趙慧玲 周希萌 張 鯤付 春李長(zhǎng)生李愛(ài)芹馬長(zhǎng)樂(lè)王興軍*趙傳志*

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳育種與生態(tài)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250100;3.濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山東 濰坊 261071)

栽培花生(ArachishypogaeaL.)是由二倍體野生祖先種A.duranensis和A.ipaensis雜交后通過(guò)染色體加倍形成的異源四倍體,是重要的油料作物,也是優(yōu)質(zhì)植物蛋白來(lái)源。我國(guó)花生2018年種植面積約462萬(wàn)hm2,其總產(chǎn)占國(guó)內(nèi)油料作物(包括油菜、花生、向日葵、芝麻和胡麻)的50%[1]。遺傳分析表明我國(guó)大部分花生品種均具有伏花生或獅頭企的血緣[2-3],遺傳基礎(chǔ)狹窄。另外,由于花生的抗病、耐逆性狀、株型、粒型等農(nóng)藝性狀大多由數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative trait locus,QTLs)控制,傳統(tǒng)育種方法在改良這些性狀時(shí)有諸多局限性。

分子標(biāo)記輔助選擇為代表的分子育種方法以基因型鑒定為基礎(chǔ),可對(duì)目標(biāo)性狀定向改良,提高育種的精準(zhǔn)性和效率,縮短育種周期,因此,在育種過(guò)程中采用準(zhǔn)確高效的分子育種方法十分必要。近年來(lái),花生二倍體祖先種[4]、四倍體野生種A.monticola[5]、栽培花生獅頭企[6]、伏花生[7]和Tifrunner[8]的基因組相繼公布,花生重要性狀QTL/基因定位研究也取得重要進(jìn)展。本文旨在綜述花生在分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、遺傳圖譜構(gòu)建及QTL/基因鑒定及分子育種的研究進(jìn)展。

1 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

分子標(biāo)記是QTL/基因定位的基礎(chǔ)。在2010年之前,花生的遺傳研究主要以傳統(tǒng)的分子標(biāo)記為主,主要包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats,SSR)、RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)等。近十年來(lái),隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和花生基因組測(cè)序計(jì)劃的實(shí)施,高通量的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)、插入缺失標(biāo)記(Insertion and Deletion Sequence,InDel)等標(biāo)記快速發(fā)展,逐漸成為了花生遺傳研究的重要工具。

第一代的分子標(biāo)記RFLP 于1980年由Botstein[9]首先提出,后在玉米、小麥、水稻等農(nóng)作物廣泛應(yīng)用,也一度成為花生野生資源遺傳分析[10]、連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位[11]的重要工具。此后,在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上,RAPD 標(biāo)記技術(shù)發(fā)展起來(lái),與RFLP相比,RAPD技術(shù)省去了分子雜交和放射性自顯影等步驟,操作更簡(jiǎn)單、成本更低,在花生研究上先后被用于遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選擇育種及花生種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析[12-14]。SSR標(biāo)記是最具代表性的第二代分子標(biāo)記技術(shù),也是在花生上應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記之一。1999年Hopkins[15]等通過(guò)(GT)10和(CT)10為探針對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選,鑒定了6對(duì)多態(tài)性SSR,并完成了對(duì)19份栽培種和3份野生種的遺傳分析。此后,大量EST 或轉(zhuǎn)錄組序列成為花生SSR 分子標(biāo)記的重要來(lái)源[16]。最近,基于花生野生種和栽培種的基因組序列信息,超過(guò)十萬(wàn)多個(gè)全基因組SSR 標(biāo)記被報(bào)道[17]。SSR 標(biāo)記已經(jīng)成為花生雜交種真?zhèn)舞b定、種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位的重要工具[17-19]。

SNP和InDel被認(rèn)為是第三代分子標(biāo)記。SNP標(biāo)記是指在單個(gè)核苷酸的變異形成的遺傳標(biāo)記,因其在基因組中廣泛分布,多態(tài)性豐富且容易被芯片、高通量測(cè)序技術(shù)鑒定,應(yīng)用越來(lái)越多。Clevenger等通過(guò)對(duì)20多個(gè)Arachis物種的重測(cè)序結(jié)果,鑒定了54 564個(gè)SNP標(biāo)記,這些SNP標(biāo)記為花生SNP Array的開(kāi)發(fā)提供了重要的參考[20];轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也是花生SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)的重要方法,Chopra等通過(guò)對(duì)4個(gè)花生品種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,鑒定了263 840個(gè)SNP和InDel位點(diǎn)[21]。除了高通量測(cè)序之外,SNP芯片分析也是SNP基因型鑒定的重要手段,目前可用的花生SNP 芯片有兩個(gè),58K SNP Array (Axiom_Arachis,v1)[22]和48K SNP Array (Axiom_Arachis2,v2)[23],是花生基因型分析的重要工具。InDel則是指在樣本間同一位點(diǎn)核苷酸片段的插入或缺失,其多態(tài)性高、帶型簡(jiǎn)單、易于檢測(cè),在花生上也被應(yīng)用到抗病基因鑒定、栽培花生的遺傳多樣性和種群聚類分析等方面[24-25]。

