張郎織 李季膚 黃杰 王志勇 陳志堅

摘? 要：鋁毒被認為是酸性土壤上抑制植物根系生長的重要脅迫因素之一。多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運蛋白（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）在根系檸檬酸轉(zhuǎn)運耐鋁毒中起重要作用。以地毯草（Axonopus compressus）為材料，對AcMATE1基因進行克隆、生物信息學(xué)和基因表達分析。結(jié)果表明：鋁處理抑制了地毯草根系的生長，包括總根長、根表面積和根體積。通過PCR克隆到地毯草AcMATE1基因，該基因cDNA全長1602 bp，編碼433個氨基酸殘基。AcMATE1蛋白分子量為45.9 kDa，屬于疏水性蛋白。AcMATE1蛋白包含MatE保守結(jié)構(gòu)域和9個跨膜結(jié)構(gòu)域。亞細胞定位預(yù)測分析結(jié)果表明，AcMATE1定位于細胞膜上。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，金屬鋁（Al）和鎘（Cd）處理顯著增強AcMATE1基因在地毯草根系中的表達，而鑭（La）處理則抑制AcMATE1基因的表達。并且不同鋁濃度和時間處理進一步驗證Al可增強AcMATE1基因在地毯草根中的表達。此外，AcMATE1基因在地毯草根、莖和葉中均有表達，且在0～1 cm根段中的表達量高于其他根段中的表達量。本研究結(jié)果為解析地毯草響應(yīng)鋁毒害的機理提供候選基因資源。

關(guān)鍵詞：地毯草;鋁毒;MATE轉(zhuǎn)運蛋白;根系;基因表達

中圖分類號：Q945.78????? 文獻標識碼：A

Cloning and Expression Analysis of AcMATE1 in Axonopus compressus

ZHANG Langzhi1， LI Jifu1， HUANG Jie1， WANG Zhiyong1*， CHEN Zhijian1，2*

1. College of Forestry， Hainan University / Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Tropical Crop Genetic Resources， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Aluminum （Al） toxicity is one of the serious constraints inhibiting root growth in acid soils. The MATE （Multidrug and toxic compound extrusion） transporter plays important roles in citrate exudation for plant Al detoxification. In this study， cloning， bioinformatic and expression analyses of AcMATE1 were performed in carpetgrass （Axonopus compressus）. Results showed the that root growth of carpetgrass was inhibited by Al toxicity， as reflected by the decreases in total root length， root surface area and root volume. The full length of AcMATE1 was 1602 bp， encoding 433 amino acid residues. AcMATE1， with protein molecular weight of 45.9 kDa， was predicted to be a hydrophobic protein. Furthermore， AcMATE1 contained one conserved MatE domain and nine transmembrane domains. AcMATE1 was found to be localized on the plasma membrane based on subcellular localization prediction. Quantitative real time PCR analysis showed that the expressions of AcMATE1 were enhanced in the roots of carpetgrass under both Al and Cd treatments， whereas the expression of AcMATE1 was inhibited by La treatment. The transcription level of AcMATE1 increased in the roots of carpetgrass by Al treatments of different concentration and duration. Moreover， the transcripts of AcMATE1 could be detected in roots， stems and leaves， and AcMATE1 exhibited the highest expression in the root tip with 0 to 1 cm in length. This study would provide candidate gene resources for the further dissection of carpetgrass adaptation to Al toxicity.

