崔曉東，范鑫，閆紅，王轉(zhuǎn)花，李晨

（1. 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；2. 山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物工程系，山西 太原 030006）

0 引言

線粒體作為真核細(xì)胞不可或缺的供能細(xì)胞器，是細(xì)胞凋亡的激活系統(tǒng)，還具備合成膽固醇及血紅素并調(diào)控細(xì)胞增殖和代謝的能力［1］。線粒體，擁有自身的遺傳物質(zhì)及遺傳體系，但超過99%線粒體蛋白質(zhì)由核基因編碼，在胞質(zhì)中合成前體蛋白，通過線粒體膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體［2-3］。其中，前導(dǎo)肽運(yùn)輸途徑是胞內(nèi)合成的線粒體前體蛋白質(zhì)向線粒體基質(zhì)運(yùn)輸?shù)慕?jīng)典途徑。線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶（translocase of outer mitochondrial membrane，TOM），是鑲嵌在線粒體外膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體，負(fù)責(zé)將細(xì)胞質(zhì)中合成的線粒體前體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)線粒體。TOM 系統(tǒng)由一系列復(fù)合物組成，其中Tom20 和Tom22 負(fù)責(zé)識(shí)別具有N 端前導(dǎo)肽的線粒體前體蛋白，并傳遞給Tom40 通道，最終將前體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體不同區(qū)域發(fā)揮相應(yīng)的作用［4-6］。線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)異常，可以引起一系列的疾病，如丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）前導(dǎo)肽中第216 位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楦彼岷?，進(jìn)入線粒體的PDH 含量相對(duì)減少，導(dǎo)致丙酮酸脫氫酶缺乏癥，是嬰兒和兒童原發(fā)性乳酸酸中毒的最常見原因［7-8］；原發(fā)性I 型高草酸尿癥是由于谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine/glyoxylate aminotransferase 1，AGT）第11位脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?，產(chǎn)生弱的線粒體靶向序列，使該酶錯(cuò)誤定位到線粒體，AGT 的錯(cuò)誤定位破壞了過氧化物酶體功能，導(dǎo)致乙醛酸被氧化成草酸鹽，并在腎臟和泌尿系統(tǒng)中沉積草酸鈣，最終導(dǎo)致腎功能衰竭［9-10］。在腫瘤細(xì)胞中，線粒體功能異常與腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的無限增殖、代謝異常、凋亡抵抗、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性表型關(guān)系密切。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些具有線粒體靶向作用的抗腫瘤藥物，如紫杉醇，多柔比星，喜樹堿等，但這些藥物通常是多靶點(diǎn)的，會(huì)帶來一定的副作用，造成腫瘤的多藥耐受［11］；二氫葉酸還原酶可以被線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基信號(hào)序列導(dǎo)入到線粒體中［12］，使線粒體功能異常。因此，靶向線粒體TOM 系統(tǒng)，通過改變或影響線粒體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，或引導(dǎo)異源蛋白進(jìn)入線粒體，抑制線粒體正常功能，也是一種潛在的腫瘤治療的方式。

重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑（recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI）是一種體外重組獲得的分子量為7.9 kD 的Potato I 型蛋白酶抑制劑［13］。將rBTI 的胰蛋白酶抑制活性位點(diǎn)（45 位精氨酸）突變后，失去了對(duì)胰蛋白酶活性的抑制，但其對(duì)Hep G2 細(xì)胞增殖抑制作用未發(fā)生顯著變化，表明rBTI的抑制活性位點(diǎn)不影響其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，可能與rBTI 的其他結(jié)構(gòu)有關(guān)［13-14］。隨后研究發(fā)現(xiàn)，rBTI 可以通過誘導(dǎo)線粒體損傷并通過自噬作用將損傷線粒體清除，并且顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，免疫共沉淀結(jié)果表明，rBTI 可以與Tom20 相互作用［15］。晶體結(jié)構(gòu)及氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，rBTI的三維結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)α-螺旋（GSKAAKIIENE）［16］，其性質(zhì)與線粒體乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）N 端前導(dǎo)肽（pALDH）性質(zhì)非常相似（如圖1），我們推測該α-螺旋可能會(huì)介導(dǎo)rBTI 與線粒體的相互作用，是rBTI 抑制腫瘤增殖的活性區(qū)域。因此，對(duì)rBTI 的α-螺旋結(jié)構(gòu)中的正電荷氨基酸（賴氨酸）在rBTI 抑制腫瘤增殖中的作用進(jìn)行了研究，明確了該螺旋是rBTI 發(fā)揮抗癌活性的區(qū)域，并獲得了兩種對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷更加高效的突變體。該研究也為明確植物中Potato I 型抑制劑結(jié)構(gòu)與抗腫瘤效應(yīng)的研究提供新的視角，為靶向線粒體藥物的設(shè)計(jì)及研發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)。

