陳欲，陳笑蕓，彭城，徐俊鋒，沈潔，李玥瑩，汪小福

技術(shù)與方法

轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5熒光RPA現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)方法的建立

陳欲1,2，陳笑蕓1，彭城1，徐俊鋒1，沈潔3，李玥瑩2，汪小福1

1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310021 2. 沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004

轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5具有良好的抗蟲性和除草劑耐受性，是我國(guó)第一批獲得安全證書的轉(zhuǎn)基因玉米之一，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究利用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification, RPA)建立轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法。針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的轉(zhuǎn)化體特異性序列片段，設(shè)計(jì)引物和探針，通過引物篩選實(shí)驗(yàn)得到最佳引物與探針組合。熒光RPA擴(kuò)增結(jié)果可以在藍(lán)光下直接進(jìn)行可視化分析。結(jié)果表明，建立的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5可視化檢測(cè)體系特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到10拷貝。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RPA的擴(kuò)增體系對(duì)溫度有很強(qiáng)的適應(yīng)性，樣品在34℃～46℃之間都能得到擴(kuò)增，據(jù)此，本研究利用市面上常見的自發(fā)熱暖貼代替常規(guī)的加熱儀器來激發(fā)RPA。結(jié)果表明，自發(fā)熱暖貼滿足RPA擴(kuò)增體系對(duì)溫度的需要。最終，本研究將自發(fā)熱暖貼加熱法與RPA可視化檢測(cè)體系結(jié)合，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，并與qPCR方法檢測(cè)結(jié)果作比較，檢測(cè)結(jié)果表明，本研究建立的現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)方法與qPCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，并且可視化檢測(cè)方法時(shí)間短，檢測(cè)結(jié)果清晰易分辨。本研究建立的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5現(xiàn)場(chǎng)快速可視化檢測(cè)方法，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便、快捷，不僅滿足了轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要，也為其他現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法的開發(fā)提供了新思路。

轉(zhuǎn)基因玉米；RPA；可視化檢測(cè)；現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)

玉米是全球三大糧食作物之一[1]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的耐旱、耐寒、耐貧瘠性，是用途最為廣泛的糧食作物[2]，對(duì)糧食安全和保障農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要作用[3]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和滿足糧食安全保障的需要，自1990年起，世界各國(guó)開始廣泛種植轉(zhuǎn)基因作物[4]。轉(zhuǎn)基因玉米是全球種植面積第二大的轉(zhuǎn)基因作物，2019年種植面積達(dá)到了6090萬公頃，占全球玉米種植面積的31%。轉(zhuǎn)基因玉米的種植為糧食安全、環(huán)境保護(hù)等方面起到了積極的作用。

我國(guó)對(duì)于糧食的需求隨著人口的增長(zhǎng)而遞增，玉米作為我國(guó)主要的糧食作物和加工原料，其市場(chǎng)需求更大[5]。自2010年以來，我國(guó)轉(zhuǎn)變?yōu)橛衩變暨M(jìn)口國(guó)，目前我國(guó)批準(zhǔn)進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體有20多種，為保證我國(guó)的糧食安全，國(guó)內(nèi)也在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因玉米的研發(fā)。2019年12月我國(guó)自主研發(fā)的兩個(gè)玉米轉(zhuǎn)化體首次獲得安全證書[6]，其中轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5是由浙江大學(xué)研發(fā)，擁有我國(guó)自主產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因玉米品系。該品系中導(dǎo)入了兩個(gè)基因表達(dá)框，分別是pUbi-Cry1Ab/Cry2Aj-T(PEPC)和p(35S/Ubi)- EPSPS-T(35S)，融合基因由玉米泛素啟動(dòng)子和PEPC終止子調(diào)控，而(5-enolpyruvylshikimate- 3-phosphate synthase gene)基因由CaMV35S和玉米泛素啟動(dòng)子組成的復(fù)合啟動(dòng)子及35S終止子調(diào)控。由于基因具有除草劑耐受性，可以作為篩選標(biāo)記基因，后期可以用草甘膦進(jìn)行陽(yáng)性植株的篩選。該轉(zhuǎn)基因玉米表現(xiàn)出良好的抗蟲性和除草劑耐受性，具有廣闊的應(yīng)用前景[3,6]，今后可能會(huì)商業(yè)化大范圍種植。為了對(duì)其進(jìn)行更好的監(jiān)控和管理，迫切需要建立現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法。

