崔順立 侯名語 胡曉輝 陳 靜 劉立峰*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學,河北 保定 071001；2.山東省花生研究所,山東 青島 266100)

毛狀根是植物受發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)誘導產(chǎn)生,最早于1907 年由Smith和Townsend發(fā)現(xiàn)。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導毛狀根的生成主要依靠其體內的Ri質粒,該質粒獨立于發(fā)根農(nóng)桿菌染色體之外,由DNA 轉移區(qū)(Transfer-DNA region,T-DNA)、毒性區(qū)(Virulence region,Vir)、復制起始區(qū)(Origin of replication,Ori)和冠癭堿代謝功能區(qū)(OPine CAtabolism,OPCA)組成。植物組織受到發(fā)根農(nóng)桿菌侵染時,侵染部位的細胞會產(chǎn)生酚類小分子物質,誘導活化Ri質粒的Vir區(qū),Vir區(qū)調控Ri質粒的其他區(qū)完成侵染,產(chǎn)生毛狀根,并改變植物體內代謝[1-2]。由于其生長速度快、遺傳穩(wěn)定、次生物代謝含量高等特點,在植物藥用成份生產(chǎn)、植物基因功能研究、植物根際研究中得到廣泛應用。

花生是世界上廣泛種植的油料和經(jīng)濟作物,解析遺傳機制、研究花生基因功能是促進花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎?；ㄉ仓曛泻胸S富的黃酮類多酚化合物[3-4],利用花生毛狀根生產(chǎn)白藜蘆醇等藥用成份已有探索性研究[5-6]。槲皮素是花生中主要的黃酮類功能成份[3-4],具有細胞保護作用的強效抗氧化性和抗纖維化作用,在150 mg·d-1劑量下可下調收縮壓。且在幾種腫瘤細胞系中表現(xiàn)出抗癌和凋亡誘導作用,如結腸癌CT-26 細胞、前列腺癌LNCaP細胞、人前列腺PC3細胞、嗜鉻細胞瘤PC12細胞、雌激素受體陽性乳腺癌MCF-7細胞、急性淋巴細胞白血病MOLT-4 T 細胞、人骨髓瘤U266B1細胞、人淋巴結Raji細胞和卵巢癌CHO 細胞[7]。利用花生毛狀根生產(chǎn)槲皮素也將是解決槲皮素生產(chǎn)的重要方向。

因此,探索花生毛狀根生長機理,對花生基因功能研究及藥用成份生產(chǎn)具有重要意義。已有研究多圍繞菌株種類、花生種質、外植體類型及培養(yǎng)基成份等進行探索,以提高發(fā)根轉化花生的效率[5,8-11],但相關機理研究鮮見報道。已有研究表明農(nóng)桿菌侵染植物時,會產(chǎn)生乙酰丁香酮類多酚化合物,促進農(nóng)桿菌轉化(Escudero 和Hohn,1997)[12]。乙酰丁香酮在農(nóng)桿菌轉化中得到廣泛應用?；ㄉ泻胸S富的黃酮類多酚化合物[3-4],但對發(fā)根農(nóng)桿菌轉化所起的作用鮮有研究。本研究采用黃酮含量不同的花生種質進行發(fā)根轉化,測定發(fā)根農(nóng)桿菌的轉化效率,以期為解析黃酮在發(fā)根農(nóng)桿菌侵染花生中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用10個花生種質分別為:花育51號、花育36號、魯花11 號、灤平大花生、冀花16號、濮科花9號、冀農(nóng)花6號、P67-3、四粒紅、東北王。其中灤平大花生、冀花16號、冀農(nóng)花6號由河北農(nóng)業(yè)大學花生研究室提供,其余7個由山東省花生研究所提供。均為2017年秋收獲的花生種子,干燥后貯存于-20℃冰箱。

發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599,由河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院葛淑俊老師提供。

1.2 侵染及發(fā)根誘導

干燥花生種子依次經(jīng)75%乙醇浸泡1 min、無菌水清洗2次、0.1%氯化汞浸泡15 min、無菌水清洗3次后,接種在B5固體培養(yǎng)基上,于25℃、10 h光照/14 h黑暗下培養(yǎng)4 d。3次重復,每重復50粒。培養(yǎng)4 d的花生子葉作為外植體,剝去種皮,K599侵染15 min后接種于共培養(yǎng)基上,于黑暗條件下培養(yǎng)4 d后轉接到不含任何激素的發(fā)根培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d,統(tǒng)計誘導發(fā)根數(shù)并計算發(fā)根誘導率。

發(fā)根誘導率/%＝產(chǎn)生發(fā)根的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100

pH 5.4的共培養(yǎng)基成份為:3.2 g/L B5+20 g/L蔗糖+0.4 g/L MES+0.8 g/L 瓊脂+100 μmol/L乙酰丁香酮(AS)。pH 5.7發(fā)根培養(yǎng)基成份為:3.2 g/L B5+15 g/L蔗糖+0.4 g/L MES+0.8 g/L瓊脂+250 mg/L頭孢+100 mg/L特美汀(TIM)+100 mg/L萬古霉素。

篩選5株長勢良好的根系切下,接種到發(fā)根培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d,將根取出37℃烘干2 d,稱質量。

1.3 毛狀根GFP 基因PCR 驗證

利用CTAB 法提取毛狀根中的DNA[4]。根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌K599 T-DNA的基因序列(GenBank登記號EF433766),參考曹慶豐合成K599rolC基因擴增引物P1(5'-3'):ATGGCGGAATTTGACCTAT和P2(5'-3'):TTAGTTCCATCTGCCCATCC,設定擴增反應體系及PCR程序[13]。