Keywords： Axonopus compressus; aluminum toxicity; MATE transporter; root; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.007

鋁（aluminum，Al）是地殼中分布最廣泛的金屬元素和第3大常見的元素[1]。當土壤pH低于5.0時，鋁離子（Al3+）就會從土壤硅酸鹽或氧化物中釋放出來溶解到土壤溶液中，對植物造成毒害[2]。因此，鋁毒被認為是酸性土壤上限制作物生長的主要因素之一。鋁離子主要通過破壞細胞核結(jié)構(gòu)、擾亂膜電勢和降低細胞壁延展性等方面損害根尖細胞，進而抑制根系生長[3-4]。在長期進化過程中，植物形成了一系列適應(yīng)鋁毒脅迫的機制，如植物根系可通過分泌有機酸、產(chǎn)生粘著液和邊緣細胞以及增加根際pH等減少鋁進入根尖細胞;進入到細胞中的鋁可被有機酸螯合，形成鋁-有機酸復(fù)合物，或被隔離在液泡中，起到緩解鋁毒害的作用[5]。

多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運蛋白（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）屬于次級轉(zhuǎn)運蛋白家族[6]，通常包含12個跨膜結(jié)構(gòu)域（trans-me-mbrane domain，TMD），少數(shù)MATE蛋白含有8～13個TMD[7]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[8]、葡萄（Vitis vinifera）[9]和煙草（Nicotiana tabacum）[10]等不同植物中相繼克隆了MATE轉(zhuǎn)運蛋白基因。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥包含56個MATE轉(zhuǎn)運蛋白，分別在鐵離子（Fe3+）、類黃酮和檸檬酸等次級代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運方面發(fā)揮作用[11]。如擬南芥AtMATE1作為檸檬酸的轉(zhuǎn)運蛋白參與植物的耐鋁過程[12];TaMATE1B在小麥（Triticum aestivum）中具有轉(zhuǎn)運根系檸檬酸緩解鋁毒害的功能[13]。

地毯草（Axonopus compressus）屬于禾本科地毯草屬多年生草本植物，具有植株低矮、易繁殖和成坪性好等優(yōu)點。地毯草是用于公共綠地、運動場和固土護坡的優(yōu)良暖季型草坪草[14]。地毯草起源于美國的墨西哥海灣以及熱帶美洲，在我國，地毯草主要種植于南方熱帶及亞熱帶地區(qū)[15]。有研究[16]對狗牙根（Cynodon dactylon）、鈍葉草（Stenotaohrum secundatum）、假檢草（Eremochloa ophiuroides）、結(jié)縷草（Zoysia japonica）和地毯草等10種暖季型草坪草進行耐鋁性評價分析，發(fā)現(xiàn)鋁脅迫抑制了大部分草坪草的生長，但地毯草表現(xiàn)出較強的耐鋁毒能力。因此，地毯草被認為是挖掘植物適應(yīng)鋁毒脅迫機理的優(yōu)良禾草植物[17-18]。克隆地毯草根系鋁響應(yīng)基因，對深入解析地毯草耐鋁機制具有重要意義。本研究克隆地毯草AcMATE1轉(zhuǎn)運蛋白基因，并對其進行生物信息學(xué)和基因表達分析，為解析地毯草適應(yīng)酸性土壤鋁毒機理提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究所用材料為地毯草品系‘A58[19]，由海南大學(xué)林學(xué)院提供。

1.2? 方法

1.2.1? 材料培養(yǎng)與處理? 參考廖麗等[20]的方法進行地毯草移栽和培養(yǎng)。首先將地毯草匍匐莖移植于1/2 Hoagland營養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)5 d，隨后，選取生長一致的幼苗（根長約5 cm），在水培箱中進行鋁處理。參考廖麗等[20]的方法設(shè)置2個鋁處理濃度，分別為0 mmol/L和2.1 mmol/L AlCl3，每2 d調(diào)節(jié)pH至4.2。每個處理設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)4株苗。鋁處理14 d后收獲地毯草，測定根系參數(shù)。另一方面，選取生長一致的地毯草幼苗（根長約5 cm），參考Yokosho等[21]的方法在0.5 mmol/L CaCl2液體中進行不同金屬處理，包括100 μmol/L AlCl3、40 μmol/L CdCl2和20 μmol/L LaCl3，處理24 h后收獲根系用于基因表達分析;選取生長一致的地毯草幼苗（根長約5 cm），在0.5 mmol/L CaCl2液體中進行0、50、100、200 μmol/L AlCl3處理，處理24 h后收獲根系用于基因表達分析;在100 μmol/L鋁濃度處理下，分別于處理第0、12、24 h收獲根系用于基因表達分析。以上處理液pH均調(diào)節(jié)至4.2，每個處理設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2? 根系參數(shù)測定? 使用掃描儀（EPSON，日本）掃描并保存根系圖像。用根系分析軟件WinRHIZO（Regent，加拿大）分析并統(tǒng)計每株總根長、根表面積和根體積。

