吳天珍，孫利平，張慶霞，竇宗信，李冠男，高 峰

(甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

黃花菜(Hemerocallis Citrina Baroni)又稱金針菜，屬百合科萱草屬，為多年生宿根植物，食用部分為花蕾，是我國(guó)的特色蔬菜[1]。甘肅慶陽(yáng)是久負(fù)盛名的黃花菜之鄉(xiāng)。2006年12月22日原國(guó)家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)對(duì)“慶陽(yáng)黃花菜”實(shí)施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。2019年慶陽(yáng)黃花菜面積達(dá)到4.67萬hm2以上，黃花菜產(chǎn)業(yè)也逐步成為當(dāng)?shù)厝罕娒撠毐夹】档摹敖鹕a(chǎn)業(yè)”。黃花菜集營(yíng)養(yǎng)、藥療、觀賞于一體，尤其是其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他蔬菜[2]。黃花菜蛋白量高、熱值低、富含維生素及礦物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)的主要化學(xué)成分有生物堿、黃酮類、維生素、類胡蘿卜素、揮發(fā)油、靴質(zhì)以及無機(jī)礦物如鈣、磷、鈉、鉀、錳、銘、鋇和鋁等，其所含的類胡蘿卜深度比拘祀子大三倍，甚至超過西紅柿的幾倍[3]。類胡蘿卜素是一類天然化合物的總稱, 大量存在于植物中，還存在于許多微生物(如光合細(xì)菌)和動(dòng)物體內(nèi)，是生物體必不可少的成分。類胡蘿卜素呈黃色、紅色或橙紅色, 具有食品著色劑和營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑的雙重功效, 因而被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和飼料添加劑中[4]。近年來的醫(yī)學(xué)研究證明, 類胡蘿卜素具增強(qiáng)免疫力、抗氧化和延緩衰老、預(yù)防腫瘤和心腦血管疾病、抗癌癥等功能[5]。因此, 類胡蘿卜素在國(guó)內(nèi)外食品、醫(yī)藥工業(yè)中一直處于供不應(yīng)求的狀態(tài)。目前，類胡蘿卜素的提取方法主要包括：有機(jī)溶劑提取法、層析法、超臨界CO2萃取法和超聲波法等[6]。超聲波能產(chǎn)生并傳遞強(qiáng)大的能量，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶出，具有操作簡(jiǎn)便、能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點(diǎn)[7]。因此，筆者試驗(yàn)利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)超聲波法提取黃花菜中類胡蘿卜素的工藝進(jìn)行了優(yōu)研究，以期為黃花菜中類胡蘿卜素的提取提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)樣品：2020年7月下旬在甘肅省慶陽(yáng)市西峰區(qū)后官寨采集黃花菜花蕾。

試驗(yàn)試劑：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、正己烷和BHT抗氧化劑, 均為分析純。

實(shí)驗(yàn)儀器：PL203型電子天平；TGL-20M湘儀離心機(jī) ；TU-1900雙束紫外可見光分光光度計(jì)北京普析通用儀器； KH3200B型超聲波清洗儀 ；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-91013SA型)

1.2 方法

1.2.1 黃花菜中類胡蘿卜素提取工藝過程 黃花菜鮮樣→蒸餾水浸泡30 min左右(除去糖分及秋水仙堿)→烘箱烘干(50℃)→粉碎(60目)→稱取黃花菜粉末0.25 g→加入含有0.1%BHT的有機(jī)溶劑25 mL→超聲波輔助提取→離心取上清液→定容至50 mL→測(cè)定吸光度值→計(jì)算類胡蘿卜素含量。

1.2.2 黃花菜中類胡蘿卜素測(cè)定條件選擇 利用UV-型紫外可見光分光光度計(jì)，以提取溶劑為空白對(duì)照在波長(zhǎng)350～600 nm下掃描，確定所提黃花菜類胡蘿卜素的最佳吸收波長(zhǎng)。采用不同的有機(jī)提取溶劑及配比：甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、丙酮石油醚(1∶1)、丙酮乙醇(1∶1)，按1.2.1提取工藝確定最佳提取溶劑。

1.2.3 黃花菜中類胡蘿卜素含量計(jì)算 黃花菜中類胡蘿卜素的總含量以Y記，單位 (mg·100g-1)，按以下公式進(jìn)行計(jì)算[8]：

式中：A-在445nm波長(zhǎng)下提取液樣品的吸光值；V-類胡蘿卜素提取液樣品體積(mL)；N-提取液樣品稀釋的倍數(shù)；2500-1%類胡蘿卜素在最大吸收波長(zhǎng)是的平均吸光值；m-類胡蘿卜素提取液樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)分別考察料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲功率對(duì)提取黃花菜類胡蘿卜素含量的影響。