2 花生遺傳連鎖圖譜研究進(jìn)展

遺傳圖譜是QTL/基因定位及圖位克隆的基礎(chǔ),隨著測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展及花生基因組測(cè)序計(jì)劃的實(shí)施完成,花生遺傳連鎖圖譜的研究也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。最早的花生二倍體野生種遺傳圖譜是Halward于1993年建立,圖譜長(zhǎng)1063 cM,包含了117個(gè)RFLP 標(biāo)記[11]。Herselman等2004年構(gòu)建了首張AFLP標(biāo)記圖譜,長(zhǎng)度139.4 cM[26]。此后,融合第二代分子標(biāo)記SSR 的栽培種花生遺傳圖譜也陸續(xù)出現(xiàn)(表1)。花生遺傳圖譜的密度也不斷增加[27-28]。例如,Li等(2019)利用SLAFseq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)構(gòu)建了花生高密度遺傳圖譜,圖譜總長(zhǎng)1208.2 cM,包含2808個(gè)SNP標(biāo)記,平均兩個(gè)標(biāo)記之間的遺傳距離為0.47 cM[29]。Agarwal等(2019)通過(guò)對(duì)花生S群體兩個(gè)親本及140個(gè)RIL(重組近交系)群體重測(cè)序,共找到11 106個(gè)SNP位點(diǎn),最終構(gòu)建的Bin-map全長(zhǎng)2004 cM,包含5816個(gè)Bins,兩個(gè)標(biāo)記間的平均遺傳距離為0.34 cM[30]。

3 花生主要農(nóng)藝性狀QTL 定位的研究進(jìn)展

在花生生產(chǎn)中,許多因素都會(huì)制約產(chǎn)量,如種子大小、株型高低、莢果大小及數(shù)目等都會(huì)直接影響產(chǎn)量,且花生是主要的油料作物,其油酸、亞油酸及脂肪酸等自身所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的多少與花生品質(zhì)有關(guān)。此外,外界環(huán)境也會(huì)對(duì)其造成影響,如鹽堿、寒冷、干旱等非生物因素的脅迫,及各種病蟲(chóng)害造成的減產(chǎn)等。然而,花生的諸多性狀多屬于遺傳復(fù)雜的數(shù)量性狀,僅依靠傳統(tǒng)的育種方法不能有效解決這些問(wèn)題。隨著遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及復(fù)雜數(shù)量性狀的QTL 定位和圖位克隆的發(fā)展,產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病、抗逆等重要性狀的QTL 定位研究也取得了較大進(jìn)展 (表2)。

3.1 產(chǎn)量相關(guān)性狀

種子質(zhì)量、莢果質(zhì)量和出仁率是花生產(chǎn)量的主要構(gòu)成因素,了解產(chǎn)量構(gòu)成及其相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)是花生遺傳改良的重要前提。李振動(dòng)等利用“遠(yuǎn)雜9102×徐州68-4”的F5和F6家系群體,在兩個(gè)環(huán)境下鑒定了41個(gè)與莢果長(zhǎng)、寬、厚和百果質(zhì)量相關(guān)的QTL,表型變異解釋率為3.14%～18.27%[31];此后Luo等進(jìn)一步利用“遠(yuǎn)雜9102×徐州68-4”的RIL群體,在四個(gè)環(huán)境下鑒定了42個(gè)與莢果長(zhǎng)、莢果寬和百果質(zhì)量相關(guān)的QTL位點(diǎn),表型變異解釋率為3.68%～27.74%,其中3個(gè)主效QTL被定位在A05染色體[32]。Fonceka[33]對(duì)涉及花生生產(chǎn)力的若干性狀進(jìn)行了詳細(xì)的QTL研究,定位了4個(gè)與種子長(zhǎng)相關(guān)的QTL,能夠解釋的表型變異(Phenotypic variation explained,PVE)為10.5%～16.3%(表2);與種子寬相關(guān)的9 個(gè)QTL,PVE為8.7%～23.7%,大約一半分布在LG a07上。Shirasawa[34]檢測(cè)了百仁質(zhì)量和出仁率性狀相關(guān)的QTL,PVE分別為19.1%和6.8%。這些QTL位點(diǎn)的定位為將來(lái)花生產(chǎn)量性狀的遺傳改良提供了參考依據(jù)。

