李亮亮雷 高李 磊岳丹丹甄 靜王繼雯

(河南省科學院生物研究所有限責任公司/河南省微生物工程重點實驗室,河南 鄭州 450008)

花生(ArachishypogaeaLinn.)是全球范圍內(nèi)最重要的油料作物之一,有很高的食用價值和經(jīng)濟價值,在我國的種植歷史已有上百年[1]。近年來,隨著我國花生種植面積的急劇擴大,以及連作重茬現(xiàn)象日益加劇,導致病害逐年加重。特別是花生白絹病的發(fā)生,對我國花生產(chǎn)業(yè)造成嚴重損失?；ㄉ捉伈?Southern blight)是世界范圍內(nèi)花生上發(fā)生的一種重要的枯萎型真菌病害,已經(jīng)對美國、阿根廷、印度、日本等國家的花生產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2-5],該病病原菌的無性世代是半知菌亞門齊整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)有性世代為羅氏阿太菌(Atheliarolfsii)[6]。該病菌寄主范圍廣泛,能侵染花生、辣椒、油茶、白術等植物,是一種危害嚴重的土傳真菌[7-10]。

目前對花生白絹病的防治方法主要包括輪作、培育抗性品種以及使用化學藥劑,但防治效果都不理想。同時化學藥物的大量使用不僅污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡,而且使病原菌逐漸產(chǎn)生了抗藥性,所以科研人員開始研究對花生白絹病的生物防治方法。白絹病生防真菌方面,席亞東等[11]用綠色木霉防治白絹病,防效可達70%左右。杜嬋娟等[12]發(fā)現(xiàn)使用木霉菌劑或木霉粉劑對白絹病均有一定的防治效果,進一步研究發(fā)現(xiàn)木霉菌株對白絹病菌菌絲的擴展有一定的拮抗作用,主要表現(xiàn)為菌絲畸形,菌核不能正常形成。

與真菌相比,細菌具有培養(yǎng)簡單、生長繁殖速度快等特點,因此生防細菌在生防微生物的研究中占有重要地位。目前已報道的防治花生白絹病的生防細菌種類主要有解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)等[13-15]。近年也有學者發(fā)現(xiàn)放線菌對白絹病有較好的生防作用[16]。但關于白絹病菌的研究報道和生防菌種還十分有限,亟待進一步研究。本文以實驗室保存的4株細菌為研究對象,篩選對花生白絹病菌具有高效拮抗活性的菌株,對篩選出的菌株進行鑒定,并對拮抗菌株發(fā)酵液中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

花生白絹病菌(Sclerotiumrolfsii)RS-1分離自河南省汝南縣花生病株。供試菌株WS2-1、WS3-1、WS3-2和nkkc由河南省微生物工程重點實驗室提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

NA 培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,牛肉膏3 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.2～7.4。

NB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,牛肉膏3 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.2～7.4。

PDA 培養(yǎng)基:200 g新鮮馬鈴薯去皮煮汁,葡萄糖 20 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1000 mL。

1.3 拮抗細菌的篩選

1.3.1 平板對峙試驗

將經(jīng)NA 培養(yǎng)基活化的4株待測細菌分別劃線接種于PDA 平板兩側(cè),再將直徑5 mm 的花生白絹病菌PDA 平板培養(yǎng)物點接于平板中間。以只接病原菌的PDA 平板為對照,每處理3個重復。置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待對照接近長滿整個平板時觀察不同細菌對病原菌的拮抗效果。

1.3.2 細菌發(fā)酵濾液對病原菌生長的影響

將4株待測細菌接入含100 mL NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中于30℃、200 r/min條件下?lián)u培,將搖培3 d后的細菌發(fā)酵液于10000 r/min、4℃條件下離心20 min,再用濾膜孔徑為0.22 μm 的細菌過濾器將菌體過濾,所得的濾液即為無菌發(fā)酵濾液。將發(fā)酵濾液分別稀釋2 倍、4 倍后,按照濾液:PDA 為1:4的比例混合,制成帶毒平板,然后將活化好的5 mm 病原真菌菌餅點接于平板中央。以不接菌的NB液體培養(yǎng)基代替無菌發(fā)酵濾液為對照。每個處理設置3個重復,25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對照長滿整個平板時,計算細菌發(fā)酵濾液原液、2倍和4倍稀釋液對花生白絹病菌的抑菌率。計算公式如下:

