李 淼,李 梅

(山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心 國(guó)家輔助生殖與優(yōu)生工程技術(shù)研究中心 生殖內(nèi)分泌教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東省生殖健康臨床醫(yī)學(xué)研究中心 山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，濟(jì)南 250012)

疾病診斷治療技術(shù)的不斷發(fā)展極大提高了惡性腫瘤患者的生存率，生存期也在逐年延長(zhǎng)。以手術(shù)治療為主，放、化療技術(shù)為輔的惡性腫瘤治療方式會(huì)對(duì)女性患者的卵巢組織造成損傷，而卵巢組織的損傷一旦發(fā)生就不可逆轉(zhuǎn)。損傷后的卵巢組織喪失內(nèi)分泌及正常排卵功能，造成患者無(wú)法自然妊娠，治療后生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全世界范圍內(nèi)每年新增41.7萬(wàn)例兒童青少年(0～19歲)惡性腫瘤患者[1-2]。對(duì)于青春期前的女性腫瘤患者，卵巢組織冷凍是唯一適合的生育力保存方法。凍融后的卵巢組織移植回患者體內(nèi)可恢復(fù)相應(yīng)的內(nèi)分泌功能，恢復(fù)月經(jīng)周期，提高治療后生活質(zhì)量。即使不能移植回體內(nèi)，保存的原始卵泡也有望通過(guò)體外成熟培養(yǎng)技術(shù)和輔助生殖技術(shù)幫助患者生育屬于自己的遺傳學(xué)后代[3]。

卵巢組織冷凍是女性生育力保存的重要方式，而冷凍技術(shù)是低溫保存成功與否的關(guān)鍵，提高冷凍保存效率，提高卵泡存活率一直是低溫生物學(xué)研究的重中之重?，F(xiàn)就卵巢組織玻璃化冷凍相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述分析。

1 卵巢組織冷凍保存的發(fā)展概況

早在20世紀(jì)50年代，人們就開(kāi)始了卵巢組織冷凍技術(shù)的研究。2004年，比利時(shí)學(xué)者Donnez首次報(bào)道了冷凍卵巢組織成功獲得臨床分娩，1例柯杰金淋巴瘤患者在卵巢組織冷凍復(fù)蘇自體移植后成功活產(chǎn)一嬰兒[4]。截止目前，已報(bào)道卵巢組織冷凍復(fù)蘇移植后出生的嬰兒至少130例[5]，其中5例為玻璃化冷凍組織移植后獲得[6-7]。

程序化慢速冷凍技術(shù)在冷凍保存卵巢組織的應(yīng)用中已相對(duì)成熟，但有操作復(fù)雜、易形成冰晶造成冷凍損傷、依賴(lài)于昂貴儀器等缺點(diǎn)。隨著低溫生物學(xué)的發(fā)展，更有效的冷凍保護(hù)劑出現(xiàn)，使得卵巢組織冷凍技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展，如玻璃化冷凍技術(shù)的出現(xiàn)。玻璃化冷凍的優(yōu)勢(shì)是快速、便捷，冷凍過(guò)程中不形成冰晶。過(guò)去幾十年，大量研究表明玻璃化冷凍技術(shù)是一種有效的卵巢組織冷凍技術(shù)，但仍有許多待完善的細(xì)節(jié)[8-11]。玻璃化冷凍技術(shù)在冷凍保護(hù)劑的種類(lèi)以及濃度、平衡時(shí)間、冷凍方法、冷凍載體等諸多細(xì)節(jié)方面需進(jìn)一步完善[9]。找到一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、高效的玻璃化冷凍方案成為低溫生物學(xué)家及臨床實(shí)驗(yàn)室共同努力的目標(biāo)。

2 卵巢組織玻璃化冷凍

2.1 常用冷凍保護(hù)劑 一般冷凍保護(hù)劑分為兩大類(lèi)：滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑。常見(jiàn)的滲透性保護(hù)劑有乙二醇(EG)、丙二醇(PROH)、二甲基亞砜(DMSO)等，可透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。非滲透性保護(hù)劑包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖等大分子物質(zhì)，不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。玻璃化冷凍保護(hù)劑常選用上述兩類(lèi)保護(hù)劑同時(shí)使用，如EG、DMSO和蔗糖等[11]。