3.2 發(fā)育相關(guān)農(nóng)藝性狀

株型、果型等是影響花生發(fā)育的主要農(nóng)藝性狀。株型主要涉及到株高、側(cè)枝長(zhǎng)、分枝數(shù)和莖間夾角等,其株型特征直接關(guān)系到種群密度和受光面積等,從而會(huì)影響花生產(chǎn)量。Zhou等定位了32個(gè)與株型相關(guān)的QTL 位點(diǎn),其中與主莖高相關(guān)的QTL位點(diǎn)10個(gè)、與總分枝數(shù)相關(guān)的QTL 位點(diǎn)7個(gè)、與側(cè)枝長(zhǎng)相關(guān)的QTL位點(diǎn)15個(gè),可以解釋4%～15%的表型變異[35]。此后,Zhou等又鑒定了9個(gè)莢果長(zhǎng)QTL、10個(gè)莢果寬QTL和12個(gè)百果質(zhì)量QTL,對(duì) 應(yīng) 的PVE 在3.07%～15.77%之 間[36]。Huang等[37]也對(duì)莢果長(zhǎng)、莢果寬、百果質(zhì)量、主莖高和分枝數(shù)進(jìn)行了QTL定位,共獲得9個(gè)QTL,PVE范圍為2.1%～18.7%。果嘴、果腰的性狀是影響花生果型的重要農(nóng)藝性狀,Shirasawa等[34]和Fonceka等[33]分別定位了9個(gè)關(guān)于果腰相關(guān)和11個(gè)關(guān)于果嘴相關(guān)的QTL,貢獻(xiàn)率為6.9%～23.9%。

3.3 品質(zhì)性狀

含油量、油酸含量、蛋白含量及其他有效營(yíng)養(yǎng)成分含量是花生品質(zhì)的重要判斷依據(jù),目前對(duì)含油量及油酸和亞油酸的定位研究較多,對(duì)花生酸、山俞酸、硬脂酸的研究相對(duì)較少。Liu等[38]對(duì)2014-2017年4個(gè)環(huán)境下的油酸含量性狀進(jìn)行QTL分析,共檢測(cè)了7個(gè)與含油量性狀相關(guān)的QTL,貢獻(xiàn)率為6.07%～27.19%。張新友等[39]對(duì)脂肪酸含量、油酸含量、亞油酸含量等7個(gè)性狀進(jìn)行檢測(cè),共鑒定了10個(gè)QTL,貢獻(xiàn)率為4.82%～24.14%,該研究發(fā)掘出的10個(gè)QTL位點(diǎn)中,其中與花生酸含量相關(guān)的1個(gè)QTL及與硬脂酸含量相關(guān)的QTL貢獻(xiàn)率較大,分別為18.33%和24.14%。Wang等[40]通過(guò)對(duì)S群體(SunOleic97R×NC94022)和T群體(Tifrunner×GT-C20)的遺傳和定位分析,鑒定了山俞酸、花生酸、棕櫚酸等6個(gè)性狀相關(guān)的164個(gè)QTL位點(diǎn),貢獻(xiàn)率為0.16%至40.56%。

3.4 抗病性狀

培育抗病品種是作物育種家的永久課題。危害花生的病害較多,主要包括黃曲霉、青枯病、葉斑病等。花生是最容易遭受黃曲霉菌感染的農(nóng)作物之一,黃曲霉本身對(duì)花生產(chǎn)量的影響較少,但黃曲霉容易產(chǎn)生黃曲霉毒素,對(duì)花生的產(chǎn)品安全至關(guān)重要。雷永等[41]用BSA 法獲得兩個(gè)與黃曲霉抗性相關(guān)的AFLP標(biāo)記,分別為E44M53-520和EA5/M53440,PVE 分別為9.0%和14.6%,并開(kāi)發(fā)了與黃曲霉抗性相關(guān)的SCAR 標(biāo)記[42]。葉斑病是花生最常見(jiàn)的病害,主要有早斑病、晚斑病和網(wǎng)斑病,另外,番茄斑萎病(tomato spotted wilt virus,TSWV)、葉銹也是造成花生減產(chǎn)的重要葉部病害。目前,研究最廣泛的是晚斑病。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,與花生病害抗性相關(guān)的AFLP和SSR 標(biāo)記相繼被檢測(cè)。王輝[43]共檢測(cè)到49個(gè)與TSWV、早斑病和晚斑病抗性相關(guān)的QTL,可以解釋6.26%～15.54%的表型變異;Agarwall等[44]利用WGRS繪制了高密度遺傳圖譜,并定位了2個(gè)與晚斑病相關(guān)的QTL,PVE 分別為47.63%和34.03%;Khedikar等[45]和Sujay等[46]分別鑒定了與銹病相關(guān)的主效QTL,最高PVE分別可達(dá)55.2%和82.96%,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。徐志軍等定位了33 個(gè)與青枯病相關(guān)的QTL位點(diǎn),PVE為1.39%～28.72%[47];李威濤等利用遠(yuǎn)雜9102 和徐州68-4 雜交構(gòu)建的RIL 群體,在B02染色體上定位到青枯病抗性主效QTLqBWRB02,貢獻(xiàn)率為27.87%[48]。