1.4 拮抗細菌WS3-1對白絹病菌菌絲生長及菌核形成的影響

將篩選的拮抗菌株WS3-1接入含100 mL NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中于30℃、200 r/min條件下?lián)u培24 h,備用。將活化好的直徑5 mm 白絹病菌菌餅接種到PDA 固體平板中央,在距離平板中央3.5 cm 處打孔,向孔內(nèi)加入20 μL活化的WS3-1菌液,對照孔里加入20 μL 的無菌液體培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)3 d后,觀察菌株WS3-1對花生白絹病菌的抑制作用。挑取白絹病菌的菌落邊緣菌絲于空白PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),同時在光學顯微鏡下鏡檢。繼續(xù)培養(yǎng)15 d后,記錄產(chǎn)生的菌核數(shù)量。

1.5 拮抗細菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)特征和生理生化特征測定

拮抗細菌WS3-1的形態(tài)特征和生理生化特征測定按照參考文獻《微生物學實驗技術教程》[17]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]的方法進行。

1.5.2 分子生物學鑒定

利用16S rDNA 和gyrB基因?qū)卓咕闣S3-1進行分子生物學鑒定。提取拮抗細菌WS3-1的基因組DNA[19],分別用細菌16S rDNA 和gyrB的引物進行PCR擴增。16S rDNA引物序列為:27f:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3';1492r:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[20],PCR 擴增條件為94℃預變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1.5 min,33個循環(huán);72℃延伸10 min。gyrB簡并引物序列為UP-1:5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3';UP-2r:5'-AGCAGG GTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'[21],PCR 擴增條件為94℃、4 min;94℃、1 min,60℃、1 min,72℃、2 min,33個循環(huán);72℃、10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后,交由華大基因測序。將獲得的16S rDNA 和gyrB基因序列在NCBI網(wǎng)站上用BLAST 程序進行同源性比對,并用MEGA 6.05 軟件對16S rDNA 與gyrB線性拼接序列進行聯(lián)合建樹。

1.6 WS3-1抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性測定

1.6.1 熱穩(wěn)定性試驗

將拮抗細菌WS3-1的無菌發(fā)酵濾液分別在40、60、80、100℃水浴鍋中處理1 h,在121℃條件下處理20 min。待降至室溫后,按照1.3.2的方法測定濾液原液對白絹病菌的抑菌活性。以經(jīng)相應溫度處理的NB液體培養(yǎng)基代替發(fā)酵濾液作對照,每個處理3次重復。

1.6.2 pH 穩(wěn)定性試驗

用1 mol/L 的NaOH 和HCl將WS3-1發(fā)酵濾液的pH 分別調(diào)至3.0～10.0。然后將調(diào)至不同pH 的發(fā)酵濾液置于4℃過夜后,于8000 r/min離心20 min取上清。按照1.3.2的方法測定各上清液對白絹病菌的抑菌活性。得到的沉淀被原體積的蒸餾水溶解后(pH=8.5),同樣方法檢測抑菌活性。以相應pH 的NB液體培養(yǎng)基代替發(fā)酵濾液為對照,每個處理重復3次。

1.6.3 紫外線穩(wěn)定性試驗

將待測WS3-1發(fā)酵濾液置于紫外燈下照射。照射條件為波長254 nm,功率36 w,高度25 cm,照射時間為1,2,4,8,16 h。照射完畢后,按照1.3.2的方法測定濾液原液對白絹病菌的抑菌活性。以經(jīng)紫外燈照射相應時長的NB液體培養(yǎng)基代替發(fā)酵濾液為對照,每個處理重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 白絹病拮抗細菌的篩選

2.1.1 平板對峙試驗

通過平板對峙法檢測4株細菌對白絹病菌的拮抗作用,圖1可知,菌株WS3-1和WS2-1對白絹病菌的抑制作用最強,抑菌帶最寬。菌株nkkc的抑制效果次之,菌株WS3-2對病菌的抑制效果最差。同時還發(fā)現(xiàn)經(jīng)菌株WS3-1和WS2-1拮抗的病菌菌絲稀疏,挑取菌落邊緣的菌絲于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),不能正常生長。

圖1 花生白絹病拮抗細菌的篩選Fig.1 Screening of antagonistic bacteria against Sclerotiumr olfsii

2.1.2 細菌發(fā)酵濾液對病原菌生長的影響

表1可知,4株細菌發(fā)酵濾液對病原菌均有一定的抑菌活性,隨著稀釋倍數(shù)升高,抑菌活性逐漸下降。菌株WS3-1對白絹病菌的抑制效果最好,與其他3株細菌相比,其濾液原液、2倍和4倍稀釋濾液對病菌的抑制率都是最高,分別為95.04%、71.66%和30.64%。結(jié)合平板對峙試驗的結(jié)果,選取菌株WS3-1進行下一步試驗。

