯菌陽(yáng)性對(duì)照處理（RS）、生防處理（LRS1+RS），各處理20盆（直徑12 cm）。試驗(yàn)重復(fù)3次。每盆裝入300 g病土，移栽1株根部包裹有生防泥炭粉的番茄幼苗（2葉一心），以不接種的滅菌泥炭粉作為陰性對(duì)照，常規(guī)管理。

樣品采集：盆栽試驗(yàn)第30 d時(shí)，每個(gè)處理隨機(jī)挑選10盆番茄植株，挖取根系，剝離根外多余土壤，經(jīng)抖根法用滅菌毛刷收集緊貼根表的土壤于滅菌錫薄紙內(nèi)，混勻，液氮保存于－80℃冰箱，備用。

1.4 根際土壤DNA提取

試劑盒法提取根際土壤DNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)，滅菌DERS水稀釋至1 ng/μL。

1.5 16S rRNA 基因V3-V4區(qū)RSR擴(kuò)增

以27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）引 物進(jìn)行RSR擴(kuò)增。25 μL RSR反應(yīng)體系包括：5 μL緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.5 μL引 物（F/R）、0.5 μL DNA模板、0.5 μL聚合酶以及DERS無(wú)菌水。RSR運(yùn)行條件為：94℃ 3 min，30×（94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s），72℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。RSR產(chǎn)物純化后由上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行基于Illumina平臺(tái)的Miseq測(cè)序，完成對(duì)16S rRNA基因V3-V4區(qū)的檢測(cè)。

1.6 原始數(shù)據(jù)處理與分析

原始數(shù)據(jù)返回后，利用FLASH軟件對(duì)提出引物序列后的剩余序列進(jìn)行拼接，并通過(guò)QIIME軟件進(jìn)行過(guò)濾，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列對(duì)比分析，經(jīng)MEGA 7.0軟件獲得有效序列。隨后利用Usearch軟件對(duì)所有序列進(jìn)行提取，然后對(duì)提取出的fasta文件按照97%相似度水平劃分獲得物種OTUs，然后利用RDP在線數(shù)據(jù)庫(kù)，按照RDP數(shù)據(jù)庫(kù)將OTUs進(jìn)行分類，制作OTU豐度表，并注釋OTU系統(tǒng)學(xué)分類名稱。通過(guò)美吉生物云平臺(tái)分析多樣性指數(shù)、Venn圖、物種群落圖、單因素互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系等。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤細(xì)菌OTU多樣性

Alpha多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性，其中包括表征群落豐富度的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)、表征群落多樣性Shannon指數(shù)以及反映群落覆蓋度的指數(shù)。如表1所示，CK處理中Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)均為最高，且明顯高于其他兩個(gè)處理，說(shuō)明陰性對(duì)照土壤細(xì)菌群落豐富度最高，而RS與LRS1兩個(gè)處理的土壤細(xì)菌群落豐富度下降。Shannon指數(shù)以CK處理最高，而RS處理最低，表明陰性對(duì)照土壤中細(xì)菌群落多樣性最大，青枯病陽(yáng)性土壤細(xì)菌群落多樣性明顯降低，而接種生防菌LRS1則對(duì)提高青枯病土細(xì)菌群落多樣性有益。此外，接種生防菌LRS1有利于提高土壤細(xì)菌群落覆蓋度。

表1 根際細(xì)菌α多樣性分析

2.2 根際土壤細(xì)菌物種OTUs分布

就OTU水平而言，3個(gè)處理共獲得5 081個(gè)OTU，其中共同含有1 015個(gè)OTU。CK處理獨(dú)有1 026個(gè)OTU，LRS1處理1 181個(gè)OTU，RS處理獨(dú)有382個(gè)OTU。CK與LRS1共有1 233個(gè)OTU，CK與RS共有1 902個(gè)OTU，RS與LRS1共有1 387個(gè)OTU（圖1）。CK處理OTUs總數(shù)最高，LRS1與RS處理OTUs總數(shù)相近，但以RS處理OTUs最低。上述結(jié)果表明，接種生防菌LRS1有利于促進(jìn)青枯病害脅迫下的根際細(xì)菌組成相似性及其細(xì)菌種類組成。