1.2.3? 地毯草總RNA提取和cDNA合成? 參照TRIzol（Invitrogen Inc，美國）方法提取鋁處理下地毯草根系總RNA。稱取0.1 g根系樣品，加入1 mL TRIzol提取液，充分搗碎并混勻。加入500 μL氯仿，混勻，靜置5 min后，4 ℃，12 000 r/min離心15 min。吸取上清液，加入等體積的異丙醇，充分混勻，4 ℃，12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃，7500 r/min離心5 min。棄上清，吸出殘留乙醇，風干沉淀。加入30 ?L無RNase dH2O溶解RNA。參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher，美國）方法合成cDNA。在PCR管中加入2 μg RNA、1 μL Oligo（dT）18 primer，并加入Water nuclease-free至12 μL。65 ℃反應(yīng)5 min，冰上冷卻。隨后加入4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL RiboLock RNase Inhibitor、2 μL dTP Mix和1 μL RevertAid M-Mul V Reverse transcriptase，總反應(yīng)體積為20 μL。反應(yīng)物置于42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后獲得cDNA。

1.2.4? 地毯草AcMATE1基因克隆? 基于本課題組前期獲得的地毯草根系鋁響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，篩選獲得AcMATE1基因全長序列。根據(jù)序列設(shè)計上下游基因全長開放閱讀框（ORF）克隆引物（表1）。以cDNA為模板，通過PCR擴增AcMATE1基因全長。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、克隆和測序分析后，獲得AcMATE1基因全長序列。

1.2.5? 生物信息學(xué)分析? 使用EXPASY（https：// web.expasy.org/protparam）分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、運用DNAMAN軟件分析獲得氨基酸序列、使用SignalP 5.0 server軟件預(yù)測信號肽、運用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域、采用WoLF PSORT（https：//www. genscript.com/wolf-psort.html）預(yù)測亞細胞定位、利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）分析保守結(jié)構(gòu)域、采用MEGA 7軟件進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.2.6? 實時熒光定量PCR（qPCR）分析? 用Quant-StiduoTM Real-Time PCR （Thermo Fisher，美國）和SYBR Green（Vazyme，中國）進行qPCR分析。反應(yīng)體系包括10 μL 2×SYBR Green PCR master mix、6.4 μL ddH2O、0.8 μL上游引物、0.8 μL下游引物和2 μL模板。定量PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)?；虮磉_量以AcMATE1基因表達量除以AcEF1a（看家基因）表達量表示。qPCR引物如表1所示。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進行計算和制圖，采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 鋁處理對地毯草根系生長的影響

從圖1A可看出，2.1 mmol/L鋁處理顯著抑制地毯草根系生長，2.1 mmol/L鋁處理下的地毯草根長明顯小于對照（0 mmol/L）根長。2.1 mmol/L鋁處理14 d，地毯草總根長、根表面積和根體積分別只有對照處理下的54.6%、53.3%和52.0%（圖1B～圖1D）。

2.2? AcMATE1基因克隆

以鋁處理下地毯草根系cDNA為模板，PCR擴增出AcMATE1基因的cDNA全長（圖2）。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序分析后，獲得AcMATE1基因全長核苷酸序列1602 bp。利用DNAMAN和EXPASyProt軟件分析獲得AcMATE1基因推導(dǎo)的氨基酸序列（圖3），該基因編碼433個氨基酸殘基，蛋白分子量為45.9 kDa，理論等電點為8.3，為疏水性蛋白。