目前轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)主要有基于蛋白質(zhì)和基于核酸兩種方法?；诘鞍踪|(zhì)的檢測(cè)方法多需要制備抗體，其周期長(zhǎng)、成本高，而且只能檢測(cè)外源蛋白，檢測(cè)靶標(biāo)有限；另一方面，基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，只能檢測(cè)作物的新鮮樣品或初加工樣品，對(duì)于加工品或深加工品的檢測(cè)存在局限性。而基于核酸的檢測(cè)方法更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定，應(yīng)用范圍也更加廣泛[7]。在諸多核酸檢測(cè)方法中，PCR技術(shù)(如普通PCR、qPCR)等是目前國(guó)內(nèi)外已開發(fā)的數(shù)量最多的一類轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)[8]，被許多國(guó)家作為有關(guān)食品法規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[9]。但PCR檢測(cè)法依賴于精密儀器，且耗時(shí)長(zhǎng)，限制了其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的使用[10]。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification, RPA)是一種新型恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[11]，利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶在恒溫條件下可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的快速、特異性擴(kuò)增，短時(shí)間(5～ 20 min)內(nèi)即可完成核酸的擴(kuò)增[12]。擴(kuò)增條件一般為恒溫39℃，不需要大型儀器，而且RPA對(duì)模板的純度要求不高，適合不同樣品的擴(kuò)增檢測(cè)。本研究結(jié)合RPA的這些特性，首先篩選出針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)的RPA引物對(duì)與探針組合，并利用藍(lán)光燈照射直接判斷其擴(kuò)增結(jié)果，再結(jié)合RPA對(duì)擴(kuò)增溫度的耐受性，利用自發(fā)熱暖貼代替儀器加熱，從而建立一種針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的現(xiàn)場(chǎng)快速可視化檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5種子，轉(zhuǎn)基因玉米NK603、BT176、T25和BT11，轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127、356043、GTS40-3-2和FG72，轉(zhuǎn)基因油菜MS1×RF1、MS2× RF2、MS8×RF3和OXY235，轉(zhuǎn)基因棉花LLcotton25、MON15985和GHB119的DNA均來自本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 DNA提取

按照植物DNA提取試劑盒(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)說明書提取各樣品的基因組DNA，所提取的DNA用核酸蛋白測(cè)定儀NanoDrop2000C (美國(guó)Thermo公司)進(jìn)行核酸質(zhì)量分析，并置于–20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 熒光RPA

參照RPA (熒光型)試劑盒(濰坊安普未來生物科技有限公司)說明書進(jìn)行體系配置，熒光RPA反應(yīng)體系為50 μL：Buffer A 12.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各2 μL，10 μmol/L探針0.6 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O補(bǔ)齊到47.5 μL，充分混勻后加入Buffer B 2.5 μL，再次混勻。熒光RPA反應(yīng)條件：39℃擴(kuò)增20 min。熒光RPA的實(shí)時(shí)熒光信號(hào)用熒光定量PCR儀CFX96 (美國(guó)伯樂公司)觀察，熒光RPA的可視化結(jié)果用手持藍(lán)光燈(LUYOR-3415RG，路陽(yáng)儀器)照射并在黃色濾鏡下拍照觀察。

1.4 引物與探針設(shè)計(jì)

