余梅 杜軍華 張寶靜 陳群

摘? 要：真姬菇是一種優(yōu)質珍稀食用菌，已實現(xiàn)工廠化栽培，營養(yǎng)和保健價值較高。以真姬菇1個菌株B5為材料，用原生質體單核化和單孢分離的方法分別分離原生質體單核體和孢子單核體，進行四極性交配型的遺傳學分析，在此基礎上，結合核遷移試驗，對4種交配型的孢子單核體進行交配型的準確鑒定。通過原生質體單核化獲得567個原生質體單核體，采用標準測交菌株法，確定測交菌株T1、T2的交配型為A1B1、A2B2;通過單孢分離獲得94個孢子單核體，常規(guī)鑒定出T1、T2、T3和T4 4種交配型的數(shù)量分別為24、27、25和17，另外還鑒定出1個重組交配型T5（ArBr）;通過核遷移試驗，準確鑒定出4種交配型分別為A1B1、A2B2、A1B2和A2B1;χ2檢驗同時證實真姬菇是四極性異宗結合擔子菌。

關鍵詞：真姬菇;交配型;核遷移;原生質體

中圖分類號：S646????? 文獻標識碼：A

Genetic Determination of Mating Type in Hypsizygus marmoreus

YU Mei1， DU Junhua2*， ZHANG Baojing1， CHEN Qun3*

1. Life Science School， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036， China; 2. Life Science School， Qinghai Normal University， Xining， Qinghai 810008， China; 3. School of Biology Food and Environment， Hefei University， Hefei， Anhui 230601， China

Abstract： Hypsizygus marmoreus is a large-scale high-quality raise edible fungus with rich nutrition and health care value. In this paper， many protoplast monokaryons and spore monokaryons were isolated by protoplast mononuclearization and single spore isolation using B5 of a strain of H. marmoreus. After genetic analysis of the mating type of tetrapolar bacteria， the four mating types of spore monokaryons were accurately identified by the nuclear migration assay. 567 protoplast monokaryons were obtained by protoplast mononuclearization， and the mating types of the test strains T1 and T2 were determined to be A1B1 and A2B2 by the standard test strain method. 94 spore monokaryons were obtained by single spore isolation. The number of the four mating types of T1， T2， T3 and T4 was routinely identified as 24， 27， 25 and 17， respectively. And a recombinant mating type T5 （ArBr） was also identified. Through the nuclear migration test， the four mating types were accurately identified as A1B1， A2B2， A1B2， and A2B1. It was confirmed that H. marmoreus was a quaternary heterozygous combination basidiomycete by the chi-square test.

Keywords： Hypsizygus marmoreus; mating type; nuclear migration; protoplast

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.012

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）近年來風靡日、韓等國家，具有廣闊的市場，其年產(chǎn)量僅次于杏鮑菇和金針菇。真姬菇有豐富的營養(yǎng)和保健價值，值得深入開發(fā)。但我國對真姬菇的研究起步較晚，研究領域比較片面，尤其在分子遺傳學方面研究甚少。已有研究報道真姬菇是一種四極性異宗結合食用菌，子實體可產(chǎn)生4種不同交配型孢子，其交配系統(tǒng)由兩個非連鎖A、B交配型位點控制[1]。只有交配位點均不同，即A≠B≠時才能配對雜交形成雙核體，從而完成整個有性生活史。20世紀80年代，建立了四極性食用菌交配型常規(guī)鑒定程序，即通過三輪配對初步區(qū)分同一菌株的4種交配型[2]，但無法準確分析每個交配型具體的A、B位點構成，也無法區(qū)分親本型和重組型，因此，無法進行交配型的深入研究[3]。直到原生質體單核化技術的出現(xiàn)，使交配型的常規(guī)鑒定程序更為簡便可靠，可以直接確定兩個親本型的交配型，極大地減少工作量[4-5]，再結合核遷移試驗，即可準確鑒定4種交配型[6]。在食用菌遺傳育種研究中，交配型研究與育種實踐有著密切的關系，本研究在利用原生質體單核化和單孢分離的方法對真姬菇進行交配型常規(guī)分析的基礎上，結合核遷移試驗，對4種交配型孢子單核體進行交配型的準確鑒定，為今后深入研究真姬菇的遺傳規(guī)律和育種工作奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? 本研究所用真姬菇菌株B5，由上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所提供。

1.1.2? 試劑與培養(yǎng)基? 麥芽糖、酵母粉為Oxoid Limited產(chǎn)品，蔗糖、葡萄糖為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品，瓊脂粉為Yeasen Biotech Company Limited產(chǎn)品，溶壁酶為廣東省微生物研究所廣東博沃特生物科技有限公司產(chǎn)品。