2.2 玻璃化冷凍方法及效果評(píng)價(jià) 玻璃化是指水或冷凍保護(hù)劑快速降溫而形成的一種介于固態(tài)、液態(tài)之間的高黏度、非晶態(tài)的玻璃化狀態(tài)。玻璃化冷凍技術(shù)的基本原理就是用高濃度的冷凍保護(hù)劑溶液將細(xì)胞內(nèi)水分置換出來(lái)，經(jīng)急速降溫由液態(tài)轉(zhuǎn)化為外形似玻璃狀的非晶體狀固體狀態(tài)。這一狀態(tài)的變化無(wú)冰晶形成，，避免了冰晶形成對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)膜及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的損傷，但是高濃度的保護(hù)劑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性。保護(hù)劑的滲透效率很大程度上決定了冷凍效果，因此組織大小、保護(hù)劑濃度、平衡時(shí)間等因素是影響玻璃化冷凍效果的重要因素。目前文獻(xiàn)報(bào)道中大部分卵巢皮質(zhì)組織被處理成厚約1～2mm的片狀組織[8-11]。

Fabbri等[10]采用程序慢速降溫冷凍和玻璃化冷凍(2mol/LPROH、3mol/L EG、0.2mol/L蔗糖、15% HSA 4℃平衡30min，3mol/LPROH、5mol/LEG、0.5mol/L蔗糖、15% HSA 4℃平衡30min后放入液氮)兩種方法凍存6例患者卵巢組織，復(fù)蘇后分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并比較，發(fā)現(xiàn)玻璃化組的卵泡以及基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)優(yōu)于程序冷凍組。Zhao等[11]發(fā)現(xiàn)，玻璃化組間質(zhì)細(xì)胞凋亡低于程序冷凍組，而兩組的初始卵泡形態(tài)學(xué)、卵泡凋亡率無(wú)顯著差異。但是，張娜等[12]檢測(cè)血管生成素-2(Ang-2)表達(dá)，探討兩種冷凍方法對(duì)人卵巢組織的凍融及異種移植后的效果，發(fā)現(xiàn)與玻璃化冷凍相比，程序化冷凍對(duì)人卵巢組織始基卵泡顆粒細(xì)胞Ang-2的表達(dá)影響更小。由于卵巢組織細(xì)胞的多樣性、玻璃化冷凍方案不同等原因，需大量實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地比較兩種冷凍方法，完善玻璃化冷凍細(xì)節(jié)。

玻璃化冷凍方法大致分為兩步：平衡和冷凍。Chang等[13]僅用20% EG作為冷凍保護(hù)劑，室溫下分別平衡5min、10min、20min后玻璃化冷凍，復(fù)蘇后觀察比較卵泡、基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)10min組優(yōu)于其它兩組。此外，Keros等[14]對(duì)平衡時(shí)間(5、10min)亦做了相關(guān)研究，10min組各種細(xì)胞存活率以及形態(tài)學(xué)表現(xiàn)優(yōu)于其它組。由此可見(jiàn)，平衡時(shí)間影響玻璃化冷凍效果，平衡10min可使保護(hù)劑充分滲透進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)又不會(huì)造成嚴(yán)重的細(xì)胞毒性損傷。

Xiao等[15]研究了相同的平衡條件、相同的保護(hù)劑成分(EG、DMSO、蔗糖)下，不同的濃度(15%、13.5%、12%)對(duì)玻璃化冷凍結(jié)果的影響，結(jié)果表明運(yùn)用浸潤(rùn)針作為載體，12%低濃度組的組織形態(tài)學(xué)結(jié)果、細(xì)胞凋亡水平、組織損傷程度等方面優(yōu)于高濃度組。同時(shí)，Zeng等[16]采用低濃度的冷凍保護(hù)劑(1.5mol/L EG、1.5mol/LDMSO、0.5mol/L蔗糖)玻璃化冷凍人卵巢組織，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇后組織具有更完整的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)、較高卵泡存活率、低細(xì)胞凋亡率，可更好地保存組織。此外，韓瑩等[17]提出了低濃度的DMSO聯(lián)合EG作為保護(hù)劑凍存卵巢組織、對(duì)卵巢組織損傷最小的觀點(diǎn)。由于EG具有較低的細(xì)胞毒性和較高的滲透效率等特性，常被用作玻璃化冷凍保護(hù)劑。合適的冷凍保護(hù)劑可良好地保存組織生物形態(tài)以及生理功能，最大程度降低冷凍損傷。