4 新方法和新技術(shù)在花生QTL 定位上的應(yīng)用

傳統(tǒng)QTL定位的方法需要借助一定數(shù)量的群體后代和大量的分子標(biāo)記,并需檢測(cè)每個(gè)標(biāo)記在群體后代每個(gè)株系(單株)的基因型,需耗費(fèi)大量人力和時(shí)間,過(guò)程繁瑣且成本較高。集團(tuán)分離分析法(Bulk Segregant Analysis,BSA)通過(guò)將極端性狀的群體進(jìn)行混池,研究混池間等位基因/分子標(biāo)記頻率的差異,進(jìn)而定位目標(biāo)性狀基因,其不需要對(duì)群體中每個(gè)個(gè)體進(jìn)行基因分型,降低了工作量和成本,故在遺傳基因定位中被廣泛應(yīng)用。另外,隨著高通量測(cè)序、生物信息學(xué)等技術(shù)的發(fā)展,基因型和表型鑒定的逐漸高通量化,限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA 測(cè)序(Restriction site Associated DNA Sequencing,RAD-Seq)、特定位點(diǎn)擴(kuò)增片段(Specificlocus amplified fragment,SLAF)、全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome wide association study,GWAS)、表達(dá)數(shù)量性狀基因座(expression Quantitative Trait Loci,eQTL)等技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái),并被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建和QTL定位研究中,顯著提高了花生QTL定位的效率。

4.1 基于BSA原理的QTL定位方法在花生上的應(yīng)用

BSA 的方法最早報(bào)道于1991 年,Michelmore[49]首次利用BSA的方法鑒定了3個(gè)與霉病抗性基因緊密相關(guān)的標(biāo)記后,一系列依托高通量測(cè)序和BSA方法的QTL/基因鑒定技術(shù)逐漸發(fā)展,例如Bulked segregant RNA-Seq(BSR-Seq)、QTL-seq、MutMap、MutMap+等方法,并被應(yīng)用到花生重要農(nóng)藝性狀QTL/基因的定位中。

BSR-seq主要通過(guò)研究混池間轉(zhuǎn)錄本上序列變異的情況定位目標(biāo)基因,最早報(bào)道于2012年[50],目前該法在花生上已有成功報(bào)道,Kayam 利用BSR-seq檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了與株型有關(guān)的34個(gè)SNP標(biāo)記,并發(fā)現(xiàn)了位于B05染色體上的6個(gè)SNP標(biāo)記,并將性狀基因座定位在了相關(guān)區(qū)段中[51]。與BSRseq不同的是,QTL-seq是利用混池間基因組序列變異定位目標(biāo)基因,需對(duì)混池及雙親進(jìn)行全基因組重測(cè)序(Whole-genome resequencing,WGRS)[52]。近年來(lái),以QTL-seq等為代表的新型方法也成功應(yīng)用到花生QTL定位中,提高了QTL 定位的效率,如Luo等采用QTL-seq方法分別鑒定了與花生青枯病抗性和花生脫殼相關(guān)的QTL位點(diǎn)[53-55]。Zhao等通過(guò)QTL-seq結(jié)合BSR的方法,將控制花生黑種皮顏色基因定位在10號(hào)染色體的特定區(qū)間內(nèi),并鑒定了關(guān)鍵的候選基因[56]。

