范 蓉，郭亞萍，趙柯柯，姜夢輝，石穎穎，曲延英，陳全家

(新疆農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院 棉花教育部工程研究中心, 烏魯木齊 830052)

棉花是世界上最重要的經(jīng)濟作物和纖維作物之一，苗期干旱和鹽堿是影響棉花生長和導致減產(chǎn)的重要因素[1]。當植物受到干旱、鹽脅迫時，植物會通過信號傳遞激發(fā)轉錄因子，轉錄因子與啟動子區(qū)的順式作用元件相結合啟動特定基因的表達，從而對脅迫應答[2]。明確棉花抗旱、耐鹽相關轉錄因子的表達模式，可為棉花抗逆性鑒定分子指標體系的建立提供依據(jù)與參考。

轉錄因子HSFA、bZIP和NAC在作物對抗干旱鹽堿等逆境過程中扮演著重要的角色。研究表明，HSFA類轉錄因子參與植物干旱、高鹽等多種逆境脅迫[3]。在棉花[4]、擬南芥[5-6]中，HSFA類轉錄因子受到干旱處理的上調(diào)誘導，過表達的HSFA在擬南芥中起正調(diào)控作用，并且擬南芥在缺水和限水條件下收獲指數(shù)和產(chǎn)量有一定提高。過表達GhHsfA7的棉花[4]植株SOD、 APX、 CAT 等 ROS 清除酶的活性升高，同時提高了棉花的耐鹽性。干旱脅迫下bZIP在水稻[7]、大豆[8]、玉米[9]、番茄[10]中的表達均顯著上調(diào)，并且在轉基因植株中顯著增強了作物的抗性。李月等[11]對轉錄因子基因GhbZIP15克隆與表達分析中發(fā)現(xiàn)GhbZIP15參與棉花的非生物脅迫應答。Mittal等[12]發(fā)現(xiàn)將擬南芥AtAB15轉化棉花可以增強轉基因棉花的抗旱性。關于NAC類轉錄因子，研究表明在擬南芥[13]、水稻[14]、玉米[15]、馬鈴薯[16]、高粱[17]、鷹嘴豆[18]等植物中，NAC轉錄因子響應非生物脅迫，過表達的NAC2提高了轉基因馬鈴薯在逆境條件下的耐受性。

目前，眾多學者對棉花的抗旱性及耐鹽性鑒定一般從生理指標變化及植株形態(tài)等方面入手，其中，常用的抗旱性和耐鹽性鑒定的生理指標有MDA、Pro、SOD、POD及EL等[19-20]。當植物受到干旱或高鹽脅迫時，原生質膜損傷，植物受到活性氧的破壞，MDA含量積累增加，質膜透性增加，而細胞內(nèi)含物質被動外滲，EL升高[21]。為應對干旱或高鹽造成的傷害，植物常通過增加或減少Pro等滲透調(diào)節(jié)物質，從而降低細胞水勢，改變體內(nèi)SOD、POD等酶活力來適應水分的變化，通過清除氧自由基，來減輕脅迫對植物的傷害[22-23]。

轉錄因子響應脅迫過程較復雜，脅迫時間的長短對基因的表達量具有顯著影響[24]。因此，篩選出響應逆境脅迫相關的基因及其最適脅迫時間尤為重要。本試驗研究PEG、NaCl脅迫下棉花5個常用抗旱耐鹽生理指標及關鍵基因GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2表達情況，并進一步分析抗旱耐鹽生理指標與這些基因的相關性，以期篩選出抗旱及耐鹽基因作為棉花抗旱性及耐鹽性鑒定的分子指標的參考，為棉花抗逆機制的研究提供依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選用2個抗旱耐鹽品種‘KK1543’‘CQJ-5’和2個敏旱敏鹽品種‘新陸早26’‘石遠321’為試驗材料，由新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)生重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)方法

選取籽粒飽滿、大小一致的棉花種子用70%的酒精消毒5 min，再經(jīng)15%的H2O2表面滅菌4 h，用無菌水沖洗4～5次放入三角瓶中，浸種至種子露白，轉至放有兩層濾紙的發(fā)芽盒中，保持濕潤。待長出兩片子葉后，選取長勢強壯、均一的棉花幼苗轉入1/2 Hoagload營養(yǎng)液中，溫室水培。16 h光照/8 h黑暗，25 ℃，3 d更換1次營養(yǎng)液。

棉花長3至4片真葉時，處理組脅迫濃度參照前人研究結果[25-26]，PEG模擬干旱脅迫組用含有15% PEG6000的營養(yǎng)液脅迫處理3、6、12和24 h；鹽脅迫組用含有250 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液脅迫處理3、6、12和24 h。對照組用1/2 Hoagload營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每個處理3個重復，每個重復為3株樣品。脅迫結束后，立即采棉花第二片真葉，放入液氮中速凍后用于提RNA，并立即檢測處理組與對照組生理指標MDA、Pro、SOD、POD及EL。

