郝瑞瑞龐 菲靳洪濤

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,新藥安全評價研究中心,北京 100050;2.北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司,北京 100176)

過敏反應(yīng)是一種Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),就目前的認(rèn)識而言,其發(fā)生機(jī)制主要為兩種,一種是以IgE抗體為主參與的IgE依賴性過敏反應(yīng),另一種是有IgG抗體參與的非IgE依賴性過敏反應(yīng)[1-2]。IgE依賴性過敏反應(yīng)發(fā)生分為2個階段,致敏階段:抗原初次進(jìn)入機(jī)體,刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫球蛋白 E(Immunoglobulin E,IgE)抗體,與體內(nèi)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面IgE高親和力Fc受體(FcεRI)結(jié)合;激發(fā)階段:當(dāng)致敏階段相同的抗原再次刺激機(jī)體時,抗原與IgE抗體的Fab段結(jié)合,兩個或兩個以上IgE抗體交聯(lián),進(jìn)而FcεRI發(fā)生微集聚,啟動肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞活化,釋放已儲存與新合成的生物活性物質(zhì),這些生物活性物質(zhì)會造成平滑肌收縮、腺體分泌增加、毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加等一系列效應(yīng)[3]。IgG抗體引起的過敏反應(yīng)與IgE引起的被動全身皮膚過敏反應(yīng)(PSA)相似,主要是低溫、血管擴(kuò)張和心肺變化。其發(fā)生機(jī)制是在抗原進(jìn)入機(jī)體后,刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG抗體,IgG抗體與嗜堿性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面IgG高親和力Fc受體(FcγR)形成交聯(lián),進(jìn)而啟動上述細(xì)胞活化,釋放血小板活化因子(PAF)、半胱氨酰白三烯(CysLTs),進(jìn)而引發(fā)全身過敏反應(yīng)[1]。根據(jù)2013年世界變態(tài)反應(yīng)組織白皮書[4],全球過敏性疾病的患病率約為10%~40%,其中有3億支氣管哮喘患者、4億過敏性鼻炎患者、1.5億藥物過敏患者以及大量蕁麻疹、濕疹、結(jié)膜炎、血管神經(jīng)性水腫、昆蟲過敏、結(jié)膜炎、過敏性休克患者。隨著城市化、工業(yè)化進(jìn)程的不斷加快,過敏性疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[5],因此,過敏性疾病探索研究與有效治療對于提高人類生存質(zhì)量顯得尤為重要。在過敏性疾病研究中,模型的構(gòu)建極為重要。但當(dāng)前對于過敏性疾病體內(nèi)、體外模型構(gòu)建進(jìn)行系統(tǒng)的總結(jié)、評價性文章并不多見,因此,本文分別從皮膚、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、藥物過敏不同系統(tǒng)過敏性疾病以及體內(nèi)外模型造模方式相結(jié)合的角度出發(fā),分別闡述并評價目前研究中所應(yīng)用的各種不同模型的構(gòu)建方法、優(yōu)勢與不足,以期對過敏性疾病研究模型的構(gòu)建提供一定的啟發(fā)與幫助。

1 皮膚及其附件過敏性疾病模型

皮膚及其附件癥狀是機(jī)體發(fā)生過敏反應(yīng)后最常見的表現(xiàn)之一,包括皮膚瘙癢、泛紅、水腫、疼痛等炎癥反應(yīng)。皮膚過敏癥狀大多是由直接接觸藥物、粉塵等過敏原或紫外線照射等原因造成的,但也存在機(jī)體其他器官系統(tǒng)發(fā)生過敏反應(yīng)后表現(xiàn)為皮膚癥狀[6-7]。皮膚及其附件的過敏癥狀原因不是單一的,在建模過程中,要根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇最適模型。皮膚及其附件過敏型疾病模型主要分為兩大類,一是通過注射變應(yīng)原引起皮膚過敏反應(yīng)的相關(guān)模型,二是變應(yīng)原通過直接接觸引起的皮膚過敏反應(yīng)模型。

