隋新瑩，劉國利，董春海

（1.青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山東 青島 266109；2.無棣縣小泊頭鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務中心，山東 無棣 251911）

鐵是植物生長所必需的微量元素之一［1］，多位于葉綠體內(nèi)，參與葉綠素的合成、細胞內(nèi)的氧化還原反應、呼吸作用、生物固氮、酶促反應等重要生理過程［2］。鐵更是人體所必需的微量元素之一［3］，是人體血紅蛋白、肌紅蛋白的重要組成成分，能運輸O2和CO2，也是過氧化氫酶和過氧化物酶的重要組成成分［4］。人體缺鐵會患缺鐵性貧血，從而引發(fā)營養(yǎng)不良、免疫力下降、生長發(fā)育遲緩、智力低下等病癥［5］，影響人們身體和心理的健康。據(jù)報道，缺鐵性貧血已成為僅次于結核病的全球患病率最高、耗資最大的公共衛(wèi)生問題［6］，在一定程度上阻礙社會經(jīng)濟的發(fā)展。

治療缺鐵性貧血主要通過服用鐵營養(yǎng)素補充劑、調(diào)整飲食結構、食物強化以及生物強化等。其中，服用鐵營養(yǎng)素補充劑的方法見效快，但經(jīng)濟成本高且副反應比較多［7］；調(diào)整飲食結構的方法在我國生活貧困家庭中將無法實現(xiàn)，且見效慢［8］；食物強化的方法簡單、有效，但成本也較高，且社會認同度低。相比較而言，生物強化，即通過育種手段提高現(xiàn)有農(nóng)作物籽粒中微量營養(yǎng)元素鐵的含量，不僅具有生產(chǎn)簡單、易于接受的特點，而且食用方便、經(jīng)濟實惠，是防止和改善人體鐵元素缺乏最經(jīng)濟、最安全和最有效的方法之一［9］。目前，國內(nèi)外科技工作者已經(jīng)認識到利用農(nóng)作物提高鐵營養(yǎng)的重要性，但有關鐵強化作物的育種研究較少，市場缺乏優(yōu)質(zhì)的鐵營養(yǎng)種植品種。

小麥是最重要的主糧作物之一，全球約1／3的人口依賴小麥提供基本的營養(yǎng)需求。在全球人口日益增長的大環(huán)境下，利用現(xiàn)代育種手段提高小麥產(chǎn)量、提升其營養(yǎng)價值，無論對緩解人類營養(yǎng)需求的壓力還是保障我國糧食安全都具有極其重要的意義。前期研究中，我們利用化學誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）對小麥主栽品種魯原502進行誘變，并在鹽堿地高通量篩選獲得了耐鹽、高產(chǎn)新品系［10］。在此基礎上，又從耐鹽、高產(chǎn)新品系中篩選獲得了富鐵小麥新材料，并對與鐵元素吸收、運輸相關的關鍵基因表達進行了分析。這對于人們深入了解小麥中鐵營養(yǎng)元素的分子調(diào)控以及培育有益于人體健康的鐵營養(yǎng)強化作物都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥耐鹽、高產(chǎn)突變體材料來自于前期研究中利用化學誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）對魯原502進行誘變獲得的M3～M5代單株系［11］。小麥誘變及鹽堿地自然篩選于2016—2020年分別在山東省東營市利津縣毛坨村和濱州市無棣縣小泊頭鎮(zhèn)郭馬村試驗田進行。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 小麥突變體幼苗根系的鐵敏感性分析 挑選籽粒飽滿的小麥種子于50 mL離心管中，加入40 mL去離子水和10 mL次氯酸鈉（去離子水∶次氯酸鈉＝4∶1），再加入15μL Triton X－100，于200～250 r／min搖床上振蕩15 min，重復兩次；再換成去離子水，清洗3次。將清洗完的種子置于4℃冰箱浸種過夜。然后將種子擺放在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入10 mL EDTA－Fe溶液，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后觀察并記錄小麥幼苗的最長根生長。

1.2.2 小麥突變體籽粒鐵元素含量分析 將洗凈的種子于65℃烘箱中烘干，然后于粉碎機中充分粉碎，過1 mm篩。稱量1.0000 g粉碎好的樣品于消解管中，加入10 mL HNO3和2 mL HClO4，靜置過夜；在160℃的消解儀上加熱消解至溶液澄清透明且只剩1 mL左右，再加入10 mL去離子水，繼續(xù)加熱除酸后趁熱轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，混勻后靜置過夜。采用ICP－OES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀對鐵元素含量進行測定。