圖1 rBTI 的α-螺旋與線粒體乙醛脫氫酶N 端前導(dǎo)肽的比較Fig. 1 Comparison of α-helix in rBTI with presequence peptide of aldehyde dehydrogenase

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

pExSec I-BTI質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。人肝癌細(xì)胞株Hep G2（實(shí)驗(yàn)室保存）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibico 公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；TaKa-Ra MutanBEST 突變?cè)噭┖校═aKaRa，中國大連）；胰蛋白酶和四甲基偶氮唑藍(lán)（北京索萊寶公司）；二甲基亞砜（DMSO），Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對(duì)硝基酰胺鹽酸鹽（BApNA），胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl，DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒，IPTG，Kana 等（Sangon Biotech，中國上海）；E.coliBL21（DE3）實(shí)驗(yàn)室保存菌；內(nèi)切酶BamHI，NdeI，T4 DNA 連接酶等（Thermo Fisher，美國）。其他試劑為國產(chǎn)試劑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取出凍存于液氮中的人肝癌Hep G2 細(xì)胞株，并快速放入37 ℃水浴中，同時(shí)不斷搖動(dòng)加速其融化，接著以1 000 r/min 離心5 min，棄去保存液，加入1 mL 配制好的培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清，100 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素），緩慢吹打至均勻。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，加入一定量的培養(yǎng)基，混勻后放置在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。Hep G2 細(xì)胞貼壁生長，每2 天～3 天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 rBTI突變體的重組表達(dá)及純化

根據(jù)突變?cè)噭┖姓f明書及rBTI 基因序列，設(shè)計(jì)BTI 第20 位、23 位賴氨酸單突變以及20/23 位雙突變引物（見表1），并以pExSec I-BTI質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。質(zhì)粒經(jīng)測序后篩選突變正確的單克隆菌株，提取相應(yīng)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)。將含有上述質(zhì)粒的表達(dá)菌株在含終濃度為25 mg/L 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37 ℃，180 r/min）至OD 值為0.6 時(shí)，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h。超聲破碎后，離心收取上清液，置于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱出去部分雜蛋白，再經(jīng)陰離子交換層析分離純化rBTI 及突變體蛋白。

表1 rBTI的突變引物Table 1 Mutation primers for rBTI

1.4 rBTI對(duì)胰蛋白酶抑制活性分析

通過胰蛋白酶對(duì)底物BApNA 的水解速率測得rBTI 及突變體對(duì)胰蛋白酶的抑制活性［13］。測活體系 包 括4.4 mL 緩 沖 液（0.1 mol/L Tris-HCl，pH8.0，含0.01 mol/L CaCl2），加入同濃度20 μL 的rBTI 或突變體樣品和1 mg/mL 胰蛋白酶，充分混勻水浴10 min。加入BApNA 底物至其終濃度為0.15 mol/L ，混勻后水浴10 min，加入500 μL 的乙酸（33%）終止反應(yīng)。405 nm 處檢測BApNA 水解產(chǎn)物p-Nitroanilide 的OD 值。測定rBTI 及突變體的抑制常數(shù)Ki，rBTI 及突變體的濃度分別為0.05，0.1，0.2，0.3 μmol/L，測得的底物BApNA 濃度分別為1×10-5μmol/L 和2×10-5μmol/L。以rBTI 或突變體濃度為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)作圖，交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)即為-Ki。實(shí)驗(yàn)中水浴溫度均為37 ℃。