1.1 被動皮膚過敏反應(yīng)模型

4-氨基吡啶(4-AP)致敏皮膚瘙癢模型[8]:KM小鼠背部皮下注射1 mL 4-AP(0.2 mg/kg),每隔10 min記錄用藥部位的舔舐頻率,使用舔舐頻率來表示小鼠背部皮膚的瘙癢程度。組胺誘導(dǎo)足腫脹模型[8]:KM小鼠右足皮下注射20μg/kg組胺生理鹽水(0.25 mg/kg),分別于注射15 min和60 min后用千分尺測定小鼠右足厚度,用注射組胺前后小鼠右足厚度差來表示腫脹度。角叉菜堿誘導(dǎo)小鼠皮下組織炎癥反應(yīng)[9]:將角叉菜堿(每爪300μg)注射到ICR小鼠右后爪的足底表面,使用機(jī)械撤退閾值反應(yīng)皮下組織炎癥嚴(yán)重程度。蜱幼蟲提取物誘導(dǎo)綿羊耳部皮膚過敏模型[10]:雌性綿羊在蜱蟲出沒的天然草原牧場放牧,推測其已預(yù)先致敏,測量每只綿羊耳朵厚度,并在每只綿羊右耳上側(cè)距耳緣1 cm處皮內(nèi)注射蜱幼蟲提取物制劑0.1 mL。分別在接種后1、6、24、48和72 h用電子卡尺測量母羊個體耳厚。蜱幼蟲提取物誘導(dǎo)Nguni牛皮膚超敏反應(yīng)模型[11]:小牛提前1個月在已知有蜱蟲出沒的天然牧場上放牧。小牛左耳剃毛區(qū)域皮內(nèi)注射蜱幼蟲提取物,測量耳厚度。完全弗氏佐劑誘導(dǎo)大鼠后爪炎模型[12]:雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠左后爪皮下注射50μL完全弗氏佐劑。通過爪式熱刺激系統(tǒng)測定熱敏性,從而判定炎癥程度。

上述幾種模型造模思路清晰簡單,但是通過舔舐頻率與耳足厚度來評估過敏反應(yīng)嚴(yán)重程度只能簡單定性,而無法精確定量反應(yīng)過敏原所引起過敏反應(yīng)程度,需要更加精確的定量模型。

耳被動皮膚過敏反應(yīng)模型[8]:KM小鼠雙耳皮下注射1∶10抗卵白蛋白血清(OVA)20μL,72 h后尾靜脈注射含OVA的伊文思藍(lán)溶液。30 min后頸椎脫位法處死小鼠,剪下耳廓藍(lán)色部分,加入0.75 mL 1 N KOH溶液,37℃過夜消化后加入3.5 mL 0.6 N磷酸溶液和丙酮混合物(按5∶13比例混合),用渦旋機(jī)搖床提取,離心,并于640 nm處測定光密度。DNP-人血清白蛋白(DNP-HSA)誘導(dǎo)小鼠耳被動皮膚過敏模型[13]:5周齡雌性BALB/c小鼠,DNP-IgE皮內(nèi)注射入耳致敏,24 h后,DNP-HAS的0.5%伊文思藍(lán)溶液100μL尾靜脈注射激發(fā)。30 min后,伊文思藍(lán)染色程度表示小鼠耳部皮膚反應(yīng)嚴(yán)重程度。甲酰胺63℃隔夜孵育提取伊文思藍(lán),595 nm處測定吸光度。抑制率=(對照組藍(lán)斑直徑-實驗組藍(lán)斑直徑)/對照組藍(lán)斑直徑×100%。弗氏完全佐劑誘導(dǎo)小鼠背部皮膚過敏模型[14-15]:6~8周齡18~22 g雌性BALB/c小鼠,第1天弗氏完全佐劑的生理鹽水溶液(50%)100μL小鼠背部皮下注射,第4、7、10天在小鼠背部皮膚上涂抹100μL弗氏完全佐劑的生理鹽水溶液(50%)繼續(xù)致敏,攻擊3 d后,所有小鼠CO2安樂死,在無菌環(huán)境中采集血液和腎臟進(jìn)行HE染色、免疫比濁法和ELISA檢測血清IL-6含量。小鼠皮膚過敏評分為:0分,完全正常;1分,散發(fā)性紅斑或輕度紅腫;2分,中度紅腫或彌漫性紅腫;3分,重度紅斑或紅腫。將≥1評分定義為陽性致敏,計算致敏率。外源性低分子量化合物誘導(dǎo)小鼠超敏反應(yīng)模型[16-17]:無特異性病原體(SPF)雌性6~8周齡20~22 g BALB/c小鼠,0.5或1 mg綠原酸溶于生理鹽水中皮下注射至小鼠右后足,頸椎脫位法處死小鼠,去除處理側(cè)和未處理側(cè)的小鼠腘窩淋巴結(jié)(PLN),放置于冰涼的1%BSA的PBS溶液中,切除多余脂肪組織后稱重,采用流式細(xì)胞儀對每個分離的PLN細(xì)胞同時進(jìn)行三色分析,制備PLN淋巴細(xì)胞緩沖液,進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISPOT)檢測IgM、IgG1、IgG2a以及IgE。