2.3? 地毯草AcMATE1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

CDD Tools預(yù)測分析結(jié)果表明，AcMATE1屬于MATE亞家族成員，包含MATE轉(zhuǎn)運蛋白的保守序列，即MatE結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域特征序列（圖4）。

2.4? AcMATE1蛋白理化性質(zhì)分析

運用TMHMM Server V2.0軟件進行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)AcMATE1蛋白包含9個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖5）。用SignalP 5.0 server軟件預(yù)測信號肽結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白不具有信號肽，屬于非分泌蛋白。運用WoLF PSORT軟件進行亞細胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細胞膜上，暗示該蛋白為膜蛋白。

2.5? AcMATE1同源蛋白系統(tǒng)進化樹分析

如圖6所示，不同植物MATEs蛋白可被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ共4組。其中，第Ⅰ組包含擬南芥、高粱和水稻等植物的MATE同源蛋白。第Ⅱ組包含擬南芥AtEDS5和AtFRD3、白羽扇豆LaMATE、赤桉EcMATE1和大豆MATE同源蛋白。第Ⅲ組包括煙草NtJAT1、葡萄VvMATE1和擬南芥MATE[22]等同源蛋白。第Ⅳ組包含擬南芥AtTT12、煙草NtMATE1、蒺藜苜蓿和毛果楊MATE同源蛋白。其中，地毯草AcMATE1蛋白被分在第Ⅲ組，與擬南芥AtBCD1和AtADS1等同屬1個分支，同源性最高。

2.6? 不同處理對AcMATE1基因表達的影響

進一步分析了不同金屬元素處理對AcMATE1基因表達的影響，包括100 μmol/L Al、40 μmol/L鎘（Cd）和20 μmol/L鑭（La）。從圖7A可看出，與對照CK處理相比，Al和Cd處理下AcMATE1基因在地毯草根系中的表達均顯著增強，且AcMATE1基因在Al處理下的表達量最高，而La處理則抑制了AcMATE1基因的表達。其中，在Al處理下，AcMATE1基因表達量是CK處理下的9.3倍，差異顯著（P<0.05）。

如圖7B所示，與對照（0 μmol/L Al）相比，隨著鋁處理濃度的增加，AcMATE1基因表達量呈現(xiàn)增加趨勢;在100 μmol/L Al處理下，AcMATE1基因表達量最高，是對照處理下的3.5倍（P< 0.05）。如圖7C所示，在100 μmol/L Al處理下，處理時間為12 h和24 h時，AcMATE1基因表達量顯著增強，分別是0 h鋁處理下的23.1倍和12.2倍（P<0.05）。

2.7? AcMATE1基因組織表達分析

組織表達模式分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖8A），地毯草AcMATE1基因在根、莖和葉中均有表達，其中， AcMATE1基因在葉中的表達量最高，根和莖次之。另外，我們分析了AcMATE1基因在不同根段中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AcMATE1基因在0～1 cm根段中的表達量顯著高于在1～2 cm和3 cm以上根段中的表達量（圖8B）。

3? 討論

鋁毒是限制作物生長和產(chǎn)量的重要因素之一，通過阻礙細胞分裂和伸長而抑制根系生長[23]。不同植物或同一植物不同品種對鋁毒害忍耐能力存在差異。本研究以地毯草為材料，首先分析了鋁處理對地毯草根系生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鋁處理抑制了地毯草的總根長、根表面積和根體積。在其他植物中也發(fā)現(xiàn)鋁處理顯著抑制根系的生長。例如，在擬南芥中，5 μmol/L鋁處理能夠明顯抑制主根長的伸長[24]。在大麥不同基因型中，鋁處理均能抑制根系生長[25]。另外，水稻根系的生長也受到鋁毒害的影響[[21]。雖然鋁處理抑制了不同草坪草的生長，但相對于鈍葉草、結(jié)縷草和假檢草等，地毯草具有較強的耐鋁能力[16]。因此，為更好地探討地毯草適應(yīng)酸性土壤鋁毒害機制，本研究進一步克隆了地毯草AcMATE1基因，并對其進行生物信息學(xué)及基因表達分析。