1.5 圓二色譜分析

在0.1 cm 的石英比色皿中加入rBTI 及突變體，其濃度為0.2 mg/mL，并通過Chirascan qCD 掃描195 nm～260 nm 區(qū)域，掃描重復(fù)3 次。3 次掃描的平均值減去試劑本底值（緩沖液PBS）為最終結(jié)果。測試不同樣品時(shí)，用PBS 多次沖洗確保測試準(zhǔn)確。

1.6 rBTI中螺旋區(qū)多肽的合成

為了進(jìn)一步確定rBTI 中α-螺旋是否是抑制腫瘤增殖的活性區(qū)域，對(duì)rBTI 的α-螺旋區(qū)的11 個(gè)氨基酸進(jìn)行了人工合成，同時(shí)合成了該螺旋區(qū)段中賴氨酸分別變?yōu)楸彼岬亩嚯模ū?）。多肽由Sangon Biotech（中國上海）合成N-9-芴甲氧羰基（FMOC）化學(xué)的固相方法。質(zhì)譜鑒定多肽的分子量，最終獲得的多肽純度在95%以上，通過反相高效液相色譜（RP-HPLC）測得。

表2 來源rBTI及突變體中的多肽序列Table 2 Amino acid sequences of the peptides from rBTI and mutants

1.7 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期Hep G2 細(xì)胞，接種于96 孔板（每孔100 μL）約5×103個(gè)細(xì)胞，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，分別用不同濃度rBTI、rBTI-K20A、rBTI-K23A 和rBTI-K20A/K23A處理（或合成多肽），同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，每孔終體積為200 μL，置于培養(yǎng)箱24 h。取0.5%MTT 溶液于每孔20 μL，置于培養(yǎng)箱4 h，移除孔中液體，將DMSO 加入孔中，每孔150 μL ，室溫緩速振至結(jié)晶物完全溶解，酶標(biāo)儀測定490 nm 處的OD 值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)中未標(biāo)明溫度時(shí)，均在37 ℃下進(jìn)行。細(xì)胞存活率（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.8 ATP含量測定

按每孔5 000 個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞接種于不透光的96 孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別用25 μg/mL 和50 μg/mL 的rBTI 及3 種突變體（或合成多肽）處理細(xì)胞48 h，棄去培養(yǎng)基，每孔再加入100 μL 新鮮DMEM培養(yǎng)基，室溫平衡30 min。加入已混勻好的Cell Titer-Glo?試劑100 μL，搖床震蕩培養(yǎng)2 min 充分裂解細(xì)胞，再置于室溫孵育10 min，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測發(fā)光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。腫瘤細(xì)胞存活率計(jì)算方法為：細(xì)胞ATP 相對(duì)含量（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及線粒體形態(tài)分析

接種適量的對(duì)數(shù)期Hep G2 細(xì)胞懸液于6 孔板，每孔補(bǔ)加培養(yǎng)基至2 mL，當(dāng)細(xì)胞生長到約80%時(shí)，執(zhí)行轉(zhuǎn)染程序。4 μg pDsRed2-Mito 質(zhì)粒和6 μL 轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，加入400 μL 無血清培養(yǎng)基，孵育20 min。在不移除原培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，向每孔分別加400 μL 提前配置的混合液，然后輕搖混勻，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。6 孔板中加入適量的上述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸液，當(dāng)Hep G2 貼壁后，分別用處理好的50 μg/mL的rBTI 及其突變體作用于細(xì)胞12 h。移除培養(yǎng)基，加入提前放置室溫下的PBS，輕晃5 min，漂洗3 次。室溫下用Hoechst 33 258（15 μg/mL）染核10 min，再漂洗3 次。滴5 μL 抗熒光猝滅封片劑至載玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，所有圖形結(jié)果至少通過3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得。用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各組數(shù)據(jù)（t 檢驗(yàn)），參照各自對(duì)照組：*P＜0.05 為差異顯著，**P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 rBTI及突變體的重組制備