上述四種被動皮膚過敏反應(yīng)模型區(qū)別之處在于選用了不同的變應(yīng)原刺激小鼠,測定耳部藍(lán)染的伊文思藍(lán)含量,免疫比濁法、ELISA法測定相關(guān)因子等都可以定量反映過敏嚴(yán)重程度,是較為精確的一種過敏反應(yīng)模型,可應(yīng)用于定量反應(yīng)藥物治療皮膚過敏性疾病有效率。

1.2 皮膚及其附件接觸性過敏反應(yīng)模型

小鼠耳接觸超敏反應(yīng)模型[18]:6~8周齡BALB/cJ小鼠,手術(shù)膠帶去除小鼠耳垂絨毛,每隔2 d涂抹1%2,4-二硝基氯苯(DNCB),持續(xù)1個月。每次涂抹DNCB 24 h后測量耳厚度。ELISA法進(jìn)行血清IgE濃度測定,第2周末取小鼠尾靜脈血使用ELISA試劑盒測定進(jìn)行測定,稀釋200倍后測定血清IgE濃度。小鼠耳部制成6μm厚度切片,HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察,顯微鏡下觀察淋巴細(xì)胞浸潤以及表皮增厚情況。制備單細(xì)胞懸液,分離總引流淋巴結(jié)細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞,進(jìn)行RNA提取及RT-PCR分析。2,4二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)局部接觸性過敏小鼠模型[19]:6~8周齡雌性野生型C57BL/6小鼠,每只小鼠剃去腹部毛發(fā),使用0.5%2,4-二硝基氟苯(DNFB)溶解于丙酮和橄欖油的混合物處理小鼠腹部皮膚。5 d后用0.2%DNFB每耳10μL刺激小鼠雙耳前后部。刺激48 h后用測微儀測量小鼠耳厚,判斷小鼠耳部局部接觸性過敏反應(yīng)嚴(yán)重程度,并進(jìn)行細(xì)胞分離和流式細(xì)胞術(shù)分析樹突細(xì)胞、T細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等各類免疫細(xì)胞數(shù)量在不同階段的變化情況[20]。氫醌(HQ)接觸性超敏反應(yīng)小鼠模型[21]:將1%或更高濃度氫醌涂抹在小鼠耳廓上,第7天和第14天耳廓涂抹氫醌,可引起濃度依賴性耳腫脹。第二次刺激的接觸性超敏反應(yīng)較第一次明顯更為嚴(yán)重,BALB/c小鼠對氫醌的敏感性高于C57BL/6小鼠。偏苯三酸酐(TMA)誘導(dǎo)小鼠接觸性皮膚過敏模型[22]:6~8周齡雄性BALB/c小鼠,第0天,50μL 10%TMA剃毛致敏;第5~10天開始,每天用20μL 3%小鼠左耳后部刺激;第5~7天,用數(shù)字千分尺測定耳廓腫脹度。通過左耳(過敏原激發(fā))減去右耳(溶劑對照)來計算耳腫脹的凈增加。鄰苯二甲酸酐(PA)誘導(dǎo)小鼠特應(yīng)性皮炎[23]:HR-1小鼠,8周齡,將5%PA溶液100μL涂抹于小鼠耳背及背部皮膚,每周3次,持續(xù)4周。實驗過程中,電子天平每周測量1次小鼠體重。4周后處死小鼠,測定小鼠淋巴結(jié)重量,測厚儀測量耳厚,從而評估PA引起的過敏性皮膚炎癥的嚴(yán)重程度。取小鼠耳背部皮膚,切片,甲苯胺藍(lán)染色檢測肥大細(xì)胞脫顆粒情況;ELISA法測定血清IgE濃度、血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平。接觸型超敏反應(yīng)評價[24]:SPF雄性6~10周齡BALB/c(H-2)小鼠,腹部胸部剃毛,25μL 0.5%二硝基氯苯(丙酮:橄欖油=4∶1)溶液涂抹,千分尺測量耳朵厚度,刺激24 h后再次測量。增加的耳朵厚度以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。測量耳重、血管通透性實驗、耳提取物中干擾素-γ體外測定、髓過氧化物酶(MPO)法間接定量嗜中性粒細(xì)胞等方式判定接觸性超敏反應(yīng)發(fā)生程度。

上述幾種都是變應(yīng)原直接涂抹于動物皮膚所構(gòu)建的皮膚接觸性過敏反應(yīng)模型,小鼠耳部皮膚是觀察皮膚反應(yīng)的較為理想的位置,因此誘導(dǎo)皮膚接觸性過敏反應(yīng)多選取小鼠耳部皮膚,通過耳部皮膚的腫脹度或耳厚度來評估過敏反應(yīng)的強(qiáng)烈程度,但耳腫脹度與耳厚度作為定量指標(biāo)仍然不夠嚴(yán)謹(jǐn),同時可以通過采集模型動物血液、制備細(xì)胞懸液,制備切片等方式進(jìn)行定量分析以及可視化觀察,從而更加準(zhǔn)確的評估模型動物反應(yīng)程度。上述模型詳細(xì)對比見表1。