熒光RPA體系包括2條引物和1條探針，轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的載體示意圖及擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化體特異性序列信息見圖1A。利用Vector NTI軟件在外源插入位點(diǎn)的左側(cè)即轉(zhuǎn)基因玉米基因組序列設(shè)計(jì)上游引物8條，在外源插入位點(diǎn)的右側(cè)即外源插入片段序列設(shè)計(jì)下游引物8條。所設(shè)計(jì)的上、下游引物分別處于外源插入位點(diǎn)的兩側(cè)，以保證對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的特異性擴(kuò)增。引物長(zhǎng)度30～35 bp，GC含量占30%～70%[13]。所設(shè)計(jì)探針包含玉米基因組和外源片段的序列，長(zhǎng)度46～52 bp，并避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)重復(fù)堿基。探針共有4個(gè)修飾位點(diǎn)，在探針中間部位，用一個(gè)四氫呋喃(THF)堿基類似物代替第31個(gè)堿基G，作為核酸外切酶的識(shí)別位點(diǎn)；在THF位點(diǎn)的上游，第30個(gè)堿基T處標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)6-羧基熒光素(FAM:6-carboxy- fluorescein)，在THF位點(diǎn)的下游，第33個(gè)堿基T處標(biāo)記一個(gè)黑洞淬滅基團(tuán)(BHQ:black hole quencher)，兩基團(tuán)的間距為1～5 bp；THF位點(diǎn)距離3?末端至少15 bp長(zhǎng)度，并在探針3?末端標(biāo)記一個(gè)封閉基團(tuán)。只有當(dāng)探針與序列成功配對(duì)時(shí)，THF位點(diǎn)才會(huì)被外切酶切割，使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)(圖1B)。

圖1 熒光RPA引物和探針的設(shè)計(jì)與篩選

A：轉(zhuǎn)基因玉米12-5載體示意圖及擴(kuò)增的特異性序列。黑色字母為玉米基因組序列；紅色字母為外源插入片段序列；帶箭頭的橫線為引物F1、F4以及R5所在位置；黑色框內(nèi)為探針?biāo)谖恢?。B：探針設(shè)計(jì)原理與可視化檢測(cè)示意圖。C：引物篩查擴(kuò)增結(jié)果。左圖為上游引物F1與所有下游引物擴(kuò)增結(jié)果，右圖為下游引物R5與所有上游引物擴(kuò)增結(jié)果。RFU：相對(duì)熒光強(qiáng)度。

轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的普通PCR引物和qPCR引物引用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[14]，本研究所用的引物和探針配制為10 μmol/L。所有引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物和探針信息見表1。

1.5 引物篩查

用上游引物F1分別與所有下游引物組合，結(jié)合探針，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果，選出其中擴(kuò)增效率最高的下游引物，再用這條下游引物分別與所有上游引物組合，結(jié)合探針，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，選擇擴(kuò)增效率最高的一組，作為最終的檢測(cè)引物組合。

1.6 普通PCR與qPCR

普通PCR體系25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 0.2 mmol/L，上、下游引物各0.2 μmol/L，r酶0.025 U/μL。使用德國(guó)Biometra公司TgradientPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。普通PCR擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存。配制2%的瓊脂糖凝膠，GelRed染色，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像儀上觀察與拍照。凝膠電泳系統(tǒng)為美國(guó)GE公司的EPS301；紫外凝膠成像分析儀購(gòu)自美國(guó)伯樂公司。

表1 本文所用引物與探針序列

qPCR體系25 μL：2×qPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.4 μmol/L，探針0.2 μmol/L。qPCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，58℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR儀為美國(guó)伯樂公司的CFX96，反應(yīng)結(jié)束使用Bio-Rad CFX Manager 3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 熒光RPA特異性實(shí)驗(yàn)

用篩選出的最佳引物對(duì)，根據(jù)上述熒光RPA擴(kuò)增體系，以轉(zhuǎn)基因玉米12-5 DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以轉(zhuǎn)基因玉米NK603、BT176、T25、BT11，轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127、356043、GTS40-3-2、FG72，轉(zhuǎn)基因油菜MS1×RF1、MS2×RF2、MS8×RF3、OXY235以及轉(zhuǎn)基因棉花LLcotton25、MON15985、GHB119樣品DNA作為其他作物模板進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)所建立的熒光RPA檢測(cè)方法的特異性。

1.8 靈敏度實(shí)驗(yàn)

核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定所提取轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的DNA濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，并稀釋提取的DNA至640拷貝/μL，再2倍系列稀釋，分別得到320、160、80、40、20、10、5拷貝/μL共7個(gè)濃度。以上述8個(gè)濃度DNA為模板，以無菌水作為陰性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)，同時(shí)可視化觀察結(jié)果，并用qPCR檢測(cè)法和普通PCR檢測(cè)法對(duì)上述8個(gè)濃度轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的DNA進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估比較所建立熒光RPA方法的靈敏度。