按照1.3 的方法，采用定點(diǎn)突變以及大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，分別制備rBTI 及3 種突變體。測序正確的4種菌株，蛋白質(zhì)均以可溶形式表達(dá)。根據(jù)rBTI 熱穩(wěn)定性較好的特點(diǎn)［13］，將破碎后的菌液，12 000 r/min 離心10 min，上清液放置80 ℃加熱30 min，4 ℃冷卻20 min，12 000 r/min 離心除去沉淀蛋白，再采用ResourceTMQ陰離子柱對(duì)上清液進(jìn)行純化，經(jīng)脫鹽后得到所需蛋白。SDS-PAGE 檢測純化的蛋白，結(jié)果如圖2 所示，rBTI及3 種突變體都得到了較純的樣品。

圖2 SDS-PAGE 分析rBTI 及其突變體。M 為蛋白Marker；泳道1 為純化的rBTI 蛋白；泳道2 為純化的rBTI-K20A蛋白；泳道3 為純化的rBTI-K23A 蛋白；泳道4 為純化的rBTI-K20/23A 蛋白Fig. 2 SDS-PAGE analysis of rBTI and its mutants. M：Molecular markers；lane 1：purified rBTI；lane 2：rBTIK20A；lane 3：rBTI-K23A；lane 4：rBTI-K20A/K23A

2.2 rBTI及其突變體對(duì)胰蛋白酶的抑制活性沒有發(fā)生改變

如圖3A 所示，rBTI 及其突變體對(duì)胰蛋白酶的抑制活性基本相同，沒有顯著變化。采用Dixon 作圖法，得到rBTI 及突變體的抑制常數(shù)Ki。rBTI、rBTI-K20A、rBTI-K23A 和rBTI-K20A/K23A 對(duì)胰 蛋 白 酶Ki分 別 為2.89×10-8mol/L，2.17×10-8mol/L，2.14×10-8mol/L 和2.77×10-8mol/L（圖3B-E）。突變前后，rBTI 的Ki數(shù)量級(jí)皆為10-8mol/L，抑制常數(shù)Ki并沒有發(fā)生明顯改變，說明rBTI 及突變體均能與胰蛋白酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物。同時(shí)也說明，該螺旋區(qū)域中賴氨酸分別或同時(shí)突變?yōu)楸彼岷螅⑽磳?duì)rBTI 發(fā)揮抑制活性的Loop 環(huán)形成影響，因此未影響其抑制活性。

圖3 rBTI 及其突變體對(duì)胰蛋白酶的抑制活性。（A）比較rBTI 及其突變體的抑制活性；（B-E）rBTI 及其突變體對(duì)胰蛋白酶活性抑制的動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果Fig. 3 Inhibitory activity of rBTI and its mutants to trypsin.（A）Comparison of inhibitory activity of rBTI and mutants.（B-E）Kinetic analysis of trypsin inhibition by rBTI and mutants

2.3 rBTI及其突變體二級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化

采用圓二色光譜對(duì)rBTI 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果 如 圖4 所 示，在208 nm 存 在 一 個(gè) 負(fù) 峰，rBTI 及 突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征也并未發(fā)生明顯變化。丙氨酸（A）也具有形成螺旋的潛力，這說明賴氨酸（K）突變?yōu)楸彼幔ˋ）后并未使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖4 rBTI 及其突變體的圓二色光譜分析Fig. 4 Far-UV CD spectras of rBTI and mutants