圖1 根際細(xì)菌OTUs分布

2.3 根際土壤細(xì)菌群落物種差異

根據(jù)各處理根際土壤樣本OTU中代表序列的物種注釋結(jié)果，選取前10名的物種制成相對(duì)豐度柱狀圖。如圖2所示，在門分類學(xué)水平上排名前十的細(xì)菌分別為：放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、粘孢子門（Myxococcota）等，它們是優(yōu)勢(shì)物種類群。不同處理番茄根際細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌落在門水平上基本相似，但不同處理間細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)與相對(duì)豐度存在差異。例如放線菌門（Actinobacteria）在3個(gè)處理中相對(duì)豐度最高，并且占據(jù)著絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。放線菌門（Actinobacteria）屬于細(xì)菌中的革蘭氏陽(yáng)性菌群，與人類關(guān)系密切，分布廣泛，在提高土壤質(zhì)量與環(huán)境保護(hù)方面有重要地位。RS處理中放線菌門的相對(duì)豐度明顯低于其他兩個(gè)處理。在不同處理根際相對(duì)豐度中占據(jù)第二大類的變形菌門（Proteobacteria）是細(xì)菌中最大的門類，其物種和遺傳多樣性極為豐富，在土壤生態(tài)系統(tǒng)功能中占據(jù)著十分重要的位置（圖2）。

圖2 門水平上的根際細(xì)菌相對(duì)豐度

如圖3所示，就屬分類水平上平均豐度大于1 %的根際土壤細(xì)菌物種而言，CK處理主要有Xanthobacteraceaev、Micrococcaceae、Oryzihumus、Acidobacteriales、Paenarthrobacter、Gaiellales、Mycobacterium、Nocardioides、Gemmatimonas、Terrabacter、Intrasporangiaceae、Pseudarthrobacter、Methyloligellaceae等，未知細(xì)菌約占32.99 %；RS處理主要有Xanthobacteraceaev、Ralstrorinia、Micrococcaceae、Paenarthrobacter、Acidobacteriales、Gaiellales、Mycobacterium、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Candidatus_Solibacter等，未知細(xì)菌約占35.16%；LRS1處理主要有Xanthobacteraceaev、Micrococcaceae、Oryzihumus、Acidobacteriales、Ralstrorinia、Conexibacter、Gemmataceae、Paenibacillus等，未知細(xì)菌約占38.85%。接種多粘類芽孢桿菌LRS1后，Paenibacillus物種在LRS1處理中物種水平明顯提高，占比為2.32%，而病原菌Ralstrorinia物種占比大幅降低。上述結(jié)果表明，在青枯病原菌脅迫條件下，接種后的多粘類芽孢桿菌LRS1能夠良好定殖于番茄根際土壤，不僅降低了青枯病原菌物種豐度，還對(duì)根際細(xì)菌多樣性起到明顯的維持與促進(jìn)作用。

圖3 屬水平上的根際細(xì)菌群落

2.4 根際土壤細(xì)菌群落組成的PCA聚類分析

PCA聚類分析結(jié)果顯示主成分1（PC1）與主成分2（PC2）對(duì)各處理根際土壤細(xì)菌群落差異的解釋度不同。對(duì)照處理（CK）位于PC1負(fù)半軸和PC2正半軸，病原菌處理（RS）位于PC1負(fù)半軸和PC2負(fù)半軸，多粘類芽孢桿菌LRS1處理（LRS1）總體位于PC1正半軸和PC2正半軸，說(shuō)明各處理間的根際土壤細(xì)菌群落變化明顯（圖4）。