1.9 熒光RPA溫度適應(yīng)性及暖貼加熱法可行性分析

為探究熒光RPA可視化檢測(cè)法的溫度適應(yīng)性范圍，本研究共設(shè)12個(gè)擴(kuò)增溫度，分別是26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃和48℃。根據(jù)上述熒光RPA擴(kuò)增體系，進(jìn)行熒光RPA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增結(jié)束后可視化觀察分析結(jié)果。為優(yōu)化熒光RPA現(xiàn)場(chǎng)擴(kuò)增方式，本研究嘗試用市面上一種可以自發(fā)熱的暖貼對(duì)樣品進(jìn)行加熱，對(duì)暖貼自發(fā)熱后50 min內(nèi)的溫度進(jìn)行測(cè)定，分析溫度隨時(shí)間的變化情況，初步判定該嘗試是否可行；并使用暖貼加熱法和加熱塊39℃加熱法分別對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5和非轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行熒光RPA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，可視化觀察結(jié)果并使用多標(biāo)記微孔板系統(tǒng)Cytation5 (美國(guó)伯騰公司)測(cè)定熒光值大小，進(jìn)一步評(píng)價(jià)暖貼加熱法的可行性。

1.10 實(shí)際檢測(cè)

為實(shí)現(xiàn)高通量的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，本研究嘗試用96孔板完成現(xiàn)場(chǎng)可視化擴(kuò)增和檢測(cè)。用上述建立的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5可視化熒光RPA檢測(cè)體系，結(jié)合暖貼加熱法，對(duì)96個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)使用qPCR檢測(cè)法對(duì)上述96個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)。通過分析和對(duì)比兩種檢測(cè)方法所得結(jié)果，判斷本研究建立的轉(zhuǎn)基因玉米12-5熒光RPA現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法是否可行。本研究模擬實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，對(duì)96個(gè)樣品只進(jìn)行了一次檢測(cè)，其他實(shí)驗(yàn)如沒有特別說明，都是3次重復(fù)，每次3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光RPA引物篩選結(jié)果

引物篩選過程見圖1C。圖1C中左圖為上游引物F1與所有下游引物組合結(jié)合探針，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA擴(kuò)增的結(jié)果，可以看到上游引物F1與下游引物R5組合擴(kuò)增效率最高，10 min開始出現(xiàn)熒光信號(hào)，熒光信號(hào)曲線起峰時(shí)間最早，且最終熒光值達(dá)到最高，為1200左右，其他引物組合最終達(dá)到熒光值最高僅800，說明下游引物中，R5的擴(kuò)增能力最強(qiáng)。圖1C中右圖為下游引物R5與所有上游引物組合結(jié)合探針，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)的結(jié)果，可以看到下游引物R5與上游引物F4組合的擴(kuò)增效率最高，5 min開始起峰，且最終熒光值最高，為1200左右，而其他引物組合最早8 min開始起峰，最終達(dá)到熒光值也未超過1000，說明上游引物中，F(xiàn)4的擴(kuò)增能力最強(qiáng)。最終選定上游引物F4與下游引物R5組合，作為最終建立熒光RPA檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的引物。

2.2 熒光RPA特異性檢驗(yàn)

實(shí)時(shí)熒光RPA特異性檢測(cè)結(jié)果見圖2A，僅樣品為轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他樣品均無擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，表明轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法特異性良好?？梢暬^察熒光RPA擴(kuò)增結(jié)果見圖2B，可以明顯看到僅轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5樣品所在離心管有綠色熒光，明亮且可辨識(shí)度強(qiáng)。其他管內(nèi)均未見綠色熒光，可視化觀察的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5可視化熒光RPA檢測(cè)方法特異性良好。

圖2 熒光RPA特異性檢測(cè)

A：實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)。RFU：相對(duì)熒光強(qiáng)度。B：可視化熒光RPA檢測(cè)。1：轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5；2～16：轉(zhuǎn)基因玉米NK603、BT176、T25、BT11，轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127、356043、GTS40-3-2、FG72，轉(zhuǎn)基因油菜MS1×RF1、MS2×RF2、MS8×RF3、OXY235，轉(zhuǎn)基因棉花LLcotton25、MON15985、GHB119。

