付英杰李新健賈玉民 陳 智 任 強(qiáng) 于定榮* 陳 婭

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 日照276826； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700； 3.東阿阿膠股份有限公司，國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，山東 東阿252201； 4.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355）

阿膠Colla Corii Asini始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［1］。2015年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定阿膠是由馬科動(dòng)物驢Equus asinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠，具有補(bǔ)血滋陰、潤(rùn)燥、止血的功效，多用于治療眩暈心悸、肌痿無(wú)力、心煩不眠、虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)、肺燥咳嗽、癆咳咯血、吐血尿血、便血崩漏等［2?4］。阿膠含有大量的膠原蛋白、多肽、氨基酸和豐富的微量元素，阿膠的蛋白類含量約60%～80%［5?8］，但其有效成分尚不完全明確。阿膠有補(bǔ)血［9］、抗氧化［10］、抗疲勞［11］、耐氧化、耐寒冷、抗休克、增強(qiáng)記憶力、改善皮膚、促骨愈合、抑瘤增效，在一定程度上還能拮抗血液的肝素化，起到止血等作用［12?14］。

目前，阿膠的質(zhì)量評(píng)價(jià)仍然主要依靠傳統(tǒng)的生藥學(xué)鑒別等方法，其經(jīng)驗(yàn)依賴性強(qiáng)、準(zhǔn)確性較低［15］。2015年版《中國(guó)藥典》 將阿膠用胰酶酶解，再利用HPLC?MS 聯(lián)用技術(shù)對(duì)阿膠進(jìn)行鑒定［2］。方法可靠，但操作過(guò)程繁瑣，而且進(jìn)行重復(fù)時(shí)，偶會(huì)出現(xiàn)不同廠家、不同產(chǎn)地原料制作的正品阿膠也會(huì)不達(dá)標(biāo)的問(wèn)題，且作為一般的質(zhì)量控制方法過(guò)于昂貴。本實(shí)驗(yàn)以阿膠為基礎(chǔ)，采用不同的蛋白酶對(duì)不同廠家不同批的阿膠進(jìn)行酶解，取酶解物為樣品，建立HPLC 指紋圖譜，并進(jìn)行相似度、聚類及主成分分析，試圖解決目前膠類藥材無(wú)法突破指紋圖譜的問(wèn)題，以期為阿膠的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Gemini NX C18色譜柱（廣州菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司）；KQ?500DB型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PH?3E 酸度計(jì)（南京桑力電子設(shè)備廠）；CP224C 電子天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；SYC?15c 超級(jí)恒溫水?。暇┥Ａ﹄娮釉O(shè)備廠）。

1.2 試劑 α?糜蛋白酶（B604BA0026，1 000 U／mg，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司）；胰蛋白酶［C119BA0026，≥300 U／mg，生物工程（上海）股份有限公司］。其他試劑均為色譜純。

1.3 樣品 東阿阿膠（S1～S12 批號(hào)分別為1305077、1306026、1407017、1408005、1409001、1503022、1503027、1504044、1505001、1508034、1509013、1505039）；福牌阿膠（S13～S22 批號(hào)分別為130303、130308、130925（紙 盒）、140386（紙 盒）、1400741、14040708、14100401、14120682、15070462、15070572）；同仁堂阿膠［S23～S32 批號(hào)分別為13191482、14191695（大紙盒）、14191794、14191921、14191959、15190704、15191072、15191156、20150139（食 用）、201407012（大鐵盒）］；其他品牌華信S33 批號(hào)20141102、膠城S34 批號(hào)20160401、九芝堂S35 批號(hào)20150502。以上未標(biāo)注產(chǎn)品批均為250 g 普通鐵盒裝。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 阿膠加純水加熱配成5%濃度，選用以下2種蛋白酶于40 ℃水浴中酶解4 h，胰蛋白酶（將pH 調(diào)至8.0，胰蛋白酶加入量為5 000 U／g 阿膠）、糜蛋白酶（將pH 調(diào)至8.0，糜蛋白酶加入量為5 000 U／g 阿膠），酶解后在95 ℃水浴中滅活15 min，冷卻，依次使用脫脂棉、定量濾紙和0.45 μm 微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，即得。

2.2 色譜條件 Gemini NX C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.2 mol／L 無(wú)水硫酸鈉（磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.3，A）?乙腈?水（B），梯度洗脫（0～5 min，90%～84% B；5～25 min，84%～72%B；25～35 min，72%～60% B；35～40 min，60%～48% B）；體積流量1 mL／min；柱溫25 ℃；波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立 取35 批阿膠的胰蛋白酶及糜蛋白酶酶解物，分別在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，獲得HPLC 色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A 版）疊加色譜圖，截取5～35 min 色譜數(shù)據(jù)，以S1 為參照，時(shí)間窗0.2 min，獲得對(duì)照色譜圖ej?R［16］。將各色譜圖與之對(duì)照求得相似度，并以匹配數(shù)＝批數(shù)的色譜峰作為共有峰。見(jiàn)圖1～3。相似度見(jiàn)表1。