穩(wěn)滲劑：稱取蔗糖17.1 g，加ddH2O定容至100 mL，自然pH下，121 ℃、20 min高溫滅菌;溶壁酶溶液：每管稱取0.075 g溶壁酶，加入5 mL穩(wěn)滲劑配成溶壁酶溶液，使用前用0.22 μm微孔細菌過濾器過濾滅菌。

PDA培養(yǎng)基（土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g）、YMG液體培養(yǎng)基（酵母粉4 g、麥芽糖10 g、葡萄糖4 g）、YMGS再生培養(yǎng)基（酵母粉4 g、麥芽糖10 g、葡萄糖4 g、蔗糖171 g、瓊脂粉15 g）均各自加蒸餾水定容至1 L，自然pH下，121 ℃、20 min高溫滅菌;PDA+Amp（氨芐青霉素）培養(yǎng)基在PDA高溫滅菌后冷卻到60 ℃加入1 mL過濾滅菌的Amp（10萬單位）。

1.1.3? 儀器與設備? ZHJH-C1112B智城超凈工作臺、ZHWY-100C搖床、ZXSD-B1270生化培養(yǎng)箱、ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司;Centrifuge 5810 R臺式高速冷凍離心機，艾本德中國有限公司;OLYMPUS BX60熒光顯微鏡，Olympus Inc.;FB224自動內校電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SX-500自動高壓滅菌鍋，Gene Company Limited。

1.2? 方法

1.2.1? 原生質體單核體分離及交配型鑒定? （1）菌種活化與菌絲培養(yǎng)。將供試菌種接種到PDA平板上活化，置于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)12～14 d，直至菌絲長滿整個平板。從活化好的菌絲平板挖取菌塊10～12塊放于YMG液體培養(yǎng)基內，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4～8 d，形成一個個小菌絲球，即可進行原生質體的制備。

（2）原生質體制備。原生質體制備步驟參考林芳燦等[7]、劉海英等[8]的方法，做出少許改進：把0.075 g溶壁酶加入5 mL、0.5 mol/L蔗糖溶液，用槍吹打后置于搖床充分混勻。用4層無紡布過濾菌絲球，用0.5 mol/L蔗糖溶液洗滌2次，挖取少許菌絲置入50 mL離心管中。通過0.22 μm過濾器將溶壁酶溶液注入離心管內，輕輕攪拌混勻，置于搖床振蕩酶解3 h（31 ℃、70～80 r/min），即可獲得原生質體粗提液。制備過程中應注意酶解時間的控制，過度酶解會影響原生質體的再生率，經(jīng)常鏡檢以及時查看原生質體的獲得情況[9]。粗提液用4層無紡布過濾、0.5 mol/L蔗糖溶液配平后離心10 min（4 ℃、3000 r/min），沉淀用蔗糖溶液洗滌1次后加入蔗糖溶液混勻，即得到純化原生質體懸浮液，血球計數(shù)板計數(shù)。

（3）原生質體再生及單核體確定。稀釋原生質體懸浮液至適宜濃度（104～105個/mL），分別吸取50、100、200 μL等梯度置于90 mm的YMGS再生培養(yǎng)基上，涂布棒輕輕涂勻，封口，置于22 ℃的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。約5～7 d后有放射星芒狀的微小菌落出現(xiàn)，直至平板內出現(xiàn)菌落大小差異。挑取較小的菌落、編號，放在60 mm PDA平板上，22 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)，較大的菌落棄去。等到挑取的單菌落長到直徑大于0.5 cm時即可鏡檢，將沒有鎖狀聯(lián)合的單核菌絲轉接到新PDA平板上培養(yǎng)，備用。

（4）測交菌株T1、T2確定。選取長勢最好的單核體作為測交菌株T1，指定其交配型為A1B1，和剩下單核體兩兩配對，即在PDA平板上，分別接入T1和待測單核體的接種塊，每個平板只接1對，二者相距0.5～1.0 cm，封口，于22 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)約7 d后，兩菌落生長交接在一起時，挑取交接處的菌絲鏡檢。有鎖狀聯(lián)合的為親和反應（+），表示待測菌株交配型與T1不同，記為T2，其交配型為A2B2;沒有鎖狀聯(lián)合的為不親和反應（–），表示待測菌株交配型與T1相同。