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

靈敏度檢測(cè)結(jié)果見圖3。實(shí)時(shí)熒光RPA靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3A，結(jié)果顯示隨模板拷貝數(shù)降低，擴(kuò)增曲線的起峰時(shí)間逐漸推遲，達(dá)到的最終熒光強(qiáng)度隨之減弱，模板為1280拷貝數(shù)時(shí)，5 min開始出現(xiàn)擴(kuò)增，最終熒光信號(hào)達(dá)2000。模板為10拷貝數(shù)時(shí)，13 min開始出現(xiàn)擴(kuò)增，雖然最終產(chǎn)生的熒光信號(hào)較弱，但可以與陰性對(duì)照區(qū)分開。熒光RPA靈敏度實(shí)驗(yàn)的可視化檢測(cè)觀察結(jié)果見圖3B：1～4號(hào)管拷貝數(shù)依次為1280、640、320、160，管內(nèi)樣品熒光強(qiáng)度用肉眼觀察相差無幾；5～8號(hào)管拷貝數(shù)依次為80、40、20、10，可以觀察到綠色熒光逐漸減弱；10拷貝數(shù)模板擴(kuò)增結(jié)果，熒光最弱，但是肉眼觀察其結(jié)果可以與陰性對(duì)照區(qū)分開，與實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)結(jié)果一致，說明拷貝數(shù)為10時(shí)，熒光RPA檢測(cè)技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測(cè)得到結(jié)果。qPCR靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3C，隨拷貝數(shù)降低，擴(kuò)增曲線起峰循環(huán)數(shù)逐漸增加，除1280拷貝數(shù)的模板外，最終達(dá)到熒光信號(hào)強(qiáng)度依次減弱，1280拷貝數(shù)的熒光信號(hào)強(qiáng)度與20拷貝數(shù)的熒光信號(hào)強(qiáng)度相差不多，可能是因?yàn)楦邼舛饶０鍍?nèi)的雜質(zhì)或者鹽離子對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生影響。圖3D為普通PCR的靈敏度實(shí)驗(yàn)，隨著模板拷貝數(shù)降低，條帶亮度逐漸減弱。

2.4 溫度適應(yīng)性及暖貼加熱法可行性分析

暖貼激發(fā)RPA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。在12個(gè)溫度下進(jìn)行熒光RPA擴(kuò)增可視化觀察，結(jié)果顯示在34℃～46℃范圍內(nèi)均可觀察到熒光，說明可用于可視化熒光RPA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的溫度范圍廣，為34℃～46℃。溫度為42℃時(shí)，熒光最亮，說明42℃為本可視化熒光RPA檢測(cè)法的最適溫度。暖貼自發(fā)熱后50 min內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行加熱，對(duì)樣品的溫度進(jìn)行測(cè)定(圖4B)。結(jié)果可以看到0～18 min，樣品溫度從室溫24℃逐漸升高到40℃。隨后的18～50 min，樣品溫度保持40℃幾乎不變。樣品溫度從第10 min達(dá)到35℃，開始滿足熒光RPA擴(kuò)增的溫度條件，說明本研究嘗試暖貼加熱方式實(shí)現(xiàn)可視化熒光RPA現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法或許可行。另外建議提前10 min撕開暖貼包裝用于加熱樣品，保證擴(kuò)增順利。測(cè)定樣品溫度方式見圖4B。

用暖貼加熱法和加熱塊39℃加熱法分別激發(fā)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5和非轉(zhuǎn)基因玉米的熒光RPA，其可視化觀察的結(jié)果見圖4C。兩種加熱方式均使樣品得到擴(kuò)增，產(chǎn)生明顯熒光，且熒光強(qiáng)度無明顯差異，易與陰性結(jié)果區(qū)分。使用多標(biāo)記微孔板系統(tǒng)測(cè)定暖貼加熱法和加熱塊39℃加熱的發(fā)應(yīng)管中的熒光值的結(jié)果見圖4D?？梢园l(fā)現(xiàn)除4號(hào)管兩種加熱方法得到熒光值結(jié)果基本相同以外，2、6、8號(hào)管由暖貼加熱得到的熒光值明顯高于加熱塊39℃加熱得到的熒光值，這或許因?yàn)榕N加熱溫度約為40℃，相較于加熱塊的39℃更接近最適溫度42℃，進(jìn)一步說明用暖貼替代傳統(tǒng)加熱塊實(shí)現(xiàn)便攜式的現(xiàn)場(chǎng)熒光RPA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)可行。