2.4 rBTI 螺旋區(qū)賴氨酸單突變顯著增強(qiáng)了其對(duì)Hep G2細(xì)胞的抑制及ATP含量減少

采用MTT 檢測了rBTI 及突變體對(duì)Hep G2 細(xì)胞增殖的抑制作用（圖5A）。如圖5A 所示，rBTI 及其突變體分別處理24 h 后，Hep G2 細(xì)胞的增殖以濃度梯度增加的方式被抑制。與野生型rBTI 相比，第20 位和23 位賴氨酸單突變的兩種突變體均表現(xiàn)出對(duì)Hep G2 細(xì)胞更強(qiáng)的抑制作用，但第20 位和23 位賴氨酸同時(shí)突變的rBTI-K20A/K23A 對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用并沒有增強(qiáng)，與野生型相當(dāng)。測定了rBTI 及其突變體對(duì)Hep G2 的ATP 含量的影響（圖5B）。如圖5B 所示，與對(duì)照組相比，rBTI 及其突變體均引起ATP 含量明顯下降。與對(duì)照組相比，rBTI-K20A 和rBTI-K23A 對(duì) 細(xì) 胞 內(nèi)ATP 含 量 影 響最大，而雙賴氨酸突變體rBTI-K20A/K23A 與野生型rBTI 相 似，相 較 于rBTI-K20A 和rBTI-K23A 對(duì)ATP 的影響明顯減弱。這與MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5 rBTI 及其突變體對(duì)Hep G2 細(xì)胞活性及ATP 含量的影響。參照各自對(duì)照組：*P＜0.05 為差別有顯著性，**P＜0.01 為差別具有極顯著Fig. 5 Effect of rBTI and mutants on the cell viability and ATP content of Hep G2 cells. *P ＜0.05，**P ＜0.01，versus respective controls

2.5 rBTI賴氨酸單突變體顯著減少線粒體數(shù)量

之前已經(jīng)證實(shí)，rBTI 可以靶向線粒體引起線粒體自噬，減少線粒體數(shù)量。將pDsRed2-Mito 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep G2 細(xì)胞，觀察rBTI 及突變體作用后，線粒體形態(tài)及數(shù)量的變化。如圖6 所示，對(duì)照組中，Hep G2 細(xì)胞中線粒體呈網(wǎng)狀和點(diǎn)狀，數(shù)量較多，在胞質(zhì)中均勻分布。rBTI 及突變體處理Hep G2 細(xì)胞后，線粒體形態(tài)及數(shù)量均發(fā)生較大的變化，其中rBTIK20A 和rBTI-K23A 對(duì)Hep G2 細(xì)胞線粒體形態(tài)及數(shù)量的影響最為顯著。

圖6 rBTI 和突變體Hep G2 細(xì)胞線粒體的形態(tài)的影響Fig. 6 Mitochondrial morphology of Hep G2 cells affect by rBTI and mutants

2.6 人工合成的rBTI 及突變體α-螺旋區(qū)對(duì)細(xì)胞增殖也具有顯著影響

通過人工合成了rBTI 螺旋區(qū)的多肽以及相應(yīng)位點(diǎn)突變的多肽，采用MTT 的方法，進(jìn)一步驗(yàn)證是否rBTI 單獨(dú)的α-螺旋區(qū)可以發(fā)揮抑制腫瘤增殖的作用。如圖7A 所示，多肽P2和P3對(duì)Hep G2 細(xì)胞增殖表現(xiàn)出與野生型多肽P1相似的抑制作用，但多肽P4對(duì)Hep G2 細(xì)胞增殖幾乎沒有抑制作用。ATP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明，與對(duì)照組相比，P1，P2及P3多肽均引起線粒體ATP 含量明顯下降；在處理24 h 后，賴氨酸單突變多肽P2和P3對(duì)ATP 含量影響與野生型P1基本相當(dāng)，50 μg/mL 的濃度影響效果最為顯著，而賴氨酸雙突變多肽P4對(duì)ATP 的影響則明顯減弱。這與多肽的MTT 結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明了rBTI 的α-螺旋區(qū)發(fā)揮著抑制腫瘤增殖的作用。

圖7 來源于rBTI 及其突變體的螺旋區(qū)多肽對(duì)Hep G2 細(xì)胞活性及ATP 含量的影響。參照各自對(duì)照組：*P＜0.05 為差別有顯著性，**P＜0.01 為差別具有極顯著Fig.7 Effects of peptides from rBTI and mutants on the cell viability and ATP content of Hep G2 cells. *P ＜0.05，**P ＜0.01，versus respective controls

