馬瓊艷張長(zhǎng)城楊 圓張 艷吳 杰袁 丁趙海霞

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌443002）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和生活環(huán)境的變化，人們生育觀念發(fā)生轉(zhuǎn)變，男性平均生育年齡不斷提高，但臨床研究顯示，隨著年齡增加睪丸生精功能逐漸衰退［1］。睪丸支持細(xì)胞與精子發(fā)生密切相關(guān)，而由相鄰支持細(xì)胞組成的緊密連接對(duì)生精細(xì)胞移行有重要作用，衰老可致睪丸支持細(xì)胞功能衰退和緊密連接損傷，造成睪丸生精功能障礙［2］。研究顯示，雄性大鼠缺 失 Occludin（閉鎖蛋白）或Claudin?11（緊密連接蛋白）基因［3］，不能形成完整的緊密連接，導(dǎo)致生精功能障礙；在睪丸支持細(xì)胞中，p38MAPK 可將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，與靶基因MMP?9 啟動(dòng)子結(jié)合，MMP?9 蛋白表達(dá)增加，從而降解緊密連接蛋白，破壞血睪屏障完整性［4］。因此，抑制衰老睪丸支持細(xì)胞p38MAPK／MMP?9 通路活化，可能是減輕衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接損傷的重要措施之一。

五子衍宗方是傳統(tǒng)補(bǔ)腎生精的代表方，由覆盆子、枸杞子、車前子、菟絲子、五味子5種中藥組成，具有調(diào)節(jié)支持細(xì)胞功能、改善睪丸生精功能等藥理作用，可改善男性不育癥患者精液質(zhì)量［5］，能通過改善支持細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)來顯著增加ZO?1 和Occludin 蛋白表達(dá)，進(jìn)而改善雷公藤多苷所致小鼠生精功能障礙［6］，還可通過下調(diào)p?p38MAPK 蛋白表達(dá)來改善環(huán)磷酰胺所致大鼠睪丸生精功能障礙［7］。方中枸杞多糖可通過降低血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP?9 活性，上調(diào)ZO?1、Occludin 蛋白表達(dá)，減輕細(xì)胞損傷［8］，但該方能否改善衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接損傷，機(jī)制是否與調(diào)節(jié)p38MAPK／MMP?9 通路相關(guān)尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)從改善衰老睪丸支持細(xì)胞緊密連接功能的角度，探討五子衍宗方改善衰老大鼠睪丸生精功能障礙的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 30 只2 月齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠喂養(yǎng)至16 月齡，另購(gòu)買10 只2 月齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，均購(gòu)買并分籠飼養(yǎng)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（鄂）2012?0001，自由飲水進(jìn)食，相對(duì)濕度（60±5）%，溫度（22±3）℃，12 h 晝夜交替環(huán)境。

1.2 試劑與藥物 五味子（批號(hào)15080702）、菟絲 子（批號(hào)15061901）、車前子（批號(hào)15063002）、枸杞子（批號(hào)15083002）、覆盆子（批號(hào)15071702）均購(gòu)于宜昌市中醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)三峽大學(xué)何毓敏博士鑒定為正品，并根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》 五子衍宗丸配方，稱取枸杞子400 g、菟絲子400 g、車前子100 g、覆盆子100 g、五味子50 g，充分混勻后打成細(xì)粉末，30 g 低劑量（1 g／kg）飼料中加入0.8 g 藥物，30 g 高劑量（4 g／kg）飼料中加入3.2 g 藥物，送往飼料廠加工。β?actin（貨號(hào)GB11001）、ZO?1（貨號(hào)21773?1?AP）購(gòu)于武漢谷歌生物技術(shù)有限公司；Claudin?11（貨號(hào)ab53041）購(gòu)于英國(guó) Abcam 公 司；Ocludin（貨號(hào)sc?5562）購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司；SOX?9（貨號(hào)AB5535）購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司；MMP?9（貨號(hào)10375?2?AP）、p?p38MAPK（貨號(hào)530056）購(gòu)于美國(guó)ZenBio 公司；山羊抗兔二抗購(gòu)于武漢科瑞生物有限公司；Alexa Fluor 594 驢抗兔IgG（H＋L）（貨號(hào)140019）、Alexa Fluor 488 驢抗兔IgG（H＋L）（貨號(hào)140422）購(gòu)于美國(guó)Jackson Immuno Research 公司；ECL 顯影液購(gòu)于武漢谷歌生物科技公司。