圖3 轉(zhuǎn)基因作物靈敏度檢測(cè)

A：實(shí)時(shí)熒光RPA；B：可視化熒光RPA；C：qPCR；D：普通PCR。M：Marker；N：陰性對(duì)照；1～8：分別是1280、640、320、160、80、40、20、10拷貝。RFU：相對(duì)熒光強(qiáng)度。

圖4 熒光RPA溫度適應(yīng)性及暖貼加熱法可行性實(shí)驗(yàn)

A：可視化熒光RPA溫度適應(yīng)性結(jié)果。B：暖貼加熱8連管50 min內(nèi)管中樣品溫度變化情況。C：兩種加熱方法擴(kuò)增熒光RPA產(chǎn)物可視化觀察結(jié)果。a：加熱塊39℃加熱20 min；b：暖貼加熱20 min；1、3、5、7為陰性對(duì)照；2、4、6、8為轉(zhuǎn)基因玉米12-5。D：兩種加熱方法擴(kuò)增熒光RPA產(chǎn)物熒光值測(cè)定結(jié)果。

2.5 實(shí)際檢測(cè)

用兩片暖貼加熱96孔板內(nèi)樣品進(jìn)行熒光RPA擴(kuò)增示意圖見圖5A，用兩片暖貼分別附在96孔板上、下兩面，簡(jiǎn)單方便。圖5B為用所建立的熒光RPA體系實(shí)際檢測(cè)96個(gè)樣品可視化觀察結(jié)果，共觀察到24個(gè)樣品有熒光產(chǎn)生，且熒光十分明顯。qPCR法檢測(cè)上述96個(gè)樣品結(jié)果見圖5C，共有24條擴(kuò)增曲線產(chǎn)生。qPCR法檢測(cè)結(jié)果與熒光RPA可視化檢測(cè)結(jié)果相同，說明本研究建立的熒光RPA可視化檢測(cè)準(zhǔn)確。熒光RPA與qPCR檢測(cè)結(jié)果和檢測(cè)所用時(shí)間的比較見表2 (表中只顯示轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5樣品的陽(yáng)性結(jié)果比對(duì))，熒光RPA可視化檢測(cè)所用時(shí)間均為20 min，qPCR的值在26.82～29.76之間，忽略PCR儀器升降溫時(shí)間，qPCR檢測(cè)時(shí)間范圍為58.64～64.54 min，耗時(shí)遠(yuǎn)高于熒光RPA。實(shí)際檢測(cè)結(jié)果表明，所建立的可視化熒光RPA檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確、易分辨。

3 討論

近年來，RPA技術(shù)得到迅速的發(fā)展，與傳統(tǒng)PCR相比，RPA技術(shù)無需昂貴的PCR儀，可以短時(shí)間內(nèi)對(duì)靶片段進(jìn)行快速擴(kuò)增，具有簡(jiǎn)便、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，目前已在病毒[15,16]、細(xì)菌[17]等臨床檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。

引物是影響擴(kuò)增效率的關(guān)鍵因素，引物過長(zhǎng)可能容易產(chǎn)生引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而過短會(huì)降低重組率和檢測(cè)靈敏度。RPA引物一般在30～35 bp[13]，目前沒有專門針對(duì)RPA的引物設(shè)計(jì)軟件，為了獲得更加高效的引物組合，本研究根據(jù)RPA引物設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)上、下游引物各8條，先用任意一條上游引物與所有下游引物組合結(jié)合探針，對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，觀察結(jié)果篩選出擴(kuò)增效率最高的下游引物，再用篩選出的下游引物與所有上游引物組合結(jié)合探針，對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，觀察篩選出擴(kuò)增效率最高的上游引物。采取這種方法，僅兩次就可以篩選出其中擴(kuò)增效率最高的引物對(duì)。

圖5 實(shí)際檢測(cè)結(jié)果

A：暖貼加熱96孔板方式；B：熒光RPA實(shí)際檢測(cè)可視化觀察結(jié)果；C：qPCR檢測(cè)結(jié)果。RFU：相對(duì)熒光強(qiáng)度。

