呂靜祎，丁思楊，張俊虎，徐冬樂(lè)，孫明宇，張瀠支，葛永紅，勵(lì)建榮*

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要包括超氧陰離子自由基（O2-·）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等，是對(duì)生命活動(dòng)具有重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)物。研究表明，ROS是影響植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化和凋亡、導(dǎo)致植物衰老的主要原因之一[1-2]。果實(shí)的后熟衰老過(guò)程是ROS代謝與氧化的過(guò)程[3-4]。植物體內(nèi)對(duì)ROS的清除系統(tǒng)主要包括兩類：一類是酶促清除系統(tǒng)，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化酶（ascorbate peroxidase，APX）等抗氧化酶類；一類是非酶促清除系統(tǒng)，主要是一些抗氧化物質(zhì)，如抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等[5]。

蘋(píng)果屬于呼吸躍變型果實(shí)，是我國(guó)主產(chǎn)水果之一[6]。 按照蘋(píng)果的成熟期早晚差異可分為早熟品種、中熟品種和晚熟品種，其中晚熟品種最耐貯藏，中、早熟品種則不耐貯藏。對(duì)棗、梨、葡萄及杏等果實(shí)上的研究表明，ROS代謝與不同品種果實(shí)的耐貯藏性密切相關(guān)[7-10]。遼寧省是我國(guó)重點(diǎn)蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)之一，主栽品種包括‘金冠’‘富士’‘寒富’‘國(guó)光’等。其中，‘金冠’是中熟品種，采后易失水皺縮、軟化，易患傳染性果腐病等，貨架期不超過(guò)1 個(gè)月，不耐貯藏[11-12]；而‘富士’晚熟品種采后呼吸代謝低，耐貯藏，常溫下可貯藏3～4 個(gè)月[13]?！鸸凇汀皇俊彩鞘澜缟系膬纱笾髟云贩N。本研究以‘金冠’和‘富士’兩個(gè)蘋(píng)果品種為試材，分析常溫后熟期間ROS代謝相關(guān)變化，旨在為進(jìn)一步深入研究不同品種蘋(píng)果耐貯藏性差異的分子機(jī)理提供理論依據(jù)，也為找到新的蘋(píng)果貯藏保鮮方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘金冠’與‘富士’蘋(píng)果分別于2017年9月16日和2017年10月7日采于遼寧錦州一果園。隨機(jī)選取大小、成熟度一致，無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷的‘金冠’蘋(píng)果150 個(gè)、‘富士’蘋(píng)果390 個(gè)，分別用5 層瓦楞超硬紙板箱包裝，每箱30 個(gè)果，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、α-萘胺、冰醋酸、濃氨水、硫酸、四氯化鈦、 硫代巴比妥酸、鹽酸、丙酮、氮藍(lán)四唑、三氯乙酸、無(wú)水醋酸鈉、愈創(chuàng)木酚等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722N可見(jiàn)分光光度計(jì)、GXH-3051H型果蔬呼吸測(cè)定儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、GC-14A型氣相色譜儀 日本島津公司； GY-3指針式水果硬度計(jì) 浙江托普儀器有限公司；TGL-16高速冷凍離心機(jī) 湖南湘立科學(xué)儀器有限 公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋(píng)果貯藏

蘋(píng)果于（23±2）℃、相對(duì)濕度為（65±5）%的條件下貯藏。每7 d分別隨機(jī)取15 個(gè)果實(shí)，進(jìn)行硬度、呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量的測(cè)定；并分別選取6 個(gè)果實(shí)，將果肉切成邊長(zhǎng)約0.2 cm的正方體后用液氮速凍混勻，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 硬度、呼吸強(qiáng)度及乙烯釋放量的測(cè)定

參考Lü Jingyi等[14]的方法，選取15 個(gè)蘋(píng)果測(cè)定呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量。將15 個(gè)果實(shí)分為3 份，每份5 個(gè)，稱質(zhì)量后置于12 L干燥器中常溫密封1 h，然后收集1.0 mL氣體，用氣相色譜儀測(cè)定呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量，測(cè)定結(jié)果取平均值。呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量的結(jié)果分別以每秒每千克果實(shí)釋放的CO2物質(zhì)的量和釋放的乙烯物質(zhì)的量表示，單位均為nmol/（kg·s）。隨后對(duì)果實(shí)進(jìn)行硬度的測(cè)定，在每個(gè)果實(shí)的赤道部位，間隔等距離選擇3 個(gè)點(diǎn)，削去一小塊厚約1 mm 的果皮，用GY-3指針式水果硬度計(jì)測(cè)定此3 個(gè)位置處果肉的硬度。