表1 細菌發(fā)酵濾液對花生白絹病菌的抑制作用Table 1 Antagonism by bacterial fermentation filtrate against Sclerotiumr olfsii

2.2 拮抗細菌WS3-1對白絹病菌菌絲生長及菌核形成的影響

試驗結(jié)果顯示,白絹病菌菌絲經(jīng)菌株WS3-1處理后菌絲形態(tài)出現(xiàn)異常,拮抗效果較為明顯,表現(xiàn)為菌絲腫脹變粗、交叉纏結(jié),菌絲頂端膨大畸形(圖2)。繼續(xù)培養(yǎng)15 d后,對產(chǎn)生的菌核進行計數(shù)。結(jié)果表明,經(jīng)WS3-1處理的白絹病菌產(chǎn)生的菌核數(shù)量為37粒,明顯少于對照平板產(chǎn)生的94粒菌核數(shù)量,表明菌株WS3-1可以抑制白絹病菌菌核的產(chǎn)生。

圖2 菌株WS3-1對白絹病菌的抑制效應Fig.2 Inhibition effect of strain WS3-1 against Sclerotiumr olfsii

2.3 拮抗細菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征和生理生化特征測定

菌株WS3-1在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,菌落呈圓形,稍微隆起,顏色為淡乳白色,不透明,表面較粗糙。細胞桿狀,革蘭氏染色陽性(圖3),芽孢卵圓形,中生。菌株WS3-1的生理生化特征結(jié)果見表2。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征,菌株WS3-1符合解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens特性。

圖3 菌株WS3-1的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain WS3-1

表2 拮抗細菌WS3-1的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain WS3-1

2.3.2 分子生物學鑒定

對菌株WS3-1的16S rDNA和gyrB序列進行測序,基因序列片段長度分別為1450 bp和1164 bp。將測得的序列提交至GenBank,獲得登錄號分別為MT579842和MW045314。將WS3-1的16S rDNA和gyrB序列分別與 GenBank 中的序列進行BLAST比對,發(fā)現(xiàn)與菌株WS3-1相似性最高的是Bacillusamyloliquefaciens,相似度均達99%以上。將比對獲得的同源序列和測定序列進行同源性分析,利用MEGA6.05軟件對16S rDNA與gyrB序列進行聯(lián)合建樹(圖4)。圖4可看出,菌株WS3-1與BacillusamyloliquefaciensBCRC14193 和BacillussiamensisKCTC13613同屬一個遺傳分枝,親緣關系十分接近。在BLAST 比對過程中,菌株WS3-1的16S rDNA 序列與Bacillusamyloliquefa-ciensBCRC14193的相似度為99.51%,與Bacillus siamensisKCTC13613 的相似度為99.44%,兩者非常接近,所以僅依靠16S rDNA 序列難以區(qū)分親緣關系接近的菌種。而菌株WS3-1的gyrB序列與BacillusamyloliquefaciensBCRC14193和BacillussiamensisKCTC13613 的相似度有較大差別,分別為99.40%和96.22%,具有很好的區(qū)分性。同時結(jié)合細菌的形態(tài)特征和生理生化特征,最終將菌株WS3-1鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖4 基于16S rDNA 和gyrB 序列構(gòu)建的菌株WS3-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on sequences of 16S rDNA and gyrB of strain WS3-1

2.4 WS3-1抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性測定

2.4.1 熱穩(wěn)定性測定

菌株WS3-1發(fā)酵濾液經(jīng)不同溫度處理后的抑菌活性如圖5所示。由結(jié)果可知WS3-1發(fā)酵濾液經(jīng)40℃、60℃、80℃條件下處理1 h后,其對花生白絹病菌的抑菌率均在90%以上,與未經(jīng)處理(25℃)的發(fā)酵液的抑菌活性沒有顯著差異。當溫度升高到100℃和120℃后,抑菌活性仍達到42.09%和31.92%,說明WS3-1發(fā)酵濾液中含有耐高溫的抗菌物質(zhì)。

圖5 溫度對菌株WS3-1抑菌活性的影響Fig.5 Influence of temperature on antifungal activity of strain WS3-1

2.4.2 pH 穩(wěn)定性

菌株WS3-1發(fā)酵濾液經(jīng)不同pH 處理后,得到的上清和沉淀的抑菌活性如表3所示。在pH為7～10的條件下,菌株WS3-1對白絹病菌的抑菌率均在84%以上,抑菌活性穩(wěn)定,不產(chǎn)生沉淀,說明WS3-1發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)受堿性條件影響較小,在堿性條件下可以穩(wěn)定存在。當pH<7時,發(fā)酵濾液開始產(chǎn)生沉淀,隨著pH 的下降,上清液的抑菌活性逐漸降低,產(chǎn)生沉淀的抑菌活性逐漸升高。當pH=3時,沉淀的抑菌率達到78.42%,而上清液的抑菌活性只有18.61%,說明在酸性條件下WS3-1發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)會出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。