目前根據(jù)RPA建立的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法多是基于RPA與側(cè)向流動(dòng)免疫技術(shù)結(jié)合或與熒光檢測(cè)技術(shù)結(jié)合的檢測(cè)方法。其中RPA與側(cè)向流動(dòng)免疫技術(shù)結(jié)合的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、肉眼可觀察結(jié)果、無需特殊檢測(cè)設(shè)備，但檢測(cè)時(shí)需要開蓋，存在氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)，且相應(yīng)標(biāo)記抗體試紙條的制備，也增加了檢測(cè)成本?；赗PA與熒光檢測(cè)技術(shù)結(jié)合的檢測(cè)方法，多為實(shí)時(shí)熒光RPA，近年來許多商用便攜式實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)設(shè)備問世，為實(shí)時(shí)熒光RPA現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)的推廣提供了設(shè)備支持，但同時(shí)也增加了檢測(cè)的成本投入。本研究通過RPA在不同溫度下的擴(kuò)增反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)RPA的熒光可視化檢測(cè)具有很寬的溫度適應(yīng)性(34℃～46℃)。據(jù)此，本研究利用市場(chǎng)上很普通的暖貼作為熱源替代儀器加熱，暖貼成本可忽略不計(jì)，而且其便于保存，方便攜帶。在檢測(cè)結(jié)果判別方面，檢測(cè)人員利用小型手持藍(lán)光燈，佩戴護(hù)目鏡即可完成現(xiàn)場(chǎng)的可視化檢測(cè)。目前，蛋白質(zhì)試紙條是轉(zhuǎn)基因成分現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)最常用的方法，蛋白質(zhì)試紙條市場(chǎng)價(jià)格大概在10～20元/條，而RPA目前一個(gè)反應(yīng)的費(fèi)用大概在15～30元。但隨著RPA技術(shù)的推廣和應(yīng)用，其檢測(cè)費(fèi)用會(huì)得到進(jìn)一步的減少。

表2 熒光RPA和RT-PCR對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)

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Establishment of a field visual detection method for genetically modified maize ‘Shuangkang’12-5 by fluorescence RPA

Yu Chen1,2, Xiaoyun Chen1, Cheng Peng1, Junfeng Xu1, Jie Shen3,Yueying Li2,Xiaofu Wang1

The genetically modified (GM) maize ‘Shuangkang’12-5 has good insect resistance and herbicide tolerance, which is one of the first series of GM maizes obtained a safety certificate in China, and it has broad application prospect in the future. This study established an on-site rapid detection method for GM ‘Shuangkang’12-5 based on recombinase polymerase amplification (RPA) technology, which primes and probe were designed according to the specific flank sequence. Then the best combination of primers and probe was obtained through a screeing process. The amplification results of fluorescence RPA can be directly visualized under blue light. The results showed that the visual detection system of GM ‘Shuangkang’12-5 with high specificity, and the detection sensitivity of the method could reached 10 copies. Further research found that the RPA amplification system had a wide range of temperature (34℃-46℃). According to this property, the common self-heating warm pastes on the market were used replace the traditional heating instruments to stimulate the RPA.The results showed that the self-heating warm paste meets the temperature requirement of the RPA system. Finally, we combined the self-heating warm pastes with the RPA visual detection system to conduct on-site detection of GM ‘Shuangkang’12-5, and compared the results with the detection results of qPCR. The detection showed that the results of on-site visual detection method established in this study were consistent with the detection results of the qPCR. Moreover, the visual detection method was more shorter in time and the final detection result was clear and easy to distinguish. The rapid on-site visual detection method for GM ‘Shuangkang’ 12-5 established in this study has high specificity, high sensitivity and convenience. It not only meets the needs of on-site rapid detection of GM ‘Shuangkang’12-5, but also provides highlight for the development of other on-site rapid detection methods.

genetically modified maize; RPA; visual detection; field detection

2021-03-24;

2021-07-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31772098)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 31772098)]

陳欲，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：植物基因工程。E-mail: yuchen_115@126.com

汪小福，博士，副研究員，研究方向：轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)與檢測(cè)。E-mail: yywxf1981@163.com

李玥瑩，博士，教授，研究方向：植物基因工程。E-mail: yueyinglicn@163.com

10.16288/j.yczz.21-110

2021/7/29 16:46:14

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210729.1345.003.html

(責(zé)任編委: 宋任濤)