1.3.4 SOD、POD、CAT、APX和谷胱甘肽還原酶 活力的測(cè)定

SOD與POD活力的測(cè)定參考王陽(yáng)等的方法[17]。CAT活力的測(cè)定參考Wang Yousheng等的方法[18]。APX活力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]。谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活力的測(cè)定參考Labo等的方法[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

上述各指標(biāo)均重復(fù)取樣3 次，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖，用SPSS 22對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果貯藏過(guò)程中硬度、乙烯釋放量和呼吸強(qiáng)度的變化

如圖1A所示，兩個(gè)品種的果肉硬度在整個(gè)貯藏期間呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，‘金冠’在貯藏35 d時(shí)的果肉硬度為4.80 kg/cm2，而同一時(shí)間‘富士’的果肉硬度則為7.97 kg/cm2，是‘金冠’的1.66 倍。如圖1B～C所示，‘金冠’果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量均在貯藏28 d時(shí)達(dá)到高峰，而‘富士’則在貯藏77 d時(shí)達(dá)到高峰?！鸸凇麑?shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量在貯藏期間均顯著 或極顯著高于‘富士’（P＜0.05、P＜0.01），且峰值分別為‘富士’的2.70 倍和2.22 倍?？梢?jiàn)，‘金冠’由于高的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量，成熟衰老較快，因此貯藏期短?！鸸凇c‘富士’分別在第35天和第105天時(shí)果實(shí)硬度很低，已失去銷售和食用價(jià)值，故本實(shí)驗(yàn)中‘金冠’與‘富士’的貯藏終點(diǎn)分別為第35天和第105天。

圖1 不同品種蘋(píng)果果實(shí)在貯藏期間硬度（A）、呼吸強(qiáng)度（B）和 乙烯釋放量（C）的變化Fig.1 Changes in firmness (A), respiration rate (B) and ethylene production (C) of different apple cultivars during postharvest storage

2.2 蘋(píng)果貯藏過(guò)程中·產(chǎn)生速率、H2O2含量及MDA含量的變化

圖2 不同品種蘋(píng)果貯藏期間·產(chǎn)生速率（A）、H2O2含量（B）和MDA含量（C）變化Fig.2 Changes in production rate (A), H2O2 content(B) and MDA content (C) of different apple cultivars during postharvest storage

2.3 蘋(píng)果貯藏過(guò)程中ROS代謝相關(guān)酶活力的變化

如圖3所示，‘金冠’中的SOD、POD、CAT活力在貯藏期間顯著或極顯著高于‘富士’?！鸸凇腟OD和CAT活力峰值分別出現(xiàn)在28、21 d，POD活力高峰出現(xiàn)在14 d，而‘富士’中這3 種酶的活力峰值均則出現(xiàn)在貯藏77 d?！鸸凇械腟OD、POD和CAT活力峰值分別為‘富士’的1.12、1.59、3.49 倍。

圖3 不同品種蘋(píng)果在貯藏期間SOD（A）、POD（B） 和CAT（C）的活力變化Fig.3 Changes in activities of SOD (A), POD (B) and CAT (C) in different apple cultivars during postharvest storage

2.4 蘋(píng)果貯藏過(guò)程中AsA含量、APΧ及GR活力的變化

如圖4A所示，兩個(gè)品種蘋(píng)果的AsA含量在整個(gè)貯藏期間逐漸下降，其中，‘富士’蘋(píng)果中的AsA含量顯著或極顯著高于‘金冠’蘋(píng)果（P＜0.05、P＜0.01）。在貯藏35 d后，‘富士’的AsA含量是‘金冠’的3.08 倍。如圖4B所示，‘金冠’和‘富士’的APΧ活力分別在貯藏21 d和貯藏77 d達(dá)到峰值，且‘金冠’的活力峰值是‘富士’的1.95 倍。如圖4C所示，在貯藏前28 d，‘金冠’的GR活力略高于‘富士’?！鸸凇汀皇俊O(píng)果GR活力分別在28 d和77 d出現(xiàn)峰值，且‘富士’的峰值是‘金冠’峰值的2.11 倍（圖4C）。

圖4 不同品種蘋(píng)果貯藏期間AsA含量（A）和APX（B）、 GR（C）活力的變化Fig.4 Changes in AsA content (A), APX activity (B) and GR activity (C) of different apple cultivars during postharvest storage