1.2.3 小麥突變體幼苗鐵相關基因的表達分析 將洗凈、浸泡好的種子擺放在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入10 mL去離子水，置于25℃、16 h光照／8 h黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，用鑷子將其胚乳去除，再在1／5Hoagland營養(yǎng)液（無微量元素）中培養(yǎng)7 d，然后將培養(yǎng)液換成EDTA－Fe溶液（1.5 mmol／L），分別處理0、3、6、12、24 h后取材，用于RNA 提取。利用TIANGEN 公司的TRNzol Universal試劑盒進行總RNA的提取。利用諾唯贊HiScriptⅢAll－in－one RT SuperMix Perfect for qPCR 試劑盒進行gDNA 的合成。qRT－PCR分析采用諾唯贊公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，所用引物由青島擎科公司合成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用WPS軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖，用LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 小麥耐鹽突變體的鐵敏感性分析

前期研究中，我們利用EMS對小麥魯原502進行遺傳誘變，經(jīng)過鹽堿地自然篩選獲得了約2 000個株系［10］。進一步利用150 mmol／L NaCl脅迫處理篩選出430個耐鹽性強的株系。將這些耐鹽株系以等量種子（150 g）在同等面積（約20 m2）的鹽堿地上進行模塊式種植，分別在2018、2019、2020年統(tǒng)計分析M3、M4、M5代的產(chǎn)量，篩選獲得了11個耐鹽小麥新品系，產(chǎn)量平均增幅在2.46%～31.52%。

為了分析這些耐鹽小麥突變體的鐵敏感性，我們先將野生型（WT）對照材料（魯原502）的種子置于不同濃度的EDTA－Fe溶液培養(yǎng)36 h，觀察比較幼苗根系對鐵的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)幼苗的最長根長隨鐵濃度增大先增加后減小，在EDTA－Fe濃度為1.5 mmol／L時達最大值，所以本試驗選擇1.5 mmol／L為鐵敏感性的EDTA－Fe篩選濃度。

通過觀察外源鐵（1.5 mmol／L EDTA－Fe）處理對11個耐鹽小麥突變體幼苗最長根生長的影響（圖1 A），發(fā)現(xiàn)兩個突變體（LY 1－29和LY 2－7）的幼苗最長根長明顯大于野生型，而其它突變體幼苗的最長根長與野生型相近。進一步利用不同濃度的EDTA－Fe（0、0.5、1.5、3.0、4.5 mmol／L）對這兩個突變體進行處理，結果（圖1 B）表明，野生型（魯原502）和兩個突變體（LY 1－29和LY 2－7）的幼苗最長根長均在EDTAFe濃度為1.5 mmol／L時達到最大值；在高濃度EDTA－Fe（1.5、3.0、4.5mmol／L）處理下，兩個突變體（LY 1－29和LY 2－7）的幼苗最長根長均極顯著大于野生型對照（P＜0.01）。

圖1 小麥耐鹽突變體幼苗根系的鐵敏感性分析

2.2 小麥耐鹽突變體的籽粒鐵含量測定

為了深入了解小麥耐鹽突變體的鐵敏感性改變是否與內(nèi)源鐵元素含量有關，選取兩個鐵敏感性顯著降低的突變體（LY 1－29和LY 2－7）進行鐵含量測定。結果（圖2）顯示，兩個突變體籽粒的鐵含量顯著高于野生型，其中，LY 1－29的籽粒鐵含量為80.00 mg／kg，比野生型的高126%；LY 2－7的籽粒鐵含量為76.39 mg／kg，比野生型的高115%。

圖2 小麥籽粒鐵含量測定

2.3 小麥耐鹽突變體中鐵相關基因的表達分析

小麥耐鹽突變體中鐵含量的增加可能與鐵吸收及轉(zhuǎn)運相關基因的表達密切相關。為了解兩個突變體（LY 1－29和LY 2－7）中鐵含量增高的分子基礎，選取小麥中與鐵吸收、轉(zhuǎn)運相關的基因進行表達水平測定，包括TaYSL1（yellow stripe like，登錄號：TraesCS2B01G407900）、TaFIBP（ferric ion binding protein，登錄號：TraesCS1A01G019900）、TaIITT（iron transmembrane transporter，登錄號：TraesCS4B01－G219000）、TaRTH（RTE1－h(huán)omolog，登錄號：TraesCS5A02G445300）、TaZIP29［11］（zinc－regulated transporters and iron－regulated transporterlike protein，登錄號：TraesCS6D02G153800）。

qRT－PCR分析結果表明，這5個與鐵吸收、轉(zhuǎn)運相關的基因在野生型和突變體中的表達模式各不相同，但均在鐵溶液處理的一定時間后呈現(xiàn)高水平表達（圖3）。值得特別關注的是，LY 1－29、LY 2－7兩個突變體中，這5個與鐵吸收、轉(zhuǎn)運相關的基因表達量在鐵溶液處理后均不同程度地高于野生型對照。

