孫明謙，尹春園，苗 蘭，張 穎，劉建勛，楊會(huì)珍，林 力

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100091）

代謝組學(xué)是一種系統(tǒng)生物學(xué)的方法，可以快速、全面地分析生物樣品中的小分子代謝物，揭示生命系統(tǒng)對(duì)任何環(huán)境或基因刺激的代謝反應(yīng)，并可用于疾病的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)。尤其對(duì)于代謝性疾病，如糖尿?。?－5］或動(dòng)脈粥樣硬化［6－7］，代謝組學(xué)可以提供更多有關(guān)代謝過(guò)程和機(jī)制的進(jìn)一步信息，因此近年來(lái)在高脂血癥的研究中取得了廣泛應(yīng)用，在對(duì)疾病機(jī)制、藥物療效與作用機(jī)理的研究中取得了良好的進(jìn)展。從臨床的診斷分型，到動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)，均可利用代謝組學(xué)對(duì)高脂血癥異常的代謝途徑和發(fā)病機(jī)理進(jìn)行探討，如近年來(lái)備受關(guān)注的氧化三甲胺（TAMO）就是通過(guò)代謝組學(xué)結(jié)合腸代菌研究發(fā)現(xiàn)的心血管疾病的重要生物標(biāo)志物［8］。同時(shí)還有一些生物標(biāo)志物通過(guò)代謝組學(xué)被發(fā)現(xiàn)（如短鏈脂肪酸、次級(jí)膽酸等），極大提高了人們對(duì)心血管疾病發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)［9］。

由于尿液和血漿等生物流體不能提供有關(guān)代謝變化的空間信息，近年來(lái)對(duì)組織代謝組學(xué)的研究越來(lái)越受到重視［10－11］，它能為損傷組織提供直接而豐富的信息，在機(jī)理探索和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中具有重要作用。本文采用反相色譜（RPLC）和親水作用色譜（HILIC）分離法對(duì)早期高脂血癥金黃地鼠肝臟進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。HILIC可作為RPLC分析極性組分的補(bǔ)充分離方法，而極性組分在組織勻漿中所占比例較高。本研究旨在通過(guò)兩種分離模式尋找更多潛在的生物標(biāo)志物，為了解肝臟高脂血癥的病理學(xué)提供更多有用的信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 series超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配備二元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器以及在線分析軟件等；Agilent 6520 series Q－TOF質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；22 R高速離心機(jī)（德國(guó)Mikro公司），LAbOSPEC T003日立全自動(dòng)生化儀（日本Hitachi公司）。

乙腈、甲醇（HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司）；甲酸（99%，荷蘭J.T.Baker公司）。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水（中國(guó)娃哈哈公司）。次黃嘌呤、黃嘌呤、哌啶酸、尼克酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）。神經(jīng)鞘氨醇、二氫神經(jīng)鞘氨醇（加拿大Toronto Research Chemicals Inc.）。甘油磷酸膽堿、精氨酸（北京J&K Scientific公司）?？偰懝檀迹═G）、總甘油三酯（TC）、低密度脂蛋白（LDL－C）及高密度脂蛋白（HDLC）測(cè)定試劑盒（日本日立高新技術(shù)公司）。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與樣品采集

SPF級(jí)7周齡敘利亞雄性金黃地鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（京）2016－0011。金黃地鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下（溫度：22℃；12 h光－暗循環(huán)）自由飲用無(wú)菌食物和自來(lái)水。一周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=9）和高脂血癥模型組（n=9）。高脂血癥模型組飼喂高脂飼料6周，對(duì)照組飼喂正常飼料。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有金黃地鼠均禁食12 h，取肝臟用生理鹽水沖洗，立即注入液氮，并儲(chǔ)存于－80℃下進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 樣本處理

冷凍肝臟標(biāo)本于室溫下解凍，在50%甲醇中以1∶10（w/v）的組織/溶液比均勻化。在使用均質(zhì)器（德國(guó)IKA）的冰浴中，每均質(zhì)10 s后，均化暫停10 s，重復(fù)均化2次直至獲得均勻的勻漿［12－13］。每個(gè)樣品均化后，均化器探針依次用水、甲醇和水清洗。然后在40 μL勻漿中加入200 μL的冷有機(jī)溶液（乙腈∶甲醇=1∶1），劇烈搖動(dòng)20 s，室溫下保存10 min，在4℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液待分析［12－13］。