表1 皮膚及其附件過敏反應(yīng)模型對比Table 1 Comparison of allergic reaction models of skin and its accessories

2 呼吸系統(tǒng)過敏性疾病模型

呼吸系統(tǒng)的過敏性疾病主要包括吸入過敏原引起的咳嗽、氣道過敏以及哮喘等。檸檬酸誘導(dǎo)豚鼠咳嗽模型[25]:豚鼠暴露于檸檬酸環(huán)境下,0.5 mol/L霧化吸入10 min,豚鼠置于允許自由移動的室內(nèi),并配備內(nèi)部麥克風(fēng)和壓力傳感器測量咳嗽,用氣速儀記錄呼吸和咳嗽引起的氣流變化,咳嗽聲被放大并記錄。雪松花粉誘導(dǎo)小鼠鼻內(nèi)過敏[13]:日本雪松花粉粒(0.5 mg懸浮于20 mL PBS中)鼻腔攻擊小鼠7次,每天1次,計數(shù)打噴嚏的次數(shù)。大鼠氣道超敏反應(yīng)模型[26]:氣管內(nèi)滴注嗜酸性粒細(xì)胞顆?；蚝铣申栯x子蛋白溶液0.1 mL,使用全細(xì)胞穿孔膜片鉗進(jìn)行電生理記錄,測定給予刺激后不同時刻膜電位的變化、動作電位數(shù)目、膜電位峰值以及電流變化。煙曲霉菌提取物蛋白誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥模型[27]:RK小鼠,5月齡,采用50 mg煙曲霉菌提取物蛋白加2 mg氫氧化鋁稀釋的煙曲霉IgE溶于PBS緩沖液中,分別于第0天和第10天皮下注射致敏RK小鼠。隨后,小鼠在第18天至第25天暴露于煙曲霉菌孢子污染的環(huán)境中,第25天處死小鼠,取支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織進(jìn)行組織學(xué)分析,建模過程如圖1所示。熱凝固蛋清(HEW)誘導(dǎo)小鼠晚期反應(yīng)(LPR)模型[6,28]:6周齡BALB/c小鼠,皮下注射HEW(40 mg),14 d后在足墊內(nèi)注射50μL熱聚卵白蛋白(20 mg/mL),立即出現(xiàn)以足墊腫脹和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為特征的超敏反應(yīng)。

圖1 煙曲霉誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥模型建模過程Figure 1 Modeling process of Aspergillus fumigatus-induced airway inflammation model in mice

呼吸系統(tǒng)過敏性疾病模型構(gòu)建主要通過吸入變應(yīng)原或直接氣管滴注的方式誘導(dǎo)動物發(fā)生呼吸系統(tǒng)過敏反應(yīng),取BALF和肺組織分析,測定咳嗽次數(shù)、氣流變化以及電生理指標(biāo)等多適用于呼吸系統(tǒng)模型,同時也可以通過ELISA法檢測血清IgE濃度、各類細(xì)胞因子濃度等免疫相關(guān)指標(biāo),制備切片顯微鏡下觀察,流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞等定性定量評估模型動物過敏反應(yīng)嚴(yán)重程度。