地毯草AcMATE1蛋白屬于MATE轉(zhuǎn)運蛋白家族成員，具有高度保守的MatE結(jié)構(gòu)域[7]。近年來，已經(jīng)克隆并鑒定出多種植物的MATE蛋白。例如，在擬南芥中，包含有56個AtMATEs[26]，在水稻中，有53個OsMATEs[27]，而蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和大豆（Glycine max）中分別包含有70和117個MATEs[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，地毯草AcMATE1蛋白具有MatE保守結(jié)構(gòu)域，且含有9個TMD（圖5）。植物MATE蛋白主要定位于質(zhì)膜或液泡膜上，這對其行使生物學(xué)功能至關(guān)重要[26]。亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，地毯草AcMATE1定位于質(zhì)膜上，屬于膜蛋白。以上結(jié)果表明，AcMATE1具備植物MATE蛋白的典型特征。

植物MATE蛋白在激素信號轉(zhuǎn)遞和金屬離子轉(zhuǎn)運中起重要作用。例如，擬南芥AtADS1是一類MATE轉(zhuǎn)運蛋白，超量表達AtADS1能降低擬南芥水楊酸水平，進而影響了擬南芥的抗病能力[29]。擬南芥高爾基體定位的MATE蛋白（AtBCD1），具有通過調(diào)節(jié)鐵的分配來維持脅迫條件下細胞內(nèi)鐵平衡的生物學(xué)功能[30]。在本研究中，地毯草AcMATE1蛋白與擬南芥AtBCD1和AtADS1具有較高的同源性，暗示了地毯草AcMATE1蛋白可能通過調(diào)控植物激素和金屬離子轉(zhuǎn)運響應(yīng)鋁毒脅迫。此外，植物MATE蛋白在檸檬酸轉(zhuǎn)運中也具有重要作用。例如，赤小豆VuMATE1蛋白定位于質(zhì)膜上，其被報道具有調(diào)控根尖分泌檸檬酸的生物學(xué)功能[31];水稻OsFRDL1具有轉(zhuǎn)運檸檬酸的功能，同時也調(diào)控了鐵在水稻谷粒中的分配[32]。

本研究進一步發(fā)現(xiàn)鋁處理顯著增強了AcMATE1基因在地毯草根系中的表達，且AcMATE1基因在0～1 cm根段中表達量最高。ZmMATE1基因具有轉(zhuǎn)運檸檬酸的功能，鋁處理誘導(dǎo)了ZmMATE1在玉米根中的表達，且ZmMATE1基因在耐鋁玉米基因型中的表達量高于鋁敏感基因型[33]。此外，鋁處理也增強了BoMATE在甘藍根中的表達，超量表達BoMATE能促進轉(zhuǎn)基因擬南芥根系分泌檸檬酸，從而增強擬南芥的耐鋁能力[34]。研究發(fā)現(xiàn)，鋁處理增強了OsFRDL4基因在水稻根尖中的表達，且OsFRDL4基因表達與水稻耐鋁能力呈正相關(guān)關(guān)系;敲除OsFRDL4基因顯著降低了水稻根系檸檬酸的分泌量，并降低了水稻的耐鋁能力，表明OsFRDL4是水稻耐鋁毒的重要基因[21]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)AcMATE1基因在地毯草葉中的表達量高于根部，暗示其可能主要在葉部中發(fā)揮功能，而鋁處理增強了AcMATE1基因在地毯草根中的表達，暗示了該基因也能夠響應(yīng)鋁毒害，其部分功能可能參與了地毯草根系響應(yīng)鋁毒害的過程，但其具體的生物學(xué)功能仍需要做進一步研究。本研究為探討地毯草耐鋁毒機理提供了候選基因資源。

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責任編輯：黃東杰