1.4 色譜條件

色譜分離在RP柱（BEH，C18，1.7 μm×2.1 mm×100 mm，Waters，Ireland）和HILIC柱（BEH，Amide，1.7 μm×2.1 mm×100 mm，Waters，Ireland）上進(jìn)行。RP分析的流動(dòng)相：A相為含0.1%甲酸的乙腈－水（1∶9）溶液，B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度程序如下：0～10 min，30%～80%B；10～12 min，80%B；12～14min，80%～30%B；14min，結(jié)束。兩針樣品之間的平衡時(shí)間為2min，流速為0.3mL/min，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為5μL。

HILIC分析的流動(dòng)相：A相為含0.1%甲酸的水溶液，B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度程序如下：0～10 min，95%～80%B；10～13 min，80%～70%B；13～14 min，70%B；14～16 min，70%～95%B；16 min，結(jié)束。兩針樣品之間的平衡時(shí)間為2 min，流速為0.3 mL/min，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

Agilent 6250四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，離子源為雙ESI噴霧。霧化氣和干燥氣均為氮?dú)?，碰撞氣為氦氣。采集模式為正離子模式，毛細(xì)管電壓為3 500 V，霧化溫度為350℃，干燥氣為10.0 L/min，霧化氣為206.85 kPa。質(zhì)譜掃描范圍為m/z80～1 000，數(shù)據(jù)儲(chǔ)存模式為centroid。質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)通過(guò)2個(gè)已知的標(biāo)準(zhǔn)品［六（1H，1H，3H-全氟丙氧基）磷氮和7H-嘌呤，對(duì)應(yīng)m/z分別為922.009 80和121.050 9］進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。參比液通過(guò)Agilent isocratic泵以0.01 mL/min的速度噴入質(zhì)譜。Auto MS/MS實(shí)驗(yàn)采用碰撞誘導(dǎo)解離（CID）碰撞的方式。

現(xiàn)行海島垃圾外運(yùn)處理成本高，海路運(yùn)至珠海費(fèi)用高達(dá)2 000元/t，鎮(zhèn)政府每年支付壓縮類垃圾的運(yùn)費(fèi)就要花費(fèi)約190萬(wàn)元。就地焚燒，焚燒尾氣排放不達(dá)標(biāo)，污染海島環(huán)境；生活垃圾經(jīng)簡(jiǎn)單分類投入焚燒爐中，未經(jīng)干燥的垃圾含水率高，燃燒過(guò)程不穩(wěn)定，燃燒溫度低；當(dāng)燃燒溫度低于800℃，煙氣在氧氣、烯烴、氯條件下易于產(chǎn)生二惡英等劇毒物質(zhì)［12］。焚燒站刺鼻的煙氣隨海風(fēng)傳播，擴(kuò)散半徑可達(dá)500 m，常年在垃圾站的工作人員和附近居民的健康都會(huì)受到影響。

1.6 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Agilent Mass Hunter（version 2.0）和Mass Professor profiler（MPP）B2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在分子特征提取分析中，m/z的豐度數(shù)值大于500的數(shù)據(jù)被采集納入分子特征的計(jì)算中。豐度的計(jì)算由Mass Hunter 2.0軟件對(duì)每個(gè)分子相應(yīng)的同位素和加合離子峰豐度加合后產(chǎn)生。最后，在采集的分子特征中，豐度大于3 000的分子特征被納入和整理成數(shù)據(jù)以待進(jìn)一步分析。

通過(guò)Mass Hunter 2.0軟件產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步輸入到MPP B2.0軟件中進(jìn)行分析。MPP B2.0分別采用排列、歸一化、數(shù)據(jù)集分割和數(shù)據(jù)縮放等方法對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理［14］。質(zhì)量聚類窗口為10 ppm，保留時(shí)間聚類窗口為0.1 min。上述數(shù)據(jù)按照80%規(guī)則進(jìn)行處理，僅保留任何組中至少80%的變量用于分析。豐度值經(jīng)中位數(shù)歸一化及對(duì)數(shù)基二次變換后作為多變量分析的輸入數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)最后應(yīng)用SIMICAP+12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（PLS－DA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 高脂血癥金黃地鼠的血脂水平

造模6周后，不同組金黃地鼠血清的TG、TC、LDL－C、HDL－C濃度見表1。與正常對(duì)照組相比，模型組的TG、TC、LDL－C、HDL－C濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1），說(shuō)明高脂血癥模型造模成功。

表1 金黃地鼠血清中TG、TC、LDL－C和HDL－C的濃度（xˉ±s，n=9）Table 1 Concentrations of TG，TC，LDL－C and HDL－C in serum of two groups hamsters（xˉ±s，n=9）