3 消化系統(tǒng)過敏性疾病模型

口服藥物誘導(dǎo)大鼠胃腸超敏模型[29]:5周齡Brown Norway大鼠,將受試藥物混懸液或溶媒(0.5%甲基纖維素溶液)口服28 d,每日給藥量阿莫西林(AMX)和磺胺甲噁唑(SMX)為500 mg/kg,D-青霉素胺(D-Pen)和磺胺甲噁唑(SMX)為500 mg/kg、苯妥英鈉(PHT)為300或450 mg/kg,每周測量一次體重,每天記錄2次動物臨床體征,包括任何異常的外表或行為。大鼠安樂死,異氟醚吸入麻醉后腹主動脈采血,ELISA法測量血清IgE濃度,并檢測血液中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和大的未染色的細(xì)胞的數(shù)量,流式細(xì)胞儀對淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析;采血后,取脾、腸系膜淋巴結(jié)和小腸切片,蘇木精伊紅(HE)染色鏡檢。結(jié)腸過敏大鼠模型[30]:250~350 g雄性SD大鼠,腹腔注射1 mL溶有10μg卵白蛋白(抗原)和10 mg氫氧化鋁(佐劑)的生理鹽水溶液。注射后第3天至第5天,使用抗原液以50μL/min進(jìn)行大鼠結(jié)腸灌流30 min,再使用30 mm級汞柱重復(fù)刺激大鼠結(jié)腸過敏5次,間隔為3 min?？乖河?0μg/mL卵白蛋白、40 mmol/L D-葡萄糖組成,與氯化鈉等滲。對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型[31]:180~200 g成年雄性SD大鼠,2%異氟醚麻醉,將TNBS(100 mg/kg)和50%乙醇(體積比2∶1)經(jīng)直腸注入遠(yuǎn)端結(jié)腸腔(距肛門近端7 cm)。通過對體重、大便稠度和腸出血評分(0~4分),獲得疾病活動指數(shù)(DAI)。所有動物在TNBS后第7天和第14天進(jìn)行評估;為評價TNBS灌服引起的軀體痛覺過敏,于第7天和第14天測定大鼠的機(jī)械和熱行為實驗,使用機(jī)械拔爪(PWL)時間和熱痛閾值來反應(yīng)軀體痛覺過敏程度,從而反應(yīng)內(nèi)臟超敏程度。對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型[32]:雄性18~20 g C57BL/6小鼠,麻醉條件下將TNBS(1.75 mg/只,含50%乙醇)經(jīng)距肛門近端4 cm的細(xì)導(dǎo)管一次性注入結(jié)腸,誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型。經(jīng)TNBS處理后,小鼠倒立5 min。對小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行髓過氧化物酶檢測(MPO),并在誘導(dǎo)結(jié)腸炎后第7天取結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色。內(nèi)臟超敏反應(yīng)程度(內(nèi)臟痛閾)利用腹壁退縮反射(AWR)程度來間接反映:肛門連接球囊擴(kuò)張器,采用維持球囊擴(kuò)張所需注氣量(0.1~1.0 mL)來反應(yīng)AWR,即腹部離開平臺時突然而持續(xù)的腹部肌肉收縮。鋁誘導(dǎo)大鼠內(nèi)臟超敏模型[33]:大鼠口服1.5 mg/kg檸檬酸鋁,通過誘發(fā)痛覺過敏所需平均壓力不同來反應(yīng)內(nèi)臟超敏反應(yīng)嚴(yán)重程度。結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)誘發(fā)大鼠內(nèi)臟超敏模型[34]:斷奶前雄性SD大鼠(小于8日齡),與成年雌性大鼠共同飼養(yǎng)至25日齡,體重到達(dá)200~250 g時分組,新生CRD模型構(gòu)建:大鼠出生第8、10、12天使用插入降結(jié)腸和直腸上部的血管成形術(shù)球囊。球囊在60 mmHg壓力下用0.3 mL水膨脹1 min,然后放氣退出。間隔30 min,重復(fù)擴(kuò)張兩次。假手術(shù)組除不施加壓力外,處理方式與CRD置入組相似。成年CRD組不進(jìn)行擴(kuò)張,8周后,將成年CRD應(yīng)用于所有大鼠,其中80 mmHg(1 min)擴(kuò)張2次,間隔5 min。通過腹部戒斷反射[35](AWR)評估大鼠膨脹痛閾值。將30日齡大鼠下丘腦組織切片進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。將下丘腦室旁核和垂體在50 mmol/L鹽酸緩沖液(pH=7.4)中勻漿,采取ELISA法測定促炎因子水平。

消化系統(tǒng)過敏性疾病造模主要通過腹腔注射、結(jié)腸灌流等方式誘導(dǎo),由于消化系統(tǒng)器官的特點,無法直接觀察其過敏反應(yīng)程度,需要一些間接的指標(biāo)來反映,上述幾種消化系統(tǒng)過敏性疾病模型中,可間接通過對內(nèi)臟發(fā)生過敏反應(yīng)后所產(chǎn)生痛覺的評估(如:機(jī)械拔爪時間、熱痛閾值和腹壁退縮反射等)或者疾病活動指數(shù),但這些間接指標(biāo)仍無法精確定量,定量檢測仍需ELISA法檢測血清IgE濃度[36]、各類細(xì)胞因子濃度等免疫相關(guān)指標(biāo),流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞等途徑評估模型動物過敏反應(yīng)嚴(yán)重程度,隨著動物成像技術(shù)的進(jìn)步和設(shè)備的應(yīng)用,可以探索將成像技術(shù)用于消化系統(tǒng)病變的直接觀察。