(1)料液比對(duì)提取黃花菜類胡蘿卜素含量的影響。稱取黃花菜粉末0.25 g，按料液比(g:mL)分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25加入含0.1%BHT的丙酮乙醇(1∶1)提取溶劑。設(shè)置超聲時(shí)20 min、超聲溫度45℃、超聲功率200 W,篩選提取類胡蘿卜時(shí)最佳的料液比。

(2)超聲溫度對(duì)提取黃花菜類胡蘿卜素含量的影響。稱取黃花菜粉末0.25 g，加入含有0.01%BHT的丙酮石乙醇(1∶1)有機(jī)提取溶劑10 mL。設(shè)置超聲時(shí)間20 min、超聲功率200 W，考察超聲溫度25、35、45、55、65℃對(duì)提取類胡蘿卜素含量的影響。

(3)超聲時(shí)間對(duì)提取黃花菜類胡蘿卜素含量的影響。稱取黃花菜粉末0.25 g，加入含有0.01%BHT的丙酮乙醇(1∶1)有機(jī)提取溶劑10 mL。超聲溫度設(shè)置為45℃、超聲功率200 W，分析超聲時(shí)間10、20、30、40、50 min對(duì)提取類胡蘿卜素含量的影響。

(4)超聲功率對(duì)提取黃花菜類胡蘿卜素含量的影響。稱取黃花菜粉末0.25 g，加入含有0.01%BHT的丙酮石油醚(1∶1)有機(jī)提取溶劑10ml。超聲溫度設(shè)置為45℃、超聲時(shí)間20 min，分析超聲功率100、150、200、250、300 W對(duì)類胡蘿卜素提取含量的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn) 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，對(duì)料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間和超聲功率進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化黃花菜中類胡蘿卜素提取工藝。正交試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)中的因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素提取條件的篩選

2.1.1 最佳吸收波長(zhǎng)確定 用分光光度測(cè)定類胡蘿卜素含量時(shí)，在定量測(cè)定前，應(yīng)使用紫外-可見光分光光度計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行最佳吸收波長(zhǎng)的掃描測(cè)定，以便后續(xù)測(cè)定的準(zhǔn)確性[9]。在350～600 nm條件下對(duì)黃花菜類胡蘿卜素提取溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，不同有機(jī)提取液的吸收光譜均具有類胡蘿卜素的特征吸收值。由圖1可以看出，以丙酮、石油醚、丙酮石油醚(1∶1)丙酮乙醇(1∶1)的類胡蘿卜素提取液吸收峰基本一致，均集中在440～480 nm波長(zhǎng)下，其中445 nm下波長(zhǎng)較為突出，因此選擇提取液類胡蘿卜素含量測(cè)定的波長(zhǎng)為445 nm。

圖1 類胡蘿卜素提取溶劑在350～600nm下波長(zhǎng)光譜

2.1.2 最佳提取溶劑的確定 不同種類的提取溶劑及提取溶劑間的組合，影響類胡蘿卜素的提取效率。由圖2可知，在提取效果上以丙酮石油醚(1∶1)最好，顯著高于其它提取溶劑；其次為丙酮乙醇(1∶1)和丙酮，在類胡蘿卜素的提取效果上上無顯著差異；再次為甲醇優(yōu)于乙酸乙酯優(yōu)于石油醚；正己烷提取效果較差。由于丙酮石油醚(1∶1)所提取類胡蘿卜素含量最多，因此確定為黃花菜類胡蘿卜素提取溶劑。

圖2 不同有機(jī)溶劑對(duì)類胡蘿卜素提取含量的影響

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比 從圖3可以看出，在低料液比時(shí)，所測(cè)得類胡蘿卜素含量隨料液比的增加而提高。當(dāng)料液比超過(1∶20 g·mL-1)時(shí)類胡蘿卜素的含量增加趨于平穩(wěn)，即此時(shí)材料中的類胡蘿卜素基本被提取出，此后在繼續(xù)增加料液比，所測(cè)類胡蘿卜素含量變化基本不明顯。在考慮高效，低成本的因素下，選取1∶20為最佳料液比。

圖3 不同料液比下類胡蘿卜素提取含量

2.2.2 超聲溫度 由圖4可知，超聲溫度低于35℃時(shí)，提取的類胡蘿卜素含量隨溫度的升高增加明顯，超聲溫度高于55℃之后，隨溫度的升高所測(cè)類胡蘿卜素的含量反而降低。可能是超聲溫度過高導(dǎo)致類胡蘿卜素發(fā)生降解，因此選55℃為超聲提取溫度。

圖4 不同超聲溫度下類胡蘿卜素提取含量

2.2.3 超聲時(shí)間 由圖5可知，所提類胡蘿卜素的含量隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)升高后下降的趨勢(shì)，超聲20min時(shí)類胡蘿卜素的含量為最大，此后隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)所提類胡蘿卜素的含量呈下降趨勢(shì), 超聲時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致類胡蘿卜素的降解速率大于溶出速率，或者有雜質(zhì)溶出,因此選擇超聲時(shí)間為20 min。