表3 pH 對菌株WS3-1抑菌活性的影響Table 3 Influence of pH on antifungal activity of strain WS3-1

2.4.3 紫外線穩(wěn)定性

菌株WS3-1經(jīng)紫外線處理后的抑菌活性如圖6所示。隨著紫外線照射時間的增加,菌株WS3-1的抑菌活性逐漸下降,但變化不明顯。照射16 h 后,抑菌率仍達到72.07%,說明菌株WS3-1發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)具有較好的抗紫外線分解能力。

圖6 紫外照射對菌株WS3-1抑菌活性的影響Fig.6 Influence of ultraviolet on antifungal activity of strain WS3-1

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌是一類好氧、能產(chǎn)生內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽性細菌,廣泛存在于土壤、水源和植物根際中,同時也是常見的植物內(nèi)生細菌。研究表明,芽孢桿菌對植物不僅具有促生作用,還具有內(nèi)生固氮和防治病害等多方面的生物學作用[22-23]。由于芽孢桿菌對人畜無害,對生態(tài)環(huán)境友好,同時自身具有較強的抗逆性,因此是目前極有開發(fā)應用前景的一類生防菌。本文通過平板對峙試驗和菌絲生長速率法篩選到一株對花生白絹病菌具有拮抗活性的細菌菌株WS3-1,該菌發(fā)酵濾液原液對白絹病菌菌絲的生長抑制率達到95.04%,同時還可抑制病菌菌核的產(chǎn)生。利用細菌形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA 和gyrB序列聯(lián)合分析,將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。解淀粉芽孢桿菌是一種重要的生防細菌,具有較廣的抑菌譜,能夠防治多種真菌和細菌類病害。鄧建良等[24]從果園土壤中分離到一株解淀粉芽孢桿菌YN-1,該菌的抑菌譜廣泛,對包括絲核菌和鐮刀菌在內(nèi)的多種病原菌都有較好的拮抗作用。蔣凱麗等[25]從圣女果中分離到一株解淀粉芽孢桿菌KL-1,經(jīng)研究菌株KL-1對極細鏈格孢菌、黑曲霉、青霉菌和膠孢炭疽菌等多種病原菌都有明顯的抑制作用,抑菌譜廣泛。

微生物的次級代謝產(chǎn)物是極其復雜的,代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性對活性物質(zhì)的提取、生產(chǎn)應用都起著至關重要的影響。本文研究了菌株WS3-1次級代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)經(jīng)40℃、60℃、80℃處理后活性穩(wěn)定,抑菌率保持在90%以上,但當溫度升到100℃和120℃后抑菌活性迅速下降,說明菌株WS3-1產(chǎn)生的活性物質(zhì)中含有不耐高溫物質(zhì),可能是某種蛋白酶類物質(zhì)。宋利沙等[26]對分離自腫節(jié)風體內(nèi)的一株內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌進行研究,發(fā)現(xiàn)該菌株可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和蛋白酶等多種抗菌活性物質(zhì),這些酶類可單獨或協(xié)同作用使病菌菌絲頂端膨大畸形,導致菌絲不能正常生長。這與本研究篩選的解淀粉芽孢桿菌WS3-1可促使白絹病菌菌絲畸形和死亡的結(jié)果相一致,推測菌株WS3-1也可產(chǎn)生上述酶類物質(zhì)破壞菌絲細胞結(jié)構(gòu)從而抑制病菌的生長。菌株WS3-1發(fā)酵濾液經(jīng)121℃處理20 min后仍具有一定的抑菌活性,抑菌率為31.92%,說明WS3-1產(chǎn)生的活性物質(zhì)中還包含部分耐高溫成分。同時WS3-1發(fā)酵濾液經(jīng)酸處理后上清液抑菌活性迅速下降,活性物質(zhì)出現(xiàn)了酸沉現(xiàn)象,推測菌株WS3-1活性物質(zhì)中的耐高溫成分是一種脂肽類物質(zhì)。王寶等[27]研究了一株解淀粉芽孢桿菌BEB33對香蕉枯萎病菌的生防作用,發(fā)現(xiàn)菌株BEB33發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)可以引起病菌菌絲細胞膨大、細胞膜穿孔,從而抑制病原菌的生長。對于菌株WS3-1在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶類和脂肽類物質(zhì),我們將在接下來的試驗中進一步研究。