3 討論

蛋白酶抑制劑廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，可與酶結(jié)合形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，在很多重要的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，如細(xì)胞凋亡的調(diào)控、調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白酶活性等［17-18］。目前，已經(jīng)成功分離了大量的植物源蛋白酶抑制劑，其中絲氨酸蛋白酶抑制劑居多，它們?cè)谥参锏臓I養(yǎng)器官中含量非常豐富。很多學(xué)者對(duì)蛋白酶抑制劑的抗癌作用及藥用價(jià)值進(jìn)行了研究，其中蕎麥蛋白酶抑制劑具有顯著的生物學(xué)功能，不僅可以調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白酶的活性以保護(hù)機(jī)體，還具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用［19-20］。

rBTI 的α-螺旋區(qū)（GSKAAKIIENE）的氨基酸組成和性質(zhì)與線粒體蛋白N 端前導(dǎo)肽相似，該螺旋呈兩親性，在親水面存在正電荷氨基酸，滿足Tom 20 與Tom 22 的識(shí)別條件。Tom 20 可識(shí)別線粒體蛋白前導(dǎo)肽的疏水側(cè)面，而Tom22 識(shí)別前導(dǎo)肽親水側(cè)正電荷氨基酸，隨后TOM 其他復(fù)合物將含前導(dǎo)序列的線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞［21］。為了了解rBTI 的α-螺旋區(qū)正電荷對(duì)其抑制腫瘤增殖的影響，我們?cè)诓挥绊憆BTI 結(jié)構(gòu)及抑制活性的情況下，將rBTI 螺旋區(qū)中20 位和23 位的氨基酸進(jìn)行單點(diǎn)突變與多點(diǎn)突變，均突變?yōu)楸彼酇la，得到3 種不同的突變體。與野生型相比，單突變體rBTI-K20A 和rBTI-K23A 可以大大增強(qiáng)對(duì)Hep G2 細(xì)胞增殖抑制率，并大大減少了線粒體的數(shù)量。rBTI-K20A/K23A 這一突變體對(duì)Hep G2 抑制腫瘤增殖效應(yīng)僅與野生型rBTI 相當(dāng)。同時(shí)，采用人工合成的方法得到相應(yīng)的野生型rBTI 及突變型的α-螺旋的多肽，進(jìn)一步證實(shí)了單獨(dú)的α-螺旋區(qū)多肽可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。因此確認(rèn)α-螺旋是rBTI 發(fā)揮抗腫瘤活性的區(qū)域，可以顯著影響腫瘤細(xì)胞的線粒體形態(tài)。采用等溫滴定的方法研究了rBTI 中α-螺旋區(qū)多肽與Tom20 的相互作用，發(fā)現(xiàn)將rBTI 中α-螺旋區(qū)中的賴氨酸分別突變?yōu)楸彼岷螅╮BTI-K20A 和rBTI-K23A），會(huì)增加多肽與Tom20 的結(jié)合常數(shù)，而將兩個(gè)賴氨酸都變?yōu)楸彼岷螅╮BTI-K20A/K23A），其結(jié)合常數(shù)與野生型相似，這一結(jié)果與MTT 結(jié)果和ATP 含量的結(jié)果一致，即α-螺旋與Tom20 的結(jié)合常數(shù)越大，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用也越強(qiáng)。但rBTI 及突變體是否定位于線粒體的不同區(qū)域，我們還無法通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，也是下一步要解決的關(guān)鍵問題。人工合成多肽P4 抑制細(xì)胞增殖的作用幾乎消失，可能與其正電荷的完全消失，不能由胞外進(jìn)入胞內(nèi)，阻斷其發(fā)揮抗腫瘤功能有 關(guān)［22-24］。Tom 20 和Tom 22 與 線 粒 體 前 導(dǎo) 肽 的不同部位結(jié)合，但二者識(shí)別部位會(huì)不會(huì)存在相互影響還未知［25］，因此在后續(xù)研究中應(yīng)系統(tǒng)探究這一問題。

4 結(jié)論

rBTI 的α-螺旋區(qū)具有線粒體前導(dǎo)肽的性質(zhì)和功能，尤其是螺旋區(qū)正電荷對(duì)其發(fā)揮抗腫瘤活性起著非常重要的作用。

rBTI 的α-螺旋區(qū)正電荷賴氨酸的單突變（rBTI-K20A 和rBTI-K23A），可以引起更大的線粒體損傷，最終抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。