4 神經(jīng)系統(tǒng)過敏疾病模型

脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠疼痛過敏、脊髓炎癥模型[37]:5日齡SD大鼠幼鼠腹腔注射LPS(2 mg/kg),注射LPS 5 min后,注射總體積為0.1 mL含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的無菌生理鹽水溶液。注射后24 h測量體重并測試記錄行為。每組16只幼鼠,斷頭處死8只,采集新鮮腰髓組織,剩余8只經(jīng)心臟灌注生理鹽水,制備脊髓切片進(jìn)行免疫組化染色。采用馮弗雷纖維絲試驗[38-39](von fery filament test)評估大鼠機(jī)械性痛覺。搖尾實驗測定尾閃潛伏期平均值,評估大鼠熱傷害閾值。采用ELISA法檢測大鼠脊髓中IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、CORT和PGE濃度,并將上述指標(biāo)作為炎癥反應(yīng)標(biāo)記物。辣椒素誘導(dǎo)小鼠機(jī)械過敏模型[40]:雄性CD-1小鼠,6~8周齡,右后掌足底中部注射辣椒素增敏,注射15 min后測定機(jī)械刺激的戒斷潛伏期。同樣采用馮弗雷纖維絲試驗評估小鼠機(jī)械性痛覺。芬太尼誘導(dǎo)大鼠超敏模型[41]:雄性SD大鼠,50~100 g,芬太尼(60 mg/kg)每隔15 min皮下注射,共注射4次,總劑量為240 mg/kg(為模擬人類手術(shù)中使用的大劑量阿片類藥物治療)。分別于給藥后第0、1、5、6、6.5、7、8 h,以及給藥后第1、2、3、4、5天測定機(jī)械刺激和熱刺激的傷害性閾值。機(jī)械敏感性評估采用馮弗雷纖維絲試驗;采用Hargreavs法[42]評估熱敏感性,即測量引起足底縮足所需的潛伏期(以s為單位)?？Х纫蛘T導(dǎo)大鼠腎上腺素(HPA)軸超敏模型[43]:無特定病原體(SPF)Wistar大鼠(8周齡雌性200~240 g,10周齡雄性260~300 g),實驗條件下適應(yīng)一周,大鼠從妊娠第0天(GD)至出生后12周(PW)的處理如圖2所示。兩只雌性大鼠與一只雄性大鼠過夜,觀察到交配證據(jù)(即陰道栓或精細(xì)胞陰道圖片)的日期定位妊娠第0天(GD 0),從GD 9~GD 20對孕鼠進(jìn)行灌胃咖啡因給藥120 mg/(kg·d)[44];16只孕鼠在GD 20異氟醚麻醉下安樂死,取出胎盤組織,稱量胎兒體重,斷頭處死胎鼠,取血離心備用,在解剖學(xué)范圍內(nèi)解剖并收集胎鼠腦組織(每性別4例)進(jìn)行免疫熒光分析;其余孕鼠正常分娩,標(biāo)準(zhǔn)化幼仔數(shù)量為8只,出生后第1周(PW 1)稱重,評估幼鼠是否存在慢性應(yīng)激;對照組和模型組進(jìn)行冰水游泳試驗,取腦組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)和免疫熒光分析,血樣進(jìn)行血清ACTH和皮質(zhì)酮(CORT)檢測,從而評估咖啡因?qū)PA軸活性產(chǎn)生的影響作用。白藜蘆醇(RTX)誘導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥導(dǎo)致小鼠足水腫模型[45]:8周齡雄性ICR小鼠,腹腔注射RTX溶液,1小時后測量后爪厚度;為消除測量偏差,每隔5 min測量雙側(cè)后爪3次,后爪厚度用6個測量值的平均值表示。部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎(PSNL)誘導(dǎo)小鼠機(jī)械超敏模型[46]:雄性DDY小鼠,25-35 g,腹腔麻醉注射0.4 mg/kg美地托咪啶、2.0 mg/kg咪達(dá)唑侖和5.0 mg/kg布托啡諾。根據(jù)Stelzer法[47],暴露左側(cè)坐骨神經(jīng),并用外殼縫線緊密結(jié)扎。同樣采用馮弗雷纖維絲試驗[36]評估大鼠機(jī)械性痛覺。結(jié)果的反應(yīng)評分為0~3分(0:無反應(yīng),1:后足抬起,2:后爪快速拔除。3:后爪搖動和舔)。每次試驗間隔至少5~7 s的七項試驗總評分記錄為疼痛評分[48];取出腦組織,進(jìn)行免疫組化可視化切片進(jìn)行觀察。

圖2 大鼠從妊娠第0天(GD 0)至出生后12周(PW 12)的處理過程Figure 2 Treatment process of rats from the 0th day of pregnancy(GD 0)to 12 weeks after birth(PW 12)