采用1%瓊脂糖凝膠電泳。引物在生工生物工程公司合成。Taq 酶購自寶生物工程公司,2 kb Marker購自博邁德生物公司,采用博邁德生物公司的5×DNA Loading Buffer with Gelred進行染色。

1.4 黃酮含量測定

總黃酮含量測定參照Hou等[4]方法。以蘆丁(RT:Rutin)為標準品?？傸S酮含量(TFC,Total flavonoid content)以每克花生籽仁質量(FM:Fresh Mass)含RT的μg當量值表示,即:μg RTE/g FM。

1.5 結果計算

采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)計算和繪圖,用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行種子黃酮含量差異顯著性檢驗(LSD法)。

2 結果與分析

2.1 花生種子黃酮含量

10個花生種質中,以花育51號黃酮含量最高,為670μg RTE/g FM,其次是冀花16號和冀農(nóng)花6號,均極顯著高于其他花生品種。含量最低的是四粒紅和濮科花9 號,分別為408μg RTE/g FM,444μg RTE/g FM,顯著低于其他品種。

種子萌發(fā)后3～4 d,其黃酮含量的變化趨勢基本相同,均表現(xiàn)升高趨勢,但至萌發(fā)后5 d時,黃酮含量變化出現(xiàn)分異,其中,東北王、四粒紅、魯花11號、花育51號、冀農(nóng)花6號和濮科花9號等6個品種的總黃酮含量呈上升趨勢,至第5 d升高幅度101.8～446.3μg RTE/g FM,以濮科花9號升幅最大；P67-3、花育36號、冀花16號和灤平大花生的黃酮含量在前4 d呈上升趨勢,至第5 d時出現(xiàn)下降,以P67-3種質降幅最大,為227.8μg RTE/g FM(圖1)。故選擇各種質黃酮含量高的第4 d進行侵染轉化。

圖1 花生種子及萌發(fā)過程中總黃酮含量Fig.1 TFC in peanut seeds during germination process

2.2 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染花生種子結果

花生種子在B5培養(yǎng)基上萌發(fā)第4 d,胚根突破種皮0.2～0.5 cm 時進行侵染與共培養(yǎng),發(fā)根培養(yǎng)基上第3 d開始長出發(fā)根(圖2A、2B、2C)。根系培養(yǎng)5 d時進行PCR驗證,以未轉化的花生實生苗根作對照,含有rolC基因433 bp擴增條帶視為轉化根系。圖3和圖4示出,花育51號誘導率最高,為71.0%,其次是東北王,為66.0%,誘導率最低是冀花16號,僅為23.1%,濮科花9號誘導率30.4%,僅高于冀花16號。根系培養(yǎng)10 d后(圖2D),其干質量以花育51號根最大,為0.047 g,最低為冀花16號,其質量僅為0.013 g(圖4)。從整體趨勢分析發(fā)現(xiàn),誘導率高的種質根質量較高。

圖2 發(fā)根農(nóng)桿菌轉化花生種子過程Fig.2 Transformation process of peanut seeds by Agrobacterium rhizogenes

圖3 花生毛狀根中發(fā)根農(nóng)桿菌K599 rolC 基因PCR結果Fig.3 PCR amplification of rolC gene from Agrobacterium rhizogenes K599 in peanut hairy roots

圖4 發(fā)根農(nóng)桿菌轉化花生種子誘導率Fig.4 Induction rate of transformation of peanut seeds by Agrobacterium rhizogenes

2.3 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染與花生種子黃酮含量關系

侵染時花生黃酮含量與發(fā)根農(nóng)桿菌誘導率之間相關分析表明兩者間呈線性負相關(圖5),相關系數(shù)r＝-0.78,即花生體內的黃酮降低了發(fā)根誘導率。

圖5 發(fā)根農(nóng)桿菌誘導率與花生黃酮含量的相關關系Fig.5 Correlation between induction rate of Agrobacterium rhizogenes and TFC in peanut

3 討論

黃酮作為植物體內抗氧化的次生代謝物質,在植物體抗病菌反應中起著重要作用。根瘤菌侵入豆科作物根系的第一步即是刺激植物體分泌黃酮類物質,黃酮在根瘤菌膜上擴散并誘導NodD(Nodulate D)蛋白質的合成,從而激活其他與結瘤有關的基因的轉錄[14]?？梢?黃酮可以起到抗病菌作用,但在豆科作物上又是有利于根瘤菌侵染的物質。本研究結果顯示黃酮不利于發(fā)根農(nóng)桿菌侵染,而是起到了抗病作用。乙酰丁香酮類酚類化合物通過活化Vir區(qū),誘導發(fā)根產(chǎn)生,黃酮類多酚化合物是否抑制了Vir區(qū)活化,或在Vir區(qū)誘導其他區(qū)活化時起到阻礙作用從而抑制了發(fā)根產(chǎn)生,有待進一步研究。另一方面,花生體內含有多種黃酮類化合物,在抗發(fā)根農(nóng)桿菌侵染中起的作用可能不同。大豆發(fā)根抗鐮刀菌Fusariumsolanif.sp.glycines侵染時,在大豆甙(daidzin)、黃豆甙(glycitin)、染料木甙(genistin)及三者各自的苷元前體、香豆雌酯(coumestrol)、大豆抗毒素(glyceollin)等8種異黃酮中,主要是大豆抗毒素起作用[15]。在進一步研究中應該明確花生中各黃酮在發(fā)根農(nóng)桿菌侵染中的作用。