1.2.2 實時熒光定量PCR

提取葉片總RNA，以RNA為模板反轉錄合成cDNA第一鏈。選取與植物抗旱、耐鹽相關轉錄因子GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2為目標基因，GhUBQ7為內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI上公布的基因序列，運用軟件Primer premier 5.0[11]，分別設計特異性引物，引物送華大基因科技有限公司合成。

qRT-PCR反應程序采用兩步法：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。反應結束后將數(shù)據(jù)導出到Microsoft Excel進行統(tǒng)計和計算分析。相對表達量的計算方法參照秦鵬等[24]使用的2-ΔΔCt方法。

由圖3可知，不同適應活化條件對酵母菌產(chǎn)氣能力有較大影響，隨活化基質中碳源和氮源含量的增加，酵母菌的產(chǎn)氣量基本呈上升趨勢。盡管有氧呼吸時CO2的產(chǎn)量遠高于厭氧條件下，但厭氧條件活化所得酵母菌在隨后的發(fā)酵試驗中展現(xiàn)了遠高于有氧條件活化菌株的產(chǎn)氣能力，這可能是由于厭氧條件下，某些參與TCA循環(huán)的酶仍然保持活性，這些額外的代謝途徑能夠合成細胞功能所需的重要前體物質，并決定最終產(chǎn)氣體積[22]。

表1 研究中使用的基因與引物信息

1.2.3 生理指標測定

丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[27]；脯氨酸(Pro)含量測定采用水合茚三酮法測定[27]；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用NBT光化學還原法測定[27]；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[27]；電解質外滲法檢測電滲率(EL)[28]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理計算，DPS進行方差分析[11]，Graph Pad Prism 5繪柱狀圖及箱圖，相關性是通過軟件SPSS 20的雙尾t檢驗進行分析[24]。

2 結果與分析

2.1 PEG模擬干旱脅迫下棉花轉錄因子表達量分析

2.1.1 PEG脅迫下棉花GhHsfA7的表達分析

PEG脅迫下，不同棉花品種中GhHsfA7的表達模式如圖1(a)，在抗旱品種(CQJ-5和KK1543)中，GhHsfA7相對表達量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。在PEG脅迫的3、6 h，兩個抗旱品種的GhHsfA7相對表達量都較高且差異不顯著，均在6 h表達量達到極值，分別是對照的3.06和3.56倍；在敏旱品種(新陸早26和石遠321)中GhHsfA7的相對表達量都呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)的趨勢，在6 h表達量達到極值，分別是對照的1.08和1.23倍。

在PEG脅迫下，GhHsfA7在不同棉花品種表達變化如圖1(b)，抗旱品種中GhHsfA7在3、6和12 h的相對表達量極顯著高于敏旱品種，表明GhHsfA7在干旱脅迫中發(fā)揮了正調(diào)控的作用。在抗旱和敏旱品種中GhHsfA7的相對表達量均在脅迫6 h達到最大值，該時間GhHsfA7的相對表達量可作為鑒定棉花抗旱性的一個重要指標。

不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著差異；**表示在0.01水平存在顯著差異。圖1 PEG脅迫下GhHsfA7在棉花中的表達變化Figure 1 Changes of GhHsfA7 expression in cotton under PEG stress

2.1.2 PEG脅迫下棉花GhbZIP15的表達分析

不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著差異。**表示在0.01水平存在顯著差異；*表示在0.05水平存在顯著差異。圖2 PEG脅迫下GhbZIP15在棉花中的表達變化Figure 2 Changes of GhbZIP15 expression in cotton under PEG stress

在PEG脅迫下，GhbZIP15在不同棉花品種表達變化如圖2(b)，抗旱品種中GhbZIP15在各時間段的相對表達量顯著或極顯著高于敏旱品種，表明GhbZIP15在干旱脅迫中發(fā)揮了正調(diào)控的作用。在抗旱和敏旱品種中GhbZIP15的相對表達量在脅迫6 h達到最大值，該時間GhbZIP15的相對表達量可作為鑒定棉花抗旱性的一個重要指標。

2.1.3 PEG脅迫下棉花GhNAC2的表達分析

PEG脅迫下，不同棉花品種中GhNAC2的表達模式如圖3(a)，GhNAC2相對表達量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。在CQJ-5 中，GhNAC2在6 h下達到極值，表達量是對照的7.64倍；在KK1543中，GhNAC2在6、12 h下表達量較高，在12 h下達到極值，表達量是對照的3.99倍；在敏旱品種(新陸早26，石遠321)中，GhNAC2在6 h下達到極值。在新陸早26中，GhNAC2在6 h表達量是對照的2.48倍；在KK1543中，GhNAC2在6 h表達量是對照的3.93倍。