1.3 儀器 Power Pas Basic200 Western blot 電泳儀購(gòu)于美國(guó)Bio?Rad 公司；A1R＋激光共聚焦顯微鏡購(gòu)于日本Nikon 公司；IX53 倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本Olympus 公司；TP 102 自動(dòng)脫水機(jī)、EG 1150C 超薄切片機(jī)、EG 1150H 石蠟包埋機(jī)購(gòu)于德國(guó)Leica 公司。

2 方法

2.1 分組與給藥 30 只大鼠隨機(jī)分為衰老模型組、五子衍宗方低劑量組（1 g／kg）、五子衍宗方高劑量組（4 g／kg），另取2 月齡SD 雄性大鼠作為青年對(duì)照組，每組10 只。依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》 五子衍宗丸的成人日服用量，通過大鼠、成人體質(zhì)量面積換算，確定低、高劑量組大鼠分別給予1、4 g／kg 含藥飼料喂養(yǎng)，青年對(duì)照組、衰老模型組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，給藥4個(gè)月后麻醉處死大鼠，取出睪丸組織備用。

2.2 睪丸組織形態(tài)變化觀察 取各組大鼠睪丸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟，HE 染色，透明，晾干，中性樹脂封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。去除睪丸組織病變和HE 染色異常編號(hào)后，每組取7～8個(gè)樣本，在光鏡下取40 倍圖片6～7 張，采用Image J 軟件測(cè)定每個(gè)生精小管的生精上皮厚度和生精小管直徑，計(jì)數(shù)200個(gè)以上者，取平均值。

2.3 睪丸支持細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)觀察 取經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定的大鼠睪丸組織，切成薄片狀后置于2.5%戊二醛固定液中固定，PBS 漂洗3次，1%鋨酸固定液中固定2 h，PBS 漂洗3 次，組織梯度脫水（50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、無水乙醇15 min、無水乙醇＋丙酮溶液和丙酮溶液中各15 min），置于丙酮＋環(huán)氧樹脂包埋劑（1∶1）中，烘烤5 h 使丙酮揮發(fā)，再置于包埋盒中，放到60 ℃烘箱中使包埋劑充分固化，置于超薄切片機(jī)上進(jìn)行超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鋁雙重染色后在電鏡下觀察支持細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)變化。

2.4 睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)檢測(cè) 稱取20～30 mg 大鼠睪丸組織，按RIPA 裂解液與PMSF 100∶1 的比例提取總蛋白，BCA 法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，在上清液中按4∶1 比例加入蛋白上樣緩沖液，置于沸水浴中加熱變性10 min，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，超敏ECL 顯影液進(jìn)行顯影，Image Pro Plus 軟件進(jìn)行分析，以β?actin 為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白條帶與內(nèi)參照的灰度比值。剔除病變組織編號(hào)樣本后，將每組剩余7～8個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次，取平均值。

2.5 睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白ZO?1、Occludin、Claudin?11、p?p38MAPK 表達(dá)和定位檢測(cè) 取大鼠睪丸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟，高壓修復(fù)10 min，待冷卻完全后滴加5% BSA 封閉組織60～90 min，再滴加0.03% Triton X?100＋PBS 稀釋的一抗，4 ℃下孵育過夜，滴加相應(yīng)二抗，室溫下孵育1 h，DAPI 染核10 min，滴加適量抗熒光淬滅封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組樣本目的蛋白表達(dá)與定位，拍照取圖。剔除病變組織樣本后，每組取5個(gè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)隨機(jī)取400 倍下10個(gè)視野，觀察大約200個(gè)睪丸支持細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，通過Image Pro Plus 軟件進(jìn)行相對(duì)熒光強(qiáng)度分析，重復(fù)3 次，取平均值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過Graphpad Prism7.0、Image pro plus 6.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸組織形態(tài)的影響 如圖1 所示，青年對(duì)照組大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)良好；與青年對(duì)照組比較，衰老模型組大鼠生精小管間縫隙增大，生精細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂；五子衍宗方組可改善衰老大鼠生精小管間隙，增加生精細(xì)胞數(shù)量。與青年對(duì)照組比較，衰老模型組大鼠睪丸生精上皮厚度和生精小管直徑下調(diào)（P＜0.01），五子衍宗方高劑量可上調(diào)兩者（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸組織形態(tài)的影響（， n＝7）Fig.1 Effects of Wuziyanzong Recipe on the morphologies of testicular tissues of aging rats（， n＝7）