1.2.2? 孢子單核體分離及交配型鑒定? （1）單孢分離培養(yǎng)及單核體確定。采用文獻[10-11]的方法收集孢子，選擇供試親本雙核菌株生長良好的子實體收集孢子，以無菌水稀釋孢子至適宜涂布濃度（104～105個/mL），吸取150 μL孢子懸浮液在90 mm的PDA+Amp平板上涂布均勻，22 ℃恒溫培養(yǎng)約10 d后，挑選單菌落、編號，在60 mm的PDA+Amp平板上傳代培養(yǎng)。孢子單核體的確定方法同1.2.1（3），將確定的單核體轉接到新的PDA平板上培養(yǎng)，備用。

（2）孢子單核體交配型常規(guī)鑒定。采用三輪雜交法、按照常規(guī)交配型分析程序進行單核體交配型鑒定[12]。首先使用原生質體單核化確定的標準測交菌株T1（A1B1）、T2（A2B2）分別和單孢分離得到的所有單核體配對，與T1發(fā)生親和反應（鎖狀聯(lián)合）的孢子單核體交配型為A2B2;與T2發(fā)生親和反應的孢子單核體交配型為A1B1。再從剩下的與T1、T2都不親和的孢子單核體內隨機取1個作為測交菌株T3，其交配型為A1B2或A2B1。用T3和與T1、T2均不親和的所有孢子單核體進行配對，鏡檢發(fā)生親和反應的孢子單核體為T4，交配型為A2B1或A1B2，不親和的則為T3。

1.2.3? 核遷移試驗? 核遷移試驗來幫助準確鑒定交配型，參考程莉等[13]的方法，具體操作步驟如下：在T1、T2、T3和T4四種交配型所在的組別，每組取數(shù)個單核體進行核遷移試驗。首先進行T2×T3和T2×T4的第1次配對，配對在90 mm PDA平板上進行，兩接種塊之間相距2 cm，待菌絲交接后，在兩配對塊外側，各取1個菌塊分別與T4、T1和T3、T1單核體進行第2次配對。鏡檢第2次配對是否親和，以此判斷第1次配對組有無發(fā)生核遷移。

1.2.4? 交配型比例及χ2檢驗? 根據(jù)公式χ2 = ∑[（O-E）2/E]（O為每種交配型數(shù)量的實測值，E為該種交配型數(shù)量的理論值）計算χ2值，分析真姬菇孢子單核體4種交配型的分離規(guī)律是否符合孟德爾1∶1∶1∶1分離定律[14]。

2? 結果與分析

2.1? 原生質體單核體分離及交配型鑒定

2.1.1? 原生質體單核體鑒定? 顯微鏡下原生質體單核菌絲沒有鎖狀聯(lián)合，分枝較少，細胞比較狹長;菌落顏色濃白，平滑細直，呈放射狀絲狀脈絡。同一個雙核菌株經(jīng)過原生質體單核化后，不同交配型間的單核體再生能力存在差異[15]。本研究將初次原生質體單核化獲得的單核體進行交配型鑒定，未獲得成功配對，最終在重復原生質體單核化15次，獲取567個原生質體單核體后，才成功得到兩種交配型的單核體。由此可見，經(jīng)過原生質體單核化后，原來處于1∶1平衡狀態(tài)的雙核菌絲體的兩種核在分離過程中出現(xiàn)了偏離，導致原生質體單核體的交配型比例不符合，甚至嚴重偏離1∶1。

2.1.2? 測交菌株T1、T2的確定? 兩原生質體單核體菌株發(fā)生親和反應的鑒定標準為：菌落的菌絲交接處出現(xiàn)扇形生長現(xiàn)象（圖1），并且在顯微鏡下能觀察到大量鎖狀聯(lián)合（圖2）。

獲得的兩種交配型的單核體，把其中一種命名為T1，指定其交配型為A1B1;另一種交配型命名為T2，則其交配型為A2B2，T1、T2即為用于孢子單核體交配型鑒定的標準測交菌株。

2.2? 孢子單核體分離及交配型鑒定

2.2.1? 孢子單核體分離及鑒定? 孢子涂布培養(yǎng)約10 d后開始萌發(fā)，分批挑取單菌落，進行鏡檢，以確定為單核菌株，共獲得94個孢子單核體。

2.2.2? 孢子單核體交配型常規(guī)鑒定? T1、T2標準測交菌株分別與94個孢子單核體進行配對（圖3），與T1親和的有28株，與T2親和的有25株，編號58號既與T1親和，又與T2親和。在與T1、T2均不親和的42株單核菌株里隨機挑取7號作為測交菌株T3，與剩下的41株進行配對，親和的T4有17株，不親和的24株，即T3有25株。

最后將58號和T3、T4分別進行配對，發(fā)現(xiàn)58號和T3、T4均為親和。因此，除了常見的4種交配型外，還發(fā)現(xiàn)1個與這4種交配型都親和的菌株T5（58號），由此可見A位點和B位點之間發(fā)生了重組，重組率為1.1%。