2.2 RPLC－MS與HILIC－MS分析

采用RPLC和HILIC結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF MS）對(duì)高脂血癥和正常金黃地鼠的肝勻漿液進(jìn)行代謝組學(xué)研究。HIILC對(duì)極性化合物的分離優(yōu)勢(shì)已成為常規(guī)RPLC分離方法的重要補(bǔ)充。本研究采用HILIC模式測(cè)定872個(gè)特征變量，采用RPLC模式測(cè)定713個(gè)特征變量。在HPLC－TOF MS分析過(guò)程中，每進(jìn)樣分析6個(gè)樣品后進(jìn)1個(gè)質(zhì)控（QC）樣品，所有樣品均取20 μL，混合成為均一的QC樣品。在每種電離模式下選擇6種代表性的離子評(píng)價(jià)分析方法的偏差，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于1.0%，離子強(qiáng)度的RSD小于15%。結(jié)果表明，該方法是合理穩(wěn)定的，數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 模式識(shí)別分析

采用PLS－DA對(duì)正常對(duì)照組和模型組肝勻漿中的代謝物譜進(jìn)行分析，得到相應(yīng)的散點(diǎn)分布圖（如圖1）。在RPLC模式下，PLS－DA結(jié)果（圖1A）顯示兩組間有明顯的分離，建模所用的主成分對(duì)原始數(shù)據(jù)的解釋度R2Y=0.999，模型的可預(yù)測(cè)度Q2=0.966。在HILIC模式下，PLS－DA結(jié)果（圖1B）顯示模型組與對(duì)照組呈現(xiàn)明顯的區(qū)別，PLS－DA參數(shù)如下：R2Y=0.988，Q2=0.940。HILIC和RPLC兩種模式的數(shù)據(jù)均表明，高脂血癥組的肝臟內(nèi)源性代謝產(chǎn)物與對(duì)照組有顯著差異。

圖1 基于RPLC－MS（A）和HILIC－MS（B）數(shù)據(jù)的PLS-DA模式識(shí)別圖Fig.1 PLS－DA score plots based on data from RPLC－MS（A）and HILIC－MS（B）modes blue：control group；red：hyperlipidemic group

2.4 潛在生物標(biāo)志物鑒定

VIP值（Variable importance for the projection）反映了每個(gè)變量（代謝物）對(duì)分類的影響，在PLS－DA處理后生成。從student′s t-test檢驗(yàn)中篩選出VIP＞1、P＜0.05的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步研究。首先利用這些特征的準(zhǔn)確質(zhì)譜和質(zhì)譜同位素圖譜搜索數(shù)據(jù)庫(kù)METLIN（MPP中的輔助軟件包）。然后在MS/MS實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)這些候選生物標(biāo)志物的碎片離子進(jìn)行分析或與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較［14］。其中，7種代謝物通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)化合物的比較得到了明確歸屬，但有些化合物特別是磷脂酰膽堿（PCs）仍需結(jié)合裂解途徑分析。如圖2，以PC（16∶0/18∶2）和PC（O－16∶0/2∶0）為例，闡明潛在生物標(biāo)志物的鑒定。PC（16∶0/18∶2）的主要碎片離子m/z184代表磷膽堿離子，m/z86代表乙基三甲胺離子。PC（O－16∶0/2∶0）也具有m/z86離子的特征，但另一個(gè)離子m/z341是由磷膽堿離子的丟失形成。這些特征離子能區(qū)分PC和PE，而PE是一種主要的異構(gòu)體，在裂解過(guò)程中性損失為m/z141。另一種碎片離子來(lái)自磷酸乙烯基。由于環(huán)氧樹脂的結(jié)構(gòu)，很容易與鈉離子或鉀離子結(jié)合形成加合離子m/z147和m/z163。最后，對(duì)16個(gè)潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行不同置信度的鑒定。潛在生物標(biāo)志物見表2。

表2 金黃地鼠肝臟代謝差異代謝物Table 2 Differential metabolites in hamsters liver

圖2 PC（16∶0/18∶2）（A）與PC（O-16∶0/2∶0）（B）的裂解分析Fig.2 MS/MS spectra and fragmentation analysis of PC（16∶0/18∶2）（A）and PC（O-16∶0/2∶0）（B）