上述神經(jīng)系統(tǒng)過敏性疾病模型通過外源性藥物、內(nèi)毒素或手術(shù)進(jìn)行誘導(dǎo),評估過敏反應(yīng)程度多采用痛覺指標(biāo),通過馮弗雷纖維絲試驗評估機(jī)械刺激傷害閾值,通過Hargreavs法評估熱刺激傷害閾值。由于神經(jīng)系統(tǒng)的特殊性,想要通過模型定量精確評估過敏反應(yīng)仍然存在一定的難度,動物模型與臨床疾病的對應(yīng)性也需要科研工作者們繼續(xù)探索確證。

5 基因工程動物來源過敏性疾病模型

Il-36r拮抗劑缺陷型(IL-36R antagonistdeficient,Il-36rn-/-)銀屑病小鼠模型[49]:使用含咪喹莫特(IMQ)的乳膏局部涂抹Il-36r拮抗劑缺陷型(Il-36rn-/-)和Il-36r基因缺陷型(IL-36R-deficient,Il-36r-/-)小鼠耳部皮膚,兩種小鼠進(jìn)行對比;觀察小鼠耳腫脹、棘皮病、紅斑、皮膚剝落和角化過度;采用流式細(xì)胞術(shù)對炎性耳浸潤進(jìn)行定性與定量分析。基因敲除肥大細(xì)胞缺陷型小鼠模型[50]:6~8周齡C57BL/6背景的G蛋白偶聯(lián)受體X2(MRGPRB2)基因敲除(MUT)小鼠,腹腔注射70 mg/kg戊巴比妥鈉,實驗前靜脈注射50μL伊文思藍(lán)染液(12.5%生理鹽水,w/v),用游標(biāo)卡尺測量足爪厚度,使用丙酮生理鹽水提取伊文思藍(lán)染料,于620 nm處測定OD值。體溫試驗:采用野生型(WT)或Mrgprb2基因敲除(MUT)6~8周齡小鼠,用生物功能實驗系統(tǒng)記錄小鼠體溫,并將探針插入小鼠肛門,得到直腸溫度,3 min測量1次,共持續(xù)30 min。血管活性腸肽(VIP)基因缺乏小鼠后足超敏模型[51]:成年C57BL/6Vip-/-小鼠,Vip+/+作為對照,小鼠接受不同的神經(jīng)損傷:備用神經(jīng)損傷(SNI)、正中神經(jīng)損傷(MNI),采用馮弗雷纖維絲試驗評估小鼠機(jī)械傷害閾值,并進(jìn)行后足觸覺刺激;取脊髓進(jìn)行促炎因子表達(dá)及淋巴細(xì)胞分析。不同基因缺陷小鼠脂質(zhì)過氧化過敏模型[52]:野生型(WT)、Xpa-/-、Ercc1-xpf內(nèi)切酶復(fù)合物基因(Ercc)亞純突變體(Ercc-/Δ,表達(dá)正常補(bǔ)體Ercc1-xpf的5%,但Ercc-/-小鼠壽命僅4周,而Ercc-/Δ小鼠壽命為7個月[53-57],小鼠皮下注射0.5 mL/kg CCL4,制成1∶1橄欖油懸浮液,每周2次,共5周;當(dāng)小鼠被判定為晚期或自發(fā)活動減少時,處死、分離組織進(jìn)行組織學(xué)分析,評估受試小鼠肝中脂質(zhì)過氧化水平,對小鼠肝、腎和胰腺切片并進(jìn)行評分。2,4,6-三硝基氯苯(TNCB)誘導(dǎo)EomesGfp/tx Rorc(gt)-CreTgx Rosa26RYfp/t小鼠接觸性皮炎[58]:測定不同時間點耳腫脹反應(yīng)、皮膚天然淋巴樣細(xì)胞(固有淋巴樣細(xì)胞,ILCs)數(shù)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生;半抗原刺激小鼠誘導(dǎo)皮膚和耳部引流淋巴結(jié)中自然殺傷細(xì)胞的早期增加,分別與不同時間點耳部腫脹反應(yīng)的峰值相對應(yīng)。兩條曲線對比從而反映小鼠過敏反應(yīng)過程中ILCs、細(xì)胞因子不同時刻的變化規(guī)律。

基因工程動物模型較之傳統(tǒng)動物模型目的性與針對性更強(qiáng),但仍然不能完全模仿人類過敏性疾病的病理生理過程,相較于人類,基因工程動物模型不具有免疫細(xì)胞和因子的系統(tǒng)性改變,疾病的靶基因也不一定具有特異性,只有不斷期待基因工程技術(shù)的進(jìn)步,爭取早日構(gòu)建出更加貼合人類過敏特性的基因工程動物模型[59]。