在PEG脅迫下，GhNAC2在不同棉花品種表達變化如圖3(b)，在抗旱品種中GhNAC2在3、6和12 h下的相對表達量顯著或極顯著高于敏旱品種，表明GhNAC2在干旱脅迫中發(fā)揮了正調(diào)控的作用。在抗旱和敏旱品種比較中GhNAC2的相對表達量在脅迫6 h下達到最大值，該時間GhNAC2的相對表達量可作為鑒定棉花抗旱性的參考指標。

不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著差異。**表示在0.01水平存在顯著差異；*表示在0.05水平存在顯著差異。圖3 PEG脅迫下GhNAC2在不同棉花品種中的表達變化Figure 3 Expression changes of GhNAC2 in different cotton varieties under PEG stress

在PEG脅迫下，不同品種棉花中GhHsfA7、GhbZIP15、GhNAC2均在6 h下高表達，表達總量依次為GhNAC2(18.04)>GhbZIP15(9.99)>GhHsfA7(8.93)，抗旱品種(CQJ-5和KK1543) 與敏旱品種(新陸早26，石遠321基因表達量間存在顯著或極顯著差異。

2.2 NaCl脅迫下轉錄因子表達量分析

2.2.1 NaCl脅迫下棉花GhHsfA7的表達分析

NaCl脅迫下，不同棉花品種中GhHsfA7的表達模式如圖4(a)，在耐鹽品種(CQJ-5和KK1543)中表達呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)再下調(diào)的趨勢，GhHsfA7在3、12 h下表達量達到峰值，在3 h下達到極值，分別是對照的3.86、4.61倍；GhHsfA7在敏鹽品種(新陸早26和石遠321)中表達呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，在 3 h下表達量達到極值，分別是對照的2.98、2.28倍。

在NaCl脅迫下，GhHsfA7在不同棉花品種表達變化如圖4(b)，耐鹽品種中GhHsfA7在3、6、12和24 h下的相對表達量極顯著高于敏旱品種，表明GhHsfA7在鹽脅迫中發(fā)揮了正調(diào)控的作用。在耐鹽與敏鹽品種中GhHsfA7的相對表達量均在脅迫3 h下達到最大值，該時間GhHsfA7的相對表達量可作為鑒定棉花耐鹽性的一個重要指標。

2.2.2 NaCl脅迫下棉花GhbZIP15的表達分析

NaCl脅迫下，不同棉花品種中GhbZIP15的表達模式如圖5(a)。GhbZIP15相對表達量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。在CQJ-5 中GhbZIP15表達量在6 h達到極值，是對照的2.91倍；在KK1543中GhbZIP15表達量在3 h達到極值，是對照的2.49倍；在敏旱品種(新陸早26和石遠321)中GhbZIP15表達量在3 h達到極值，分別是對照的1.58和1.49倍。

不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著差異。**表示在0.01水平存在顯著差異；*表示在0.05水平存在顯著差異。圖4 NaCl脅迫下GhHsfA7在棉花中的表達變化Figure 4 Changes of GhHsfA7 expression in cotton under NaCl stress

在NaCl脅迫下，GhbZIP15在不同棉花品種表達變化如圖5(b)，耐鹽品種中GhbZIP15在3、6、12和24 h下的相對表達量極顯著高于敏旱品種，表明GhbZIP15在鹽脅迫中發(fā)揮了正調(diào)控的作用，在脅迫3 h下達到最大值。

不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著差異。**表示在0.01水平存在顯著差異；*表示在0.05水平存在顯著差異。圖5 NaCl脅迫下GhbZIP15在棉花中的表達變化Figure 5 Changes of GhbZIP15 expression in cotton under NaCl stress

2.2.3 NaCl脅迫下棉花GhNAC2的表達分析

NaCl脅迫下，不同棉花品種中GhNAC2的表達模式如圖6(a)，GhNAC2相對表達量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。在耐鹽品種(CQJ-5和KK1543)中GhNAC2表達量在3 h下達到極值，是對照的3.35和3.84倍；在敏鹽品種新陸早26中GhNAC2表達量在3 h下達到極值，是對照的1.99倍。在KK1543中GhNAC2表達量在6 h下達到極值，是對照的1.33倍。

在NaCl脅迫下，GhNAC2在不同棉花品種表達變化如圖6(b)，耐鹽品種中GhNAC2在3、6和12 h下的相對表達量極顯著高于敏旱品種，表明GhNAC2在鹽脅迫中發(fā)揮了正調(diào)控的作用。在耐鹽與敏鹽品種中GhNAC2的相對表達量均在脅迫3 h下達到峰值，該時間GhNAC2的相對表達量可作為鑒定棉花耐鹽性的一個重要指標。