MutMap的原理與QTL-seq類似,主要是用于突變體突變基因或位點(diǎn)的定位。首先,將具有目的性狀的突變體與野生型親本雜交,所得F1代自交后在F2代中選擇突變表型和野生表型的個(gè)體分別構(gòu)建混池;然后進(jìn)行高通量測(cè)序,通過(guò)極端池之間的比較計(jì)算SNP-index,確定與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。MutMap具有定位周期短且效率高的優(yōu)點(diǎn),在農(nóng)業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力。隨著研究的深入,MutMap技術(shù)也不斷升級(jí),MutMap+和MutMap-Gap等方法相繼被報(bào)道。MutMap+是基于Mut-Map方法形成,主要針對(duì)于不能用于突變型和野生型雜交的情況;MutMap-Gap是在MutMap的基礎(chǔ)上多了一個(gè)denovo組裝的過(guò)程,目前,花生突變體庫(kù)的創(chuàng)建已經(jīng)取得重要進(jìn)展[57],MutMap將為花生突變體的研究提供幫助。

4.2 基于高通量測(cè)序的QTL 定位方法及在花生上的應(yīng)用

RAD-Seq是一項(xiàng)基于全基因組酶切位點(diǎn)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)[58]。Zhou等利用RAD-Seq技術(shù)從栽培花生中鑒定了5萬(wàn)多個(gè)SNP位點(diǎn),并建立第一個(gè)SNP高密度遺傳連鎖圖譜,該圖譜可作為栽培花生品種的參考圖譜[59]。

SLAF-seq 通過(guò)選擇均勻分布在整個(gè)基因組、且避開(kāi)重復(fù)序列區(qū)域的特異片段進(jìn)行高深度測(cè)序,也是一種簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的方法,也被應(yīng)用到花生遺傳圖譜的構(gòu)建和QTL 定位研究中。Wang等利用SLAF-seq 構(gòu)建了花生的高密度SNP遺傳圖譜,該圖譜長(zhǎng)度為2098.14 cM,包括3630個(gè)SNP標(biāo)記,平均標(biāo)記距離為0.58 cM,并定位了62個(gè)與產(chǎn)量相關(guān)的QTL[60]。Hu等也利用SLAF-seq技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)花生的高密度遺傳圖譜,該圖譜包括68個(gè)SSR和2266個(gè)SNP標(biāo)記,總長(zhǎng)度2586.37cM,利用該圖譜定位了多個(gè)與油酸含量、油酸/亞油酸比值等相關(guān)的QTL位點(diǎn)[61]。

GWAS基于全基因組分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀的連鎖不平衡關(guān)系,通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析獲得與性狀關(guān)聯(lián)的候選基因或基因組區(qū)域,是目前植物遺傳研究炙手可熱的技術(shù),近年來(lái)GWAS也被應(yīng)用到花生的遺傳研究上。Zhang等利用GWAS技術(shù)從栽培花生中鑒定了18 個(gè)與早斑病抗性相關(guān)、28個(gè)與晚斑病抗性相關(guān)的QTL[62];Zhang 等通過(guò)GWAS分析鑒定了36個(gè)與花生礦物質(zhì)元素濃度相關(guān)的QTL,可以解釋18.35%～27.56%的遺傳變異[63]。此外,GWAS 也被用于發(fā)現(xiàn)花生中與產(chǎn)量、過(guò)敏和馴化相關(guān)的候選基因[64-65]。

eQTL是指控制數(shù)量性狀表達(dá)位點(diǎn),即是染色體上一些能特定調(diào)控mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的區(qū)域。Huang等通過(guò)對(duì)中花10(粉紅色種皮)和ICG12625(紫色種皮)的重組自交系(RIL)群體未成熟種子的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序,開(kāi)發(fā)了一個(gè)與紫色種皮的控制有關(guān)的InDel02標(biāo)記[66]。

5 問(wèn)題和展望

目前我國(guó)花生育種已達(dá)到較高水平,育成品種的單產(chǎn)處于國(guó)際領(lǐng)先,但大多是通過(guò)常規(guī)雜交選育而成,選育周期長(zhǎng)、時(shí)效性差、目標(biāo)性狀選擇效率較低,不能充分滿足當(dāng)前生產(chǎn)上對(duì)品種更新?lián)Q代的需求。且現(xiàn)今花生育種還有很多問(wèn)題需要解決,如數(shù)量性狀QTL目前研究較少,抗黃曲霉方面的研究也需進(jìn)一步推進(jìn),可通過(guò)以下途徑解決:①利用多親本雜交富集有效性狀,應(yīng)用多次回交對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行改良;② 利用花生基因組學(xué)、生物信息學(xué)的最新研究進(jìn)展,全基因組SNP分析、Binmap等新方法推進(jìn)花生農(nóng)藝性狀QTL基因的研究進(jìn)展;③收集篩選利用野生花生的優(yōu)異基因資源,采用基因編輯的方法對(duì)這些材料的優(yōu)異性狀基因進(jìn)行功能研究,創(chuàng)建并合理利用花生突變體。