6 體外模型

大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系(RBL-2H3細(xì)胞)模型[13]:10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,使用1.0 ng/mL抗二硝基苯酚(DNP)敏化RBL-2H3細(xì)胞,培養(yǎng)8 h,PBS去除未結(jié)合IgE,1.25 ng/μL DNP-BSA Tyrode’s緩沖液(MT緩沖液)加入細(xì)胞培養(yǎng)孔,孵育30 min,細(xì)胞經(jīng)4℃冷凍10 min,離心收集上清液。裂解細(xì)胞使細(xì)胞釋放組胺,使用組胺EIISA試劑盒檢測組胺含量,Wallac 1420 ARVOsx多標(biāo)簽計數(shù)器測定RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒后Ca2+內(nèi)流情況,在DNP-BSA刺激下,每隔1 min測定1次,共10 min。C48/80誘導(dǎo)小鼠腫瘤細(xì)胞肥大細(xì)胞株(P815肥大細(xì)胞)脫顆粒模型[60]:10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h,Tyrode’s緩沖液沖洗3次,平衡10 min。以50μL C48/80(10μg/mL)進(jìn)行刺激,45 min后離心收集上清液和細(xì)胞,測定生物活性介質(zhì)。采用組胺ELISA試劑盒測定并分析上清液中組胺水平。測定β-氨基糖苷酶濃度、染色測定細(xì)胞脫顆粒率。氟喹諾酮類藥物誘導(dǎo)人肥大細(xì)胞系2(LAD 2)超敏模型[50]:10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,以 每毫升2×106個細(xì)胞密度進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),并使用氟喹諾酮類藥物孵育建立LAD 2細(xì)胞超敏模型,進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣動員實驗、β-己糖苷酶釋放實驗、組胺釋放實驗、小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染實驗,從而判定LAD2細(xì)胞模型超敏反應(yīng)程度。LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7模型[18]:使用添加10%胎牛血清改良和100 U/mL青霉素100μg/mL鏈霉素的10%胎牛血清Eagle’s培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞適應(yīng)一段時間后,1 μg/mL LPS刺激8 h進(jìn)行分析。采用臺盼藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗,通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)TNF-α水平。半抗原特異性LN細(xì)胞模型[61-62]:加入0.5 mmol/L DNBS后培養(yǎng)LN細(xì)胞72 h,收集上清液進(jìn)行ELISA檢測,采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)IL-36α表達(dá)水平。煙曲霉菌可溶性蛋白誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒模型[27]:3月齡SD大鼠,使用肝素化Hank’s平衡鹽溶液10 mL腹腔灌洗獲得新鮮肥大細(xì)胞,混合洗滌兩次,并在含10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基中以所需濃度懸浮,加入煙曲霉菌可溶性蛋白孵育15 min,固定細(xì)胞后使用0.1%甲苯胺藍(lán)染色測定肥大細(xì)胞脫顆粒百分率[63-64]。

過敏反應(yīng)研究體外細(xì)胞模型大多使用肥大細(xì)胞模型,也有巨噬細(xì)胞、RBL-2H3細(xì)胞株等其他細(xì)胞模型,肥大細(xì)胞脫顆粒模型是一種能較為直觀反映細(xì)胞過敏程度的一種方法,P815細(xì)胞相較于RBL-2H3細(xì)胞適合作為一種早期、穩(wěn)定、敏感的肥大細(xì)胞脫顆粒體外檢測模型[59]。

總體來講,體外細(xì)胞模型的構(gòu)建思路主要為選擇適宜的細(xì)胞株進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)后加入致敏原進(jìn)行孵育,進(jìn)而再通過染色,流式細(xì)胞術(shù)分析等檢測手段分析模型細(xì)胞相關(guān)檢測指標(biāo),從而反映該模型過敏程度和過敏機(jī)制。

研究中常用的過敏性疾病體內(nèi)外模型需要滿足以下幾點:①模型構(gòu)建盡可能貼合人類過敏性疾病發(fā)生發(fā)展病理生理過程。②滿足研究所需的定性定量要求。③能夠確定反應(yīng)過敏性疾病的相關(guān)免疫指標(biāo),并能夠找到一定的方法精確、經(jīng)濟(jì)的測量。④符合動物倫理、福利要求并進(jìn)行評估。本文通過匯總、分析常用過敏性疾病研究模型,通過分析各類模型的異同與優(yōu)劣之處,希望為研究者選擇合適的過敏性疾病模型或者進(jìn)行改進(jìn)提供參考和啟發(fā)。