2.3? 核遷移試驗準確分析交配型

隨機選用孢子單核體中編號3（T1）、44（T2）、79（T3）、2（T4）以及 50（T1）、14（T2）、83（T3）、61（T4）進行核遷移試驗。

首先用44×79（T2×T3）、14×61（T2×T4）進行第1次配對，當兩組配對的接種塊菌絲充分交接在一起時，在44×79配對菌塊兩側各取一個菌塊分別與2和3進行第2次配對，在14×61配對菌塊兩側取菌塊分別與83和50進行第2次配對，鏡檢第2次配對結果，過程、結果見圖4。

在四極性交配系統(tǒng)中，A位點基因控制鎖狀聯(lián)合的形成，B位點基因控制核的遷移，兩個單核菌株只有B位點的構成不同時才能發(fā)生核遷移現(xiàn)象[16]。從圖4中可以看出，44×79配對組合的第2次配對沒有形成鎖狀聯(lián)合，說明44和79之間沒有發(fā)生核遷移;14×61配對組合的第2次配對有鎖狀聯(lián)合的形成，說明14和61之間發(fā)生了核遷移。由此可以得出，44（T2，A2B2）和79（T3）的交配型關系為A≠B=;14（T2，A2B2）和61（T4）的交配型關系為A=B≠。綜上可以確定T3、T4的交配型分別為A1B2和A2B1，孢子單核體的4種交配型得到準確鑒定（表1）。

2.4? 交配型比例χ2檢驗

從表2可以看出，減數(shù)分裂后形成的子代孢子中，4種交配型孢子單核體的實際比例與預期的1∶1∶1∶1相符，說明4種交配型的分離規(guī)律符合孟德爾分離定律，證實真姬菇的交配系統(tǒng)是四極性異宗結合。

3? 討論

在四極性擔子菌的交配型鑒定中，兩兩配對法最為可靠。這種方法在樣本容量很小時可實施性較高，但若樣本容量大，該方法的工作量尤其大。例如本實驗中的孢子單核體有94個，如果通過兩兩配對法就需要配對942個，即8836個，而用標準測交菌株法，就大大減少工作量。原生質體單核化的方法確保再生的原生質體沒有發(fā)生重組的可能性，可以準確獲得與親本雙核體交配型相同的標準測交菌株 T1、T2。

本文真姬菇交配型的鑒定結果證明真姬菇為四極性異宗結合菌，有趣的是，除了常規(guī)4種交配型外，還鑒定出一個重組型交配型T5（用ArBr表示）。Papazian認為這種現(xiàn)象是因為A、B兩個交配位點的亞單位（α、β）構成不同[17]。本研究發(fā)現(xiàn)真姬菇的擔子在減數(shù)分裂過程中由于次級重組形成了交配型為ArBr的孢子，其中不但B位點發(fā)生重組，A位點也發(fā)生重組，這種現(xiàn)象極為罕見。由于這種重組型交配型與其他4種交配型的配對都是親和的，因此，通過配對雜交都可形成生物學性狀優(yōu)良的子實體。鑒于這種特殊現(xiàn)象，對此進一步研究，為今后孢子單核體育種提供便利，未來定會分離出更多的次級重組型后代，進而獲得更為詳盡的關于交配型因子的數(shù)據(jù)，建立一個完整的真姬菇交配型構成模型。

在四極性擔子菌交配型常規(guī)鑒定中，第三輪配對中測交菌株T3的選擇是隨機的，其交配型可能是A1B2，也可能是A2B1，沒有明確的形態(tài)差異，難以區(qū)分，需要補充核遷移實驗加以區(qū)分。核遷移的發(fā)生是由B位點基因的特定功能決定，只有B位點不相同的配對，核遷移的現(xiàn)象才會發(fā)生。因此要想驗證兩個不親和單核體間的交配型關系，可以根據(jù)有無核遷移的發(fā)生，即第2次配對有無形成鎖狀聯(lián)合，來判斷二者之間的交配型關系具體是A=B≠，還是A≠B=。值得注意的是，在核遷移試驗中，偶爾會出現(xiàn)第1次配對組合只有一側發(fā)生第2次配對的鎖狀聯(lián)合情況，但目前尚未明確原因，有待進一步研究。

真姬菇交配型的準確鑒定，為今后的育種工作打下了扎實的理論基礎，通過配對雜交產(chǎn)生的雜交菌株，可為下一輪優(yōu)良菌株的篩選提供材料。

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責任編輯：沈德發(fā)