圖3 EDTA－Fe處理下小麥富鐵突變體中鐵吸收、轉(zhuǎn)運相關基因的表達分析

3 討論與結論

我國可耕地面積小，土地鹽漬化較為嚴重，導致農(nóng)作物產(chǎn)量和營養(yǎng)價值降低。

甲基磺酸乙酯（EMS）是一種溫和的化學誘變劑，其誘變產(chǎn)生的點突變頻率高、染色體畸變少、破壞性小，且誘變具有隨機性，可獲得豐富的遺傳材料，在遺傳育種中廣泛應用。在小麥中，如張維宏等［12］利用EMS誘變獲得6個葉銹病敏感型突變體；薛芳等［13］利用EMS誘變獲得7個抗性淀粉含量高的突變體；Zhang等［14］利用EMS誘變獲得晚抽穗突變體；趙天祥等［15］利用EMS誘變獲得特矮變異突變體。但EMS誘變在耐鹽小麥研究中應用還較少。我們在前期研究中利用EMS誘變小麥栽培品種魯原502，經(jīng)鹽堿地自然篩選和高鹽（150 mmol／L）篩選，獲得了耐鹽、高產(chǎn)突變體株系［10］，為深入研究小麥耐鹽機制提供了新種質(zhì)。

研究表明，小麥等禾本科單子葉植物吸收、轉(zhuǎn)運鐵元素的過程可分三步，首先缺鐵信號使植物根系向土壤中分泌一種可以與三價鐵螯合的麥根酸類物質(zhì)，該種物質(zhì)具有很強的螯合鐵離子的能力，能螯合6個三價鐵離子并形成穩(wěn)定的八面體結構（Fe3＋－MAs）［16］；然后，位于植物根系細胞原生質(zhì)膜上的Fe3＋－MAs運載系統(tǒng)能專一性地將Fe3＋－MAs轉(zhuǎn)運至植物根系細胞質(zhì)中［17］；在細胞內(nèi)，三價鐵被還原成二價鐵，供細胞利用。與鐵吸收及轉(zhuǎn)運有關的基因家族主要包括鋅鐵轉(zhuǎn)運體蛋白家族（ZIP）、自然抗性相關巨噬蛋白家族（NRAMP）和黃色條紋蛋白家族（YSL）［2］。

本研究利用1.5 mmol／L EDTA－Fe從前期獲得的耐鹽突變體中篩選到了兩個富鐵的耐鹽小麥新材料LY 1－29和LY 2－7，兩者的籽粒鐵含量分別比野生型對照高126%和115%；經(jīng)外源鐵誘導，三價鐵轉(zhuǎn)運蛋白基因TaFIBP、鐵離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因TaIITT、Fe3＋－MAS螯合蛋白基因TaYSL1和TaZIP29均在兩材料體內(nèi)不同程度高水平表達，且表達水平高于野生型。說明這些基因的高水平表達可能是導致籽粒鐵元素增高的關鍵因素。AtRTH是AtRTE1的同源基因，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)擬南芥rth－1突變體對鐵離子處理不敏感，暗示該基因可能與鐵吸收運輸有關。本研究結果顯示，TaRTH在耐鹽、富鐵突變體材料中的表達受鐵離子誘導，且表達水平顯著高于野生型，這為深入了解RTH蛋白在鐵代謝中的功能提供了新材料。

中國營養(yǎng)學會《中國居民膳食營養(yǎng)參考攝入量》中推薦成年男性每日最佳鐵攝入量為15 mg，成年女性每日為20 mg［18］。但調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，目前人們的膳食水平無法達到此標準，鐵缺乏成為最大的“隱性饑餓”［6］。我國不同地區(qū)不同品種小麥籽粒中的鐵含量不同，大多數(shù)小麥栽培品種的鐵元素含量為32.5～65.6 mg／kg［19－22］。本研究獲得的兩個小麥耐鹽突變體的籽粒鐵含量分別為80.00 mg／kg和76.39 mg／kg，遠高于市場上的小麥栽培品種，是優(yōu)質(zhì)的富鐵小麥新材料，為選育優(yōu)質(zhì)富鐵小麥品種提供了材料。