3 討 論

呼吸作用是基本的生命現(xiàn)象，蘋(píng)果是典型的呼吸躍變型果實(shí)。呼吸躍變型果實(shí)在達(dá)到呼吸躍變高峰后，食用品質(zhì)迅速下降，很快便會(huì)失去耐貯藏性[21]。呼吸躍變的發(fā)生意味著果實(shí)衰老的開(kāi)始。乙烯是促進(jìn)躍變型果實(shí)成熟的重要內(nèi)源激素，呼吸躍變型果實(shí)呼吸高峰的出現(xiàn)常常伴隨著乙烯合成的迅速增加[21]。本研究中，‘金冠’的呼吸高峰和乙烯高峰出現(xiàn)時(shí)間早于‘富士’，同時(shí)高峰值都大于‘富士’，表明‘金冠’在常溫貯藏期間的呼吸代謝旺盛，后熟速度比‘富士’快，也比‘富士’提前進(jìn)入衰老階段，因此不耐貯藏。此外，果肉硬度是衡量耐貯性的重要指標(biāo)[22]。由于‘金冠’成熟衰老速度比‘富士’快，在果肉硬度上則表現(xiàn)為硬度持續(xù)下降，軟化速度快，在35 d的時(shí)候硬度為4.80 kg /cm2，果肉已經(jīng)綿軟，失去商品價(jià)值，而‘富士’在同一時(shí)間硬度為7.97 kg /cm2，仍保持較好的貯藏品質(zhì)。

果蔬在正常生命活動(dòng)中所需的O2中有1%會(huì)被傳送到線粒體、葉綠體以及過(guò)氧化物酶體中用以生成ROS，高濃度的ROS會(huì)造成生物分子的損害，ROS的大量積累 對(duì)果蔬細(xì)胞有毒性，會(huì)引發(fā)膜脂過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)被破壞，加速果實(shí)衰老[2,23]。通常將H2O2和O2-·等ROS水平和MDA含量作為衡量果實(shí)組織衰老程度的重要指標(biāo)[15]。 本研究中‘金冠’的O2-·產(chǎn)生速率、H2O2和MDA的含量在常溫貯藏期間（前35 d）均高于‘富士’蘋(píng)果，高水平的ROS導(dǎo)致其膜脂過(guò)氧化加劇，進(jìn)一步加速果實(shí)組織衰老，使其衰老程度在貯藏前35 d遠(yuǎn)高于‘富士’。O2-·可以通過(guò)SOD轉(zhuǎn)化為H2O2，然后可以通過(guò)CAT、POD和APΧ去除H2O2[24]。本研究發(fā)現(xiàn)‘金冠’中SOD、POD和CAT活力在貯藏期間高于‘富士’，可能是由于高的ROS水平需要高的酶活性進(jìn)行代謝[25]。謝忠斌等在乙烯處理后的菠蘿蜜果實(shí)上也觀察到H2O2等ROS水平增加的同時(shí)伴隨著SOD、CAT等酶活力增加的現(xiàn)象[26]。需要注意的是，即使是‘金冠’的ROS代謝相關(guān)酶活性在常溫貯藏期間高于‘富士’，但其ROS水平也高于‘富士’，成熟衰老速度比‘富士’快，推測(cè)可能是由于‘金冠’果實(shí)中ROS代謝能力不足以清除過(guò)量積累的ROS。

AsA是AsA-GSH循環(huán)中的重要抗氧化劑，它在APΧ作用下，以自身被氧化形成脫氫抗壞血酸為代價(jià)，將H2O2還原成H2O[27]。APΧ和GR是AsA-GSH循環(huán)中的兩種關(guān)鍵酶，是抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵參與者[28-29]。在AsAGSH循環(huán)中，GR可催化氧化型谷胱甘肽（glutathiol，GSSG）還原形成GSH，GSH又在脫氫抗壞血酸還原酶作用下將脫氫抗壞血酸還原成AsA，以補(bǔ)充AsA[30]。本研究中，‘金冠’在常溫貯藏期間的APΧ活力和GR活力高于‘富士’，而AsA含量低于‘富士’，可能是與‘富士’相比，‘金冠’的AsA被APΧ氧化的量不足以通過(guò)AsA-GSH循環(huán)進(jìn)行補(bǔ)充，因此造成其AsA含量低。H2O2可以在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，被認(rèn)為是ROS的信號(hào)物質(zhì)，其在植物體內(nèi)產(chǎn)生途徑較多，除了通過(guò)O2-·的歧化反應(yīng)生成外，還可通過(guò)酶促反應(yīng)生成[29]。與‘富士’相比，‘金冠’在常溫貯藏期間的高H2O2含量是否與其較低的AsA水平有必然聯(lián)系還需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，‘金冠’在常溫貯藏期間呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放速率、MDA含量、ROS水平和與ROS代謝有關(guān)的酶活力均高于‘富士’，成熟衰老速度快，貯藏期短。因此，不同品種蘋(píng)果果實(shí)的耐貯藏性差異與體內(nèi)ROS水平密切相關(guān)，但考慮到ROS產(chǎn)生和清除體系復(fù)雜性，蘋(píng)果果實(shí)的耐貯藏性與ROS代謝能力的聯(lián)系需要進(jìn)一步研究闡明。今后應(yīng)當(dāng)在分子水平圍繞不同品種蘋(píng)果采后ROS代謝差異的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究與探討。