3.2 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖2 所示，青年對(duì)照組大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接完整，邊界清晰；與青年對(duì)照組比較，衰老模型組大鼠睪丸支持細(xì)胞間緊密連接縫隙增大，連接松散，緊密連接斷裂，邊界不清晰；與衰老模型組比較，五子衍宗方組可縮小緊密連接間縫隙，減少緊密連接斷裂，保持緊密連接邊界清晰，進(jìn)而改善衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)。

圖2 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of Wuziyanzong Recipe on the ultrastructure of Sertoli cells tight junctions in aging rats

3.3 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白ZO?1、Occludin 表達(dá)的影響 如圖3 所示，與青年對(duì)照組比較，衰老模型組大鼠睪丸支持細(xì)胞ZO?1、Occludin 表達(dá)降低（P＜0.01），而五子衍宗方組可上調(diào)兩者表達(dá)（P＜0.01）。

圖3 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白ZO?1、Occludin 表達(dá)的影響（， n＝3）Fig.3 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expressions of ZO?1 and Occludin in Sertoli cells in aging rats（， n＝3）

3.4 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白ZO?1 表達(dá)和定位的影響 如圖4 所示，青年對(duì)照組大鼠睪丸組織中ZO?1 主要呈線狀分布于支持細(xì)胞周圍；與青年對(duì)照組比較，衰老模型組大鼠ZO?1 表達(dá)降低（P＜0.01），僅在支持細(xì)胞周圍呈點(diǎn)狀分布，而五子衍宗方高劑量可上調(diào)其表達(dá)（P＜0.05）。

圖4 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白ZO?1 表達(dá)和定位的影響（， n＝4）Fig.4 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of ZO?1 in Sertoli cells in aging rats（， n＝4）

3.5 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin 表達(dá)和定位的影響 如圖5 所示，青年對(duì)照組大鼠睪丸組織中Occludin 呈線性表達(dá)于支持細(xì)胞之間和支持細(xì)胞與生精細(xì)胞間；與青年對(duì)照組比較，衰老模型組大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），而五子衍宗方可上調(diào)其表達(dá)（P＜0.01）。

圖5 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin 表達(dá)和定位的影響（， n＝4）Fig.5 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of Occludin in Sertoli cells in aging rats（，n＝4）

3.6 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin?11 表達(dá)和定位的影響 如圖6 所示，青年對(duì)照組大鼠睪丸組織中Claudin?11 呈線狀分布于支持細(xì)胞周圍；與青年對(duì)照組比較，衰老模型組大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin?11 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），而五子衍宗方高劑量可上調(diào)其表達(dá)（P＜0.05）。

圖6 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠支持細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin?11 表達(dá)和定位的影響（， n＝4）Fig.6 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of Claudin?11 in Sertoli cells in aging rats（， n＝4）

3.7 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞p?p38MAPK 表達(dá)和定位的影響 如圖7 所示，青年對(duì)照組大鼠睪丸支持細(xì)胞核內(nèi)p?p38MAPK 僅有少量表達(dá)；與青年對(duì)照組比較，衰老模型組大鼠支持細(xì)胞p?p38MAPK 表達(dá)升高（P＜0.01），而五子衍宗方可降低其表達(dá)（P＜0.01）。

圖7 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞p?p38MAPK 表達(dá)和定位的影響（， n＝3）Fig.7 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of p?p38MAPK in Sertoli cells in aging rats（， n＝3）

3.8 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸MMP?9 和Occludin 表達(dá)和共定位的影響如圖8 所示，MMP?9 定位于生精細(xì)胞與支持細(xì)胞間和生精細(xì)胞與生精細(xì)胞間；與青年對(duì)照組比較，衰老模型組大鼠MMP?9 表達(dá)增加，而且MMP?9 與Occludin 共定位增多；五子衍宗方組可下調(diào)其表達(dá)，降低兩者共定位表達(dá)。

圖8 五子衍宗方對(duì)衰老大鼠睪丸組織MMP?9 和Occludin 表達(dá)和共定位的影響Fig.8 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and co?localization of MMP?9 and Occludin in testicular tissue in aging rats