圖4 根際細(xì)菌群落的PCA聚類分析

2.5 根際土壤細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)分析

群落互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，不同處理間根際土壤細(xì)菌群落互作網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜程度（圖5）、網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性（表2）以及網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系（圖5）均存在明顯差異。與陰性對(duì)照（CK）相比，病原菌陽(yáng)性（RS）處理的網(wǎng)絡(luò)相似度最低且群落間負(fù)面交互作用明顯增強(qiáng)，而接種多粘類芽孢桿菌LRS1有利于根際細(xì)菌群落互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的穩(wěn)定與和諧。

圖5 不同處理根際細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

表2 不同處理細(xì)菌生態(tài)網(wǎng)絡(luò)整體性質(zhì)對(duì)比

3 結(jié)論與討論

尋求綠色、安全、高效的生物防治手段對(duì)作物土傳病害進(jìn)行防控已成為維護(hù)土壤生態(tài)和諧與保障土壤肥力發(fā)揮的迫切需求[12-13]。此試驗(yàn)中多粘類芽孢桿菌LRS-1從水稻土壤中分離鑒定，該菌株可對(duì)辣椒疫霉菌、黃瓜疫霉菌以及番茄青枯菌等多種土傳病原微生物產(chǎn)生有效的拮抗防病能力，是研究土壤病害防控的良好材料[14-15]。

根際土壤環(huán)境對(duì)作物生長(zhǎng)具有特殊意義，是作物根系與土壤微生物互作最為密切的微生態(tài)圈，該域內(nèi)各類環(huán)境因子、根系分泌物以及微生物群落相互影響、相互制約，從而對(duì)作物生長(zhǎng)起到其他土壤環(huán)境無(wú)法比擬的作用[16-17]。根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性、平衡性是保障作物健康生長(zhǎng)的必要條件，土傳病害發(fā)生嚴(yán)重的土壤受病原微生物的長(zhǎng)期破壞導(dǎo)致其土壤中細(xì)菌群落，特別是有益細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性不再平衡合理，導(dǎo)致病害頻發(fā)、作物減產(chǎn)，不僅嚴(yán)重威脅土壤生態(tài)質(zhì)量狀況，而且嚴(yán)重制約農(nóng)作物種植產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[18-20]。前期試驗(yàn)結(jié)果顯示接種多粘類芽孢桿菌LRS-1后，該生防菌不僅能力在辣椒根際土壤良好定殖，還對(duì)改善辣椒疫霉病害根際土壤微生物多樣性具有積極意義[21]。然而，人們對(duì)于根際促生菌等有益微生物如何影響青枯病害等逆境下微生物組成和功能多樣性演替規(guī)律的研究信息尚顯匱乏，這是因?yàn)橥庠从幸嫖⑸锱c病態(tài)逆境土壤微生物之間，不僅是拮抗菌—病原菌的簡(jiǎn)單拮抗，還涉及有益功能微生物菌種屬性以及與土壤中其他未知土著微生物種群間的競(jìng)爭(zhēng)、協(xié)同等復(fù)雜關(guān)系[18]。

此研究結(jié)果表明，接種生防菌LRS-1不僅能夠提高青枯病態(tài)根際土壤微生物α指數(shù)的豐富度和覆蓋度，還能明顯降低青枯病原菌物種豐度并利于根際細(xì)菌群落多樣性的維持穩(wěn)定。從互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果來(lái)看，青枯菌陽(yáng)性對(duì)照處理根際細(xì)菌負(fù)面互作關(guān)系明顯增加，而接種生防菌LRS-1后整體群落共線性網(wǎng)絡(luò)趨于穩(wěn)定，互作關(guān)系和諧，這與現(xiàn)有相關(guān)報(bào)導(dǎo)結(jié)論結(jié)果相符[22-24]。綜上所述，該研究結(jié)果為“生防菌—青枯病原菌—病土微生物”體系互作機(jī)理研究提供了參考依據(jù)，在保障土壤作物健康生長(zhǎng)和土壤生產(chǎn)力可持續(xù)養(yǎng)護(hù)方面具有重要的理論與應(yīng)用價(jià)值。