目前用于玻璃化冷凍的載體種類(lèi)有很多，大致分為封閉式和開(kāi)放式。封閉式載體可避免組織直接接觸液氮，但降溫速率較慢。常用的玻璃化冷凍載體多為開(kāi)放式，組織與液氮直接接觸，可實(shí)現(xiàn)快速降溫，但是存在液氮污染的風(fēng)險(xiǎn)。適宜的冷凍載體可以提高熱交換速率，減少玻璃化冷凍液體積，使組織塊迅速、均勻地降溫，同時(shí)又能減少冷凍保護(hù)劑用量以降低細(xì)胞毒性。為了改善玻璃化冷凍效果、提高降溫速率，學(xué)者們比較了多種冷凍載體的凍存效果。Amorim等[18]采用兩種不同冷凍載體(預(yù)冷的固體表面和麥管)玻璃化冷凍7例患者的卵巢組織，分別比較研究組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖和凋亡等方面，上述兩種載體均能有效的保存各階段卵泡并實(shí)現(xiàn)卵泡再發(fā)生，但麥管組更能完好地保存初始卵泡。鄭軼等[19]亦做了相關(guān)研究，比較3種不同載體(針浸潤(rùn)玻璃化冷凍組、表面玻璃化冷凍組和直接覆蓋玻璃化冷凍組)對(duì)卵巢組織玻璃化冷凍的影響，形態(tài)學(xué)統(tǒng)計(jì)始基卵泡存活率(分別為88.14%，80.00%，81.25%，P>0.05)，三種載體均能較好地保存卵巢組織，但針浸潤(rùn)組的凍存效果明顯優(yōu)于其它兩組。針浸潤(rùn)載體是目前最常用的開(kāi)放式載體。

玻璃化冷凍成功的關(guān)鍵在于保護(hù)劑滲透效率、細(xì)胞毒性及降溫速率。保護(hù)劑濃度、平衡時(shí)間、樣本組織大小及厚度與保護(hù)劑滲透效率密切相關(guān)。目前玻璃化冷凍方法多采用低濃度冷凍保護(hù)劑DMSO、EG聯(lián)合蔗糖平衡1～2mm厚度的皮質(zhì)組織10min，去除多余平衡液后，使用針浸潤(rùn)載體放入液氮內(nèi)冷凍保存。

3 冷凍效果評(píng)價(jià)方法

3.1 組織學(xué)觀察 卵巢組織的組織學(xué)觀察是指新鮮或凍融后的卵巢組織經(jīng)固定，制成切片，染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察其組織結(jié)構(gòu)、卵泡形態(tài)，比較凍融前后不同階段卵泡分布比例及其結(jié)構(gòu)的變化，是直接有效地顯示卵巢組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的指標(biāo)。此外，根據(jù)相關(guān)評(píng)分規(guī)定對(duì)卵泡形態(tài)進(jìn)行評(píng)定[14]，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞無(wú)明顯退化，顆粒細(xì)胞排列規(guī)則、無(wú)脫落，基底膜完整則被認(rèn)為是完整的卵泡。最常用的組織染色是蘇木精-伊紅染色，其操作簡(jiǎn)單，指示準(zhǔn)確，可觀察卵細(xì)胞的各種形態(tài)變化，是使用最廣泛的方法。Almodin等[20]觀察比較了玻璃化凍融后組織與新鮮組織的卵泡形態(tài)，發(fā)現(xiàn)兩者形態(tài)學(xué)之間無(wú)顯著差異。此外，亦有研究發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍與程序冷凍兩種方法在此方面無(wú)明顯差別[12,21]。此外，組織經(jīng)固定后，于透射電鏡下可觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)(細(xì)胞核、線粒體、溶酶體等)，即使光學(xué)顯微鏡下顯示組織學(xué)正常的始基卵泡內(nèi)仍存在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。免疫熒光顯微鏡可通過(guò)不同的顏色變化，明顯地判定細(xì)胞是否存活。光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡聯(lián)合運(yùn)用可更有效地評(píng)判卵巢組織冷凍后組織細(xì)胞的形態(tài)完整以及功能狀態(tài)。

3.2 原始卵泡的DNA 碎片細(xì)胞內(nèi)DNA碎片率也是一種評(píng)估細(xì)胞完整性的方法。Sanfulippo等[22]分析玻璃化冷凍組、慢速冷凍組凍融后組織的原始卵泡內(nèi)DNA碎片比例(分別為20.8%、31.3%)，并與新鮮卵巢組織(35%，P>0.05)比較，無(wú)顯著差異。Xiao等[15,23]研究觀察發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍的卵泡內(nèi)DNA片段完整性高于慢速冷凍。基于DNA片段完整性此項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，目前尚無(wú)法明確評(píng)判玻璃化冷凍與慢速冷凍孰優(yōu)孰劣，仍需大量樣本進(jìn)行研究。