圖1 不同樣品酶解物HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for enzymatic hydrolysates of different samples

圖2 3 廠家胰蛋白酶酶解物生成對(duì)照指紋圖譜（R）的比較圖Fig.2 Comparison of control fingerprints（R） for trypsin hydrolysates of products from three manufacturers

圖3 3 廠家糜蛋白酶酶解物生成對(duì)照指紋圖譜（R）的比較圖Fig.3 Comparison of control fingerprints（R） for chymotrypsin hydrolysates of products from three manufacturers

表1 32 批樣品相似度Tab.1 Similarities of thirty?two batches of samples

2.4 聚類分析 采用SPSS 軟件中的聚類分析，首先將峰形一致的峰進(jìn)行歸類，捏合峰的原則為±0.5 min 內(nèi)的且峰形一致的峰面積并入一個(gè)fn，以減少色譜圖中的tR誤差。然后運(yùn)用SPSS 19.0 軟件對(duì)35 批樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間聯(lián)結(jié)法，以平方組間距離作為樣品相似度的距離公式，繪制樹(shù)狀圖，觀察樣品間是否存在相似性，以尋求其規(guī)律性。見(jiàn)圖4。

圖4 35 批樣品聚類樹(shù)狀圖Fig.4 Dendrogram for thirty?five batches of samples

12 批東阿阿膠除S8、S11＜10 外，其他批東阿阿膠類別距離均＜5，10 批同仁堂阿膠類別距離均＜5，表明不同批東阿阿膠和同仁堂阿膠質(zhì)量相當(dāng)穩(wěn)定，福牌阿膠和其他品牌的阿膠類別距離相對(duì)分散，推測(cè)其原輔料來(lái)源可能較廣。同時(shí)，東阿阿膠及同仁堂阿膠類別距離非常近，與福牌阿膠形成明顯的兩大類，因此該法可區(qū)分福牌阿膠與另外2 廠。

糜蛋白酶酶解物聚類分析表明，同仁堂阿膠10個(gè)批較集中，類別距離均＜5，東阿阿膠可以分為兩類，東阿阿膠的S1、S2、S3、S11 類別距離＜5，而其他8 批是另一類，類別距離均＜5，但兩類間有較大區(qū)別。福牌阿膠中除S19、S22＜10 外，其他批類別距離＜5。其他品牌3 批類別距離＜5?？傮w來(lái)看，各廠家不同批阿膠的糜蛋白酶酶解物類別距離均較近不易區(qū)分，與指紋圖譜相似度法結(jié)論相同，3個(gè)廠家的阿膠在糜蛋白酶酶解物色譜圖上展現(xiàn)出較高的一致性，因此該法無(wú)法區(qū)分各廠家產(chǎn)品，而更適于用來(lái)做正品阿膠指紋圖譜。

2.5 主成分分析 運(yùn)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)35 批阿膠不同蛋白酶酶解液進(jìn)行PCA分析，將其投影至低維空間觀察其細(xì)微差別，將共有峰進(jìn)行因子分析，再進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和運(yùn)算［17］。表2 顯示，按主成分特征值＞1，對(duì)方差的累積貢獻(xiàn)率＞80%，均需要提取4個(gè)主成分，按4個(gè)主成分進(jìn)行分析，根據(jù)成分得分系數(shù)矩陣得到阿膠胰蛋白酶酶解物各主成分解析表達(dá)式分別為A1＝0.121f1－0.164f2－ 0.048f3＋0.058f4＋0.492f5－ 0.183f6＋0.518f7＋0.186f8；

表2 主成分初始特征值和貢獻(xiàn)率Tab.2 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

A2＝0.295f1＋0.053f2＋0.199f3＋0.008f4＋0f5＋0.464f6＋0.101f7＋0.515f8；

A3＝－ 0.182f1＋0.675f2－ 0.042f3＋0.544f4－0.073f5＋0.147f6－0.069f7－0.029f8；

A4＝－ 0.588f1＋0.062f2＋0.655f3＋0.105f4－0.092f5＋0.26f6－0.091f7－0.088f8；

阿膠糜蛋白酶酶解物各主成分解析表達(dá)式分別為A1＝0.017f1－0.092f2＋0.046f3－0.080f4＋0.070f5＋0.121f6＋0.127f7＋0.125f8＋0.093f9＋0.074f10＋0.049f11－0.001f12＋0.126f13＋0.119f14－0.045f15＋0.099f16＋0.054f17；

A2＝－ 0.070f1－ 0.092f2＋0.121f3＋0.220f4＋0.183f5＋0.091f6－ 0.003f7＋0.017f8－ 0.213f9＋0.259f10－0.293f11－0.032f12－0.008f13－0.037f14＋0.010f15＋0.056f16－0.109f17；