在NaCl脅迫下，不同品種棉花中GhHsfA7、GhbZIP15、GhNAC2在3 h下高表達，表達總量依次為：GhHsfA7(13.73)>GhNAC2(10.51)>GhbZIP15(8.20)，抗旱品種(CQJ-5和KK1543) 與敏旱品種(新陸早26和石遠321)基因表達量間存在顯著或極顯著差異。

2.3 干旱脅迫和鹽脅迫下棉花生理指標差異分析

測定PEG模擬干旱脅迫6 h、NaCl脅迫3 h及對照棉花不同品種5項生理指標變化如表2所示。模擬干旱脅迫與高鹽脅迫后棉花5項生理指標與對照之間存在顯著差異。并且抗逆性不同的棉花品種中生理指標間也存在顯著差異。耐受型棉花品種(CQJ-5和KK1543)Pro、SOD及POD相對變化均大于敏感型品種(新陸早26和石遠321)，而MDA和EL相對變化均小于敏感型品種。

不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著差異。**表示在0.01水平存在顯著差異；*表示在0.05水平存在顯著差異。圖6 NaCl脅迫下GhNAC2在棉花中的表達變化Figure 6 Changes of GhNAC2 expression in cotton under NaCl stress

表2 干旱脅迫和鹽脅迫下棉花生理指標變化

2.4 3個轉錄因子基因表達量與生理指標相關性分析

3個轉錄因子的相對表達量與5個生理指標相對變化相關性如表3所示。相關性是通過SPSS 20軟件的雙尾t檢驗進行分析得到pearson相關系數(shù)，表現(xiàn)基因與生理指標間的密切程度和變化趨勢。PEG脅迫下，GhHsfA7與Pro存在極顯著正相關，GhbZIP15與MDA、 EL存在顯著或極顯著負相關，GhNAC2與SOD、POD存在顯著正相關。NaCl脅迫下，GhHsfA7與Pro存在顯著正相關,與EL間存在顯著負相關，GhbZIP15與Pro存在顯著正相關，GhNAC2與SOD、POD存在顯著正相關，與MDA、EL存在顯著負相關。

表3 3個轉錄因子基因表達量與生理指標相關性分析

3 討論與結論

本研究中，不同品種棉花受到干旱和鹽脅迫時，轉錄因子GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2均起正調(diào)控的作用，這與以前報道的研究結果一致[4,11,18]。在PEG脅迫6 h和NaCl脅迫3 h下，GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2的綜合表達量達最大值。雖然3個轉錄因子的表達趨勢不一致，但不同品種間存在一定關聯(lián)，耐受型品種中的表達均顯著高于敏感型品種；PEG脅迫下，3個轉錄因子均在敏感品種‘新陸早26’表達量最低；NaCl脅迫下，3個轉錄因子均在敏感品種‘石遠321’表達量最低。說明在不同的棉花品種中，調(diào)控GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2轉錄因子表達的途徑存在差異，可能是這些轉錄因子的啟動子序列含有不同的順式作用元件，也可能是這些轉錄因子上游的基因存在差異[24]。

本研究通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，GhHsfA7在PEG和NaCl脅迫下與Pro存在極顯著正相關，與EL存在顯著負相關，說明GhHsfA7可能參與調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質的積累從而提高植物的保水性，使得細胞膜受傷害程度小，電解質外滲少，以此應對鹽脅迫對植物的傷害。GhbZIP15在PEG脅迫下與MDA、 EL存在顯著或極顯著負相關，說明GhbZIP15可能與合成膜脂過氧化產(chǎn)物起負調(diào)控作用，同時植物細胞膜完整性較好，棉花受傷害程度小。GhNAC2與SOD、POD間存在顯著正相關，說明GhNAC2可能參與調(diào)控活性氧清除相關的酶表達，從而提提高酶活力，清除植物體內(nèi)自由基，對細胞膜產(chǎn)生保護作用，降低脅迫對植物的傷害。研究表明，在玉米[29]、大麥[30]、棉花[31]、油菜[32]等作物中，敏旱品種MDA 的積累量與電解質滲透率較高，抗旱品種游離脯氨酸積累量、SOD與POD酶活性較高，以上研究結果與本研究結果一致。

PEG脅迫6 h與NaCl脅迫3 h下，GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2的表達量可作為棉花抗旱、耐鹽性鑒定的分子指標的參考。不同棉花品種在逆境脅迫下有多個信號途徑協(xié)同作用，并且發(fā)揮作用，響應時間也不盡相同。因此，想要準確、快速地鑒定棉花品種的抗旱耐鹽性，還需要不斷豐富棉花抗旱耐鹽性鑒定的分子指標，為抗旱耐鹽性鑒定體系的建立提供依據(jù)。