3.3 移植卵巢 移植的目的是重新啟動(dòng)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，恢復(fù)內(nèi)源性性激素的周期性釋放，恢復(fù)卵巢功能，恢復(fù)患者生育能力。卵巢移植大致有兩種方式：一種是無(wú)血管吻合的卵巢組織移植，操作簡(jiǎn)便；另一種是帶血管蒂的卵巢移植，手術(shù)過(guò)程復(fù)雜，微血管吻合技術(shù)要求高。目前多采用無(wú)血管吻合的卵巢組織皮質(zhì)片移植。根據(jù)移植位置，卵巢組織移植又分為異位自體移植和原位移植。目前，2例患者異位移植卵巢組織并成功活產(chǎn)，其他活產(chǎn)患者均為原位移植[22]。異位移植多數(shù)移植于腹膜袋內(nèi)，靠近輸卵管端，組織的皮質(zhì)面面向腹腔，有利于后期卵子成熟并排出。2000年,Oktay[24]報(bào)道了第1例異位移植于腹膜袋患者，15周后卵泡生長(zhǎng)并排卵。2004年Donnez等[4]報(bào)道了凍融后卵巢組織原位移植后成功實(shí)現(xiàn)活產(chǎn)。Suzuki等[7]玻璃化冷凍POI患者卵巢組織，復(fù)蘇后自體移植，2例成功活產(chǎn)。凍融后的卵巢組織移植后能恢復(fù)內(nèi)分泌功能、實(shí)現(xiàn)卵泡生長(zhǎng)是評(píng)價(jià)冷凍方法至關(guān)重要的標(biāo)準(zhǔn)。針對(duì)腫瘤患者而言，卵巢組織移植存在腫瘤細(xì)胞再種植的風(fēng)險(xiǎn)。凍存前應(yīng)對(duì)組織進(jìn)行充分的組織學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)評(píng)估。

3.4 中性紅染色 中性紅染色液(0.1%，常規(guī)染色)是一種組織或細(xì)胞染色時(shí)常用的可將細(xì)胞核染成紅色的染色液，常用于組織或細(xì)胞染色中細(xì)胞核的紅色復(fù)染。中性紅作為活細(xì)胞染料可很好地檢測(cè)卵巢組織中卵泡的存活情況，有利于直觀快速評(píng)價(jià)移植前的卵巢組織卵泡存活狀態(tài)。新鮮或冷凍復(fù)蘇后的卵巢組織用切片機(jī)切割，切至泥狀，中性紅染色后在倒置顯微鏡下觀察。相比于臺(tái)盼藍(lán)，只能對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色，中性紅染色更能直觀表現(xiàn)組織細(xì)胞的存活率，并對(duì)組織細(xì)胞后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)損傷[25]。

除上述方法外，我們還可采用放射性免疫法或電化學(xué)發(fā)光法監(jiān)測(cè)凍融后的卵巢組織在體外培養(yǎng)液中E2、P、T等內(nèi)分泌激素濃度的變化，以此來(lái)揭示卵巢組織內(nèi)分泌功能是否恢復(fù)，是卵巢組織功能正常的間接指示。從凍融后的卵巢組織內(nèi)分離出卵泡，體外培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察其發(fā)育生長(zhǎng)情況是評(píng)價(jià)冷凍效果的重要指標(biāo)。上述兩種方法均存在培養(yǎng)周期較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。此外，細(xì)胞凋亡DNA檢測(cè)，如TUNEL，亦是卵巢組織移植的重要指標(biāo)之一。目前評(píng)價(jià)卵巢組織冷凍效果的方法很多，選擇直觀簡(jiǎn)單有效的方法可縮短實(shí)驗(yàn)周期。

4 小 結(jié)

目前，玻璃化冷凍具有快捷便利、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在卵巢組織凍存方面應(yīng)用越來(lái)越廣泛。研究表明，玻璃化冷凍比慢速冷凍更有利于保存卵巢組織，但仍存在待完善的問(wèn)題。需探索一套規(guī)范高效安全的冷凍方案，進(jìn)一步開(kāi)展玻璃化冷凍的應(yīng)用及研究，針對(duì)卵巢組織的移植及體外培養(yǎng)進(jìn)行更廣泛深入的研究，以為臨床應(yīng)用提供更多有力的證據(jù)。隨著冷凍技術(shù)的不斷發(fā)展，卵巢組織玻璃化冷凍方案必定趨于完善，未來(lái)也必定有更廣闊的應(yīng)用前景。