2.5 生物功能分析

本研究表明，基于RPLC－MS和HILIC－MS技術(shù)的肝臟代謝組學(xué)可用于區(qū)分高脂血癥金黃地鼠和對(duì)照組。在高脂血癥金黃地鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了16個(gè)具有顯著變化的潛在生物標(biāo)志物（見表2）。在這些內(nèi)源性代謝產(chǎn)物中，模型組的次黃嘌呤和黃嘌呤呈明顯下降趨勢(shì)。在嘌呤代謝中，次黃嘌呤可被黃嘌呤氧化酶（XO）氧化為黃嘌呤，再進(jìn)一步被氧化為尿酸，導(dǎo)致高脂血癥金黃地鼠嘌呤代謝紊亂［15－16］。次黃嘌呤和黃嘌呤的降低可能表明黃嘌呤氧化酶活性上調(diào)，高活性XO可增加肝臟活性氧（ROS）自由基。ROS可能與多種生物分子發(fā)生反應(yīng)，包括脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸和結(jié)締組織大分子，從而干擾細(xì)胞功能［17］。一項(xiàng)關(guān)于金黃地鼠肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也報(bào)道了XO在高脂肪飲食下的表達(dá)上調(diào)［18］。

5種PCs在高脂血癥金黃地鼠體內(nèi)呈上升趨勢(shì)，提示金黃地鼠脂質(zhì)代謝紊亂。PCs在脂質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂蛋白合成等方面發(fā)揮著重要作用。肝臟是PCs合成和血漿脂蛋白生成的主要場(chǎng)所［19］。PCs對(duì)極低密度脂蛋白的合成至關(guān)重要，高水平的肝PCs可促進(jìn)極低密度脂蛋白向血漿輸出［20］。因此，PCs的增加最終導(dǎo)致金黃地鼠血漿中總甘油三酯和膽固醇的含量升高［17］。此外，模型組的甘油磷酸膽堿呈下降趨勢(shì)，它是PCs分解代謝的代謝物［21］。這也是磷脂代謝異常的另一個(gè)證據(jù)，表明PCs的下游代謝產(chǎn)物也受到影響。

鞘脂是生物膜中的主要類脂，也是細(xì)胞信號(hào)傳遞中的生物活性脂質(zhì)介質(zhì)［22］。高脂血癥組的神經(jīng)鞘氨醇和二氫神經(jīng)鞘氨醇呈升高趨勢(shì)，提示鞘脂代謝紊亂。鞘脂的增加可能減少膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，這可能是高脂血癥相關(guān)疾病中脂質(zhì)紊亂的原因之一［23］。鞘脂還可通過(guò)鞘磷脂酶（Smase）代謝為神經(jīng)酰胺，在高脂血癥的炎癥反應(yīng)中起重要作用［24］。

高脂血癥組金黃地鼠的賴氨酸分解代謝產(chǎn)物酵母氨酸和哌啶酸的含量均發(fā)生顯著變化，說(shuō)明高脂血癥組金黃地鼠的賴氨酸代謝紊亂。賴氨酸經(jīng)賴氨酸－酮戊二酸還原酶代謝產(chǎn)生酵母氨酸，酵母氨酸的增加可能預(yù)示著賴氨酸的減少。據(jù)報(bào)道，高脂血癥組的游離賴氨酸水平較低可能提示高脂血癥發(fā)病機(jī)制中氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而加重脂肪肝和脂肪堆積［25］。高脂血癥組的精氨酸含量高。精氨酸是一種必需氨基酸，在心血管生理和病理生理中起著重要作用。它是一氧化氮合成的底物，在維持正常血管功能、降低血小板活性和白細(xì)胞粘附方面發(fā)揮重要作用［26－27］。在高脂血癥狀態(tài)下，對(duì)合成NO的需求增加，導(dǎo)致肝臟精氨酸含量增加。然而，精氨酸參與了許多代謝途徑，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。高脂血癥組金黃地鼠體內(nèi)異常的代謝途徑（包括嘌呤代謝、賴氨酸代謝、鞘脂代謝和磷脂酰膽堿代謝）歸納見圖3。

圖3 高脂血癥相關(guān)的生物代謝通路Fig.3 The disrupted metabolic pathway in hyperlipidemic hamsters

3 結(jié)論

本研究采用HILIC和RPLC色譜法結(jié)合TOF MS對(duì)高脂血癥金黃地鼠肝臟代謝進(jìn)行了分析。在MS/MS實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的比較，確定了16個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示，高脂血癥金黃地鼠肝臟的嘌呤代謝、賴氨酸代謝、鞘脂代謝和磷脂酰膽堿代謝紊亂。研究結(jié)果表明，基于RPLCMS和HILIC－MS的代謝組學(xué)策略是尋找肝組織潛在生物標(biāo)記物的有價(jià)值的工具。