4 討論

隨著年齡的增長(zhǎng)，睪丸組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上均會(huì)出現(xiàn)退行性變化，進(jìn)而導(dǎo)致生精功能衰退［2］。研究發(fā)現(xiàn)，五子衍宗方可通過減輕生精小管萎縮和各級(jí)生精細(xì)胞脫落，改善睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而減輕醋酸棉酚對(duì)大鼠睪丸生殖功能的損傷［9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，五子衍宗方可抑制生精細(xì)胞凋亡，從而改善衰老大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，五子衍宗方可改善衰老大鼠睪丸組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，顯著上調(diào)生精小管直徑和生精上皮的厚度。

血睪屏障是存在于睪丸支持細(xì)胞之間由連接復(fù)合體組成的特殊結(jié)構(gòu)，為精子發(fā)生提供良好的生精微環(huán)境。已知緊密連接是血睪屏障的重要組成部分，主要由ZO 家族、Claudin 和Occludin 家族組成，在精子發(fā)生過程中精母細(xì)胞須穿過緊密連接進(jìn)入近腔室，才能進(jìn)一步分化為成熟的精子；若緊密連接功能被破壞，血睪屏障的通透性異常，精母細(xì)胞不能正常進(jìn)入近腔室進(jìn)行發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致生精功能障礙。我們前期研究顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)大鼠睪丸組織內(nèi)Occludin 蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，血睪屏障被破壞，生精功能受損［11］；另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)支持細(xì)胞Claudin?11 和Occludin 基因沉默后，支持細(xì)胞不能形成完整的緊密連接［3］。已知ZO?1 是緊密連接的主要銜接蛋白，與Occludin 和Claudin?11 定位于生精小管基底部，共同形成緊密連接。SOX9基因可在哺乳動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，可將其作為支持細(xì)胞的特異性標(biāo)記物［12］。研究顯示，五子衍宗方可通過改善支持細(xì)胞骨架蛋白波形蛋白的表達(dá)，改善支持細(xì)胞功能，進(jìn)而減輕雷公藤多苷對(duì)大鼠的生精功能損傷［13］；還可通過維持大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接功能，減輕支持細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高支持細(xì)胞熱應(yīng)激的能力［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，五子衍宗方可改善衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)，顯著上調(diào)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白ZO?1、Occludin 和Claudin?11 的表達(dá)。以上結(jié)果證實(shí)，五子衍宗方可通過改善衰老支持細(xì)胞緊密連接損傷，延緩衰老大鼠睪丸生精功能衰退。

p38MAPK／MMP?9 通路與支持細(xì)胞緊密連接損傷相關(guān)［15］。研究顯示，脫敏煎通過下調(diào) p?p38MAPK 蛋白表達(dá)，上調(diào)Occludin 蛋白表達(dá)，減輕TGF?β1 誘導(dǎo)的睪丸支持細(xì)胞緊密連接損傷［16］；黃芪甲苷可通過下調(diào)p?p38MAPK 蛋白表達(dá)，上調(diào)Occludin、ZO?1 和Claudin?11 的表達(dá)，維持支持細(xì)胞緊密連接的完整性，進(jìn)而改善鎘所致大鼠睪丸生殖毒性［17］。加味五子 衍宗方可 通過抑制 p?p38MAPK 蛋白表達(dá)減輕β 淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷［18］。另有研究顯示，在脂多糖誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中，p38MAPK和MMP?9 mRNA 表達(dá)上調(diào)，Occludin和ZO?1 mRNA 表達(dá)下調(diào)，在加入MMP?9 抑制劑后，可上調(diào)Occludin表達(dá)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，五子衍宗方可下調(diào)衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞p?p38MAPK 蛋白表達(dá)，下調(diào)睪丸組織MMP?9 蛋白表達(dá)，降低MMP?9 和Occludin 共定位的表達(dá)。這提示五子衍宗方可能通過抑制p38MAPK／MMP?9 通路活化，從而減輕睪丸支持細(xì)胞緊密連接損傷，延緩衰老大鼠睪丸生精功能衰退。

綜上所述，五子衍宗方可通過抑制p38MAPK／MMP?9 通路的活化，減輕衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接損傷，進(jìn)而延緩衰老大鼠睪丸生精功能衰退。以期為五子衍宗方治療衰老睪丸生精功能衰退提供了新的研究思路。