圖5 不同超聲時(shí)間下類胡蘿卜素提取含量

2.2.4 超聲功率 由圖6可以看出，超聲功率在100～250 W時(shí)，隨超聲功率的增加類胡蘿卜素的含量增加逐漸增加。在250 W時(shí)所提類胡蘿卜素的含量最高，之后增大超聲功率，反而類胡蘿卜素的含量略有下降?？赡艹暪β蔬^大時(shí)破壞類胡蘿卜素其成份的有效結(jié)構(gòu)，因此選擇250 W為提取最佳功率。

圖6 不同超聲波功率下類胡蘿卜素提取含量

2.3 黃花菜類胡蘿卜素的超聲提取工藝的正交優(yōu)化

表2為正交試驗(yàn)結(jié)果，通過極差分析可知，RB>RA>RC>RD,對(duì)類胡蘿卜素含量的提取因素影響大小，依次為超聲溫度>料液比>超聲時(shí)間>超聲功率。在類胡蘿卜素提取時(shí)超聲溫度的影響最顯著，其中K2最大，表明水平B2效果好；其次是料液比，其K2值最大，表明水平A2效果好；然后是超聲時(shí)間以水平C2效果好；最后是超聲功率以水平D2效果好。由于超聲功率對(duì)類胡蘿卜素含量的提取影響不顯著，因此不用選擇其K值最大的水平。綜上所述最優(yōu)的提取方案為A2B2C2D1，即制備黃花菜粉末中類胡蘿卜的最佳工藝條件為料液1∶20 g·mL-1、超聲溫度55℃、超聲時(shí)間20 min、超聲功率200 W。準(zhǔn)確稱取3份樣品，在最佳工藝條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，測(cè)得其類胡蘿卜素提含量分別為62.25、62.19、62.03 mg·100g-1。由此可見，該方法試驗(yàn)的重現(xiàn)性較好，穩(wěn)定可行。

表2 類胡蘿卜素提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論結(jié)論

(1)目前，對(duì)不同種類和組合的有機(jī)溶劑提取類胡蘿卜素的研究結(jié)果存在差異。鑒于研究材料和方法的不同，研究者所選用的提取溶劑也不盡相同。朱建飛等[10]用丙酮甲醇(2∶1)為提取溶劑提取紫蘇粕中的類胡蘿卜素；郭鵬飛[11]以95%乙醇作為提取溶劑，對(duì)番木瓜果肉進(jìn)行類胡蘿卜素的提??；莫玉楠等[12]以丙酮乙醇(1∶1)為提取溶劑提取橙色大白菜中的類胡蘿卜素；孫明奇[13]以丙酮石油醚(2∶1)為提取溶劑，采用超聲波法提取柑橘果皮中的類胡蘿卜素；王曉璇等[14]選用乙酸乙酯和乙醇(1∶1)為提取溶劑，提取枸杞皮渣中類胡蘿卜素。筆者試驗(yàn)通過選用丙酮、石油醚、甲醇等常用有機(jī)試劑的比較，認(rèn)為黃花菜類胡蘿卜素的最佳提取溶劑為丙酮石油醚(1∶1)。

(2)紫外可見光所顯示的最高峰的位置、吸收光譜的形狀為類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)解析提供了重要信息[9]。筆者試驗(yàn)中不同提取溶劑下黃花菜中類胡卜素的紫外-可見光光譜吸收峰值多在在445 nm、450 nm、475和480 nm處,具有類胡蘿卜素的特征吸收值，而且與文獻(xiàn)中[15,16]葉黃素的吸收峰特征值相一致，說明黃花菜類胡蘿卜素組分中葉黃素的含量很高。但關(guān)于黃花菜中類胡蘿卜素的主要成分測(cè)定和分離純化還有待于進(jìn)一步研究。

(3)筆者試驗(yàn)以黃花菜為材料，利用單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化其類胡蘿卜素的超聲波法提取條件，結(jié)果為用丙酮石油醚(1∶1)為提取試劑，按料液比1∶20(g·mL1-)，超聲溫度55℃，超聲時(shí)間25 min，超聲功率200 W進(jìn)行超聲提取后在445 nm下測(cè)定類胡蘿卜素提取液的吸光光度值。在此條件下測(cè)得類胡蘿卜素含量為62.4 g·100 g-1，且重復(fù)性好。因此，超聲輔助工藝適用于黃花菜中類胡蘿卜素的提取，且效率高、方便快捷、綠色環(huán)保，同時(shí)也說明黃花菜是較好的類胡蘿卜素源植物。