A3＝－ 0.412f1＋0.060f2－ 0.160f3＋0.108f4＋0.014f5＋0.033f6－ 0.031f7＋0.013f8＋0.082f9＋0.040f10－0.034f11－0.048f12－0.007f13＋0.161f14＋0.430f15－0.001f16＋0.336f17；

A4＝－ 0.016f1－ 0.237f2＋0.260f3－ 0.074f4－0.090f5＋0.023f6－ 0.010f7－ 0.001f8＋0.019f9＋0.001f10－0.003f11＋0.679f12＋0.061f13－0.034f14＋0.286f15－0.217f16－0.086f17。根據(jù)以上表達(dá)式繪制二維散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖5～6。

圖5 35 批阿膠胰蛋白酶酶解物PCA 散點(diǎn)圖Fig.5 PCA score scatter plot for thirty?five batches of E’jiao trypsin enzymatic hydrolysate

同仁堂阿膠的散點(diǎn)相當(dāng)集中，東阿阿膠除S8、S11 外也比較集中，福牌阿膠及其他品牌阿膠較分散，與指紋圖譜及聚類分析結(jié)果保持一致；同仁堂阿膠在6個(gè)散點(diǎn)圖中都很集中，東阿阿膠除S1、S2、S3、S11，福牌阿膠除S19、S22 樣品偏離較大外均相對(duì)集中，其他3個(gè)品牌阿膠樣品較為分散。在散點(diǎn)圖A1～A2、A2～A4 可區(qū)分出東阿阿膠，A1～A3、A3～A4 中可區(qū)分出福牌阿膠，A2～A3 可以區(qū)分3 廠家阿膠、A1～A4 可以區(qū)分3 廠家與其他品牌阿膠?？梢钥闯觯瑬|阿阿膠及同仁堂阿膠的胰蛋白酶酶解物PCA分析相當(dāng)穩(wěn)定，而糜蛋白酶酶解物PCA分析則可根據(jù)具體鑒定需求，靈活選擇不同的二維投影方法以區(qū)分不同廠家產(chǎn)品。

圖6 35 批阿膠糜蛋白酶酶解物PCA 散點(diǎn)圖Fig.6 PCA score scatter plot for thirty?five batches of E’jiao chymotrypsin enzymatic hydrolysate

3 小結(jié)與討論

3個(gè)廠家的阿膠在糜蛋白酶酶解物色譜圖上展現(xiàn)出較高的一致性，有17～20個(gè)位置匹配數(shù)目達(dá)到最大，以最大匹配為基準(zhǔn)，在5.5、7.1、11.3、12.1、13.0、14.7、15.2、16.0、18.5、28.2、30.3、32.8、34.2 min 共13個(gè)位置處出現(xiàn)3 廠家阿膠糜蛋白酶酶解物共有峰；與對(duì)照指紋圖譜R比較的相似度上，所有樣品均＞0.9。表明采用糜蛋白酶酶解物的HPLC 指紋圖譜可以較好地作為阿膠質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。3個(gè)廠家的阿膠在胰蛋白酶酶解物色譜圖上則有一定差異，福牌阿膠的色譜峰與另外2 廠有較大區(qū)別。3 廠阿膠胰蛋白酶酶解物在5.5、6.2、7.2、9.0、20.1 min 共5個(gè)位置處存在共有峰，但福牌阿膠在10.1 min 處的大峰、18.6 min處的峰則有多數(shù)樣品不能與另外2 廠準(zhǔn)確匹配，且5.5 min 處峰信號(hào)明顯更強(qiáng)，在相似度上，S11 與S16 的相似度小于0.9，觀察色譜圖是由于S11 在10.1 min 處、S16 在5.5 min 的大峰峰面積明顯變小所致，但色譜圖其他位置的峰形與其他樣品保持一致。

聚類分析與PCA分析結(jié)果與其保持一致，胰蛋白酶酶解物聚類分析可作為同仁堂阿膠及東阿阿膠與福牌阿膠之間的鑒別法；而糜蛋白酶酶解物聚類分析則可將所有正品阿膠進(jìn)行聚類，以期作為區(qū)分正偽品的方法。

東阿阿膠及同仁堂阿膠胰蛋白酶酶解物PCA分析相當(dāng)穩(wěn)定，可考慮作為廠內(nèi)批穩(wěn)定性鑒別方法；糜蛋白酶酶解物PCA分析的不同二維投影可以作為區(qū)分不同廠家阿膠的方法。

本實(shí)驗(yàn)方法主要解決的是阿膠質(zhì)控上樣品信息不全面、易鉆漏洞，以及阿膠指紋圖譜困難等問(wèn)題。由于使用了雙酶解物樣品進(jìn)樣及指紋圖譜的方法（如糜蛋白酶酶解物有多達(dá)17個(gè)以上的特征峰），與單一指標(biāo)性成分檢測(cè)方法比較，摻假難度極大，對(duì)打擊混偽品有較大的應(yīng)用價(jià)值。