劉燦黃，何清彥，吳勝男，劉波，林新文，蔣桃

1.長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥品審評認(rèn)證與不良反應(yīng)監(jiān)測中心，湖南 長沙 410013；3 湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410208

腦心舒口服液是滋補鎮(zhèn)靜安神類中成藥，用于身體虛弱、心神不寧、失眠多夢、神經(jīng)衰弱、頭痛眩暈等，尤其在頑固性神經(jīng)衰弱方面療效顯著［1］。國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上可以查詢到101 條“腦心舒口服液”批準(zhǔn)文號，腦心舒口服液是典型的“一品多家”中成藥品種。網(wǎng)上銷售價格0.5～3.0 元/支，價格相差近6 倍。腦心舒口服液由蜜環(huán)菌濃縮液和蜂王漿組成，其制法是取蜂蜜加熱煉制，濾過，放冷，與研磨好的蜂王漿混勻，再加入蜜環(huán)菌濃縮液，苯甲酸鈉及香精的乙醇液，混勻，調(diào)整總量，攪勻，濾過，即得。主要成分蜜環(huán)菌是天麻的共生菌，與天麻有相似的生物活性，有明顯的鎮(zhèn)靜安眠作用［2］；蜂王漿是集營養(yǎng)、食療及保健多位一體的天然物質(zhì)，具有抑菌、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及護(hù)膚美容等多方面藥理作用。蜂王漿有效成分10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA）是蜂王漿特有的脂肪酸，俗稱王漿酸，是蜂王漿的標(biāo)志物［3］。

腦心舒口服液目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要有國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3-B-3975-98-2002、WS-11356（ZD-1356）-2002-2012Z、國家藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3-B-3975-98-2002-1、國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（試行）YBZ27332005。處方制法均一致，但各標(biāo)準(zhǔn)均不相同。大部分生產(chǎn)企業(yè)執(zhí)行的是國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3975-98-2002［4］，標(biāo)準(zhǔn)中含化學(xué)、薄層鑒別、相對密度、pH 值、裝量、微生物限度等檢查項，無含量測定項。本文就湖南省2020 年抽檢的流通環(huán)節(jié)全部執(zhí)行WS3-B-3975-98-2002 標(biāo)準(zhǔn)的6 個廠家11 批腦心舒口服液進(jìn)行質(zhì)量分析，對其有效成分10-羥基-2-癸烯酸和防腐劑苯甲酸進(jìn)行定量探索研究［5-10］，為其成藥整體質(zhì)量評價和標(biāo)準(zhǔn)提升提供研究基礎(chǔ)，為該品種的質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20AD 高效液相色譜儀，SPD-M20A檢測器，SIL-20A 自動進(jìn)樣器，LC solution 色譜工作站，電子天平 METTLER TOLEDO XS205DU，新芝SB-800 DTD 超聲儀。

1.2 試藥

10-羥基-2-癸烯酸（批號：110812-201808，97.5%），苯甲酸（批號：100419-201703，99.9%），對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；試劑甲醇、磷酸均為分析純，水（超純水），乙腈（色譜純）。腦心舒口服液樣品信息如下，按標(biāo)準(zhǔn)檢驗均合格，結(jié)果見下表1。

表1 樣品信息及按標(biāo)準(zhǔn)檢測指標(biāo)結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）為流動相，流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃，波長207 nm 測定10-羥基-2-癸烯酸，230 nm 處測定苯甲酸，進(jìn)樣量10 μL；分析時間40 min。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.10-羥基-2-癸烯酸對照品（207 nm）；B.苯甲酸對照品（230 nm）；C.樣品（207 nm）；D.樣品（230 nm）

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取10-羥基-2-癸烯酸對照品適量，至棕色量瓶中，加甲醇制成濃度為10 μg/mL 的對照品溶液。精密稱取苯甲酸對照品適量，至棕色量瓶中，加甲醇制成濃度為50 μg/mL 的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品2 mL 置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系取混合對照品溶液2，5，10，15，20，25 μL 在上述色譜條件分別進(jìn)樣，測定峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)對照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），求得10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸的回歸方程分別為Y=1.16×106X+388.14（r=0.999 7）；Y=1.07×106X+4 743（r=0.999 1），結(jié)果表明，10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸進(jìn)樣量分別在0.02～0.25 μg，0.10～1.25 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 重復(fù)性試驗取同一批號的腦心舒口服液樣品，按“2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣，計算10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸含量的RSD 分別為1.4%，1.1%。結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

2.4.3 精密度試驗取混合對照品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，計算10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸色譜峰面積的RSD 分別為0.7%，1.0%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗取同一批號的腦心舒口服液樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣，計算10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸色譜峰面積的RSD 別為1.3%，0.8%。結(jié)果表明，樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 回收率試驗取已知含量（10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸的含量分別為0.199 mg/mL，2.246 mg/mL）的腦心舒口服液6 份，每份精密量取1 mL，每份精密加入含10-羥基-2-癸烯酸對照品儲備液（濃度為0.1 mg/mL）1 mL 和苯甲酸對照品儲備液（濃度為0.5 mg/mL）4 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測定，計算回收率。結(jié)果10-羥基-2-癸烯酸及苯甲酸的平均回收率分別為99.01%，100.13%，RSD 分別為1.2%，0.9%。

2.5 樣品含量測定

分別取腦心舒口服液按“2.3”項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，于207 nm 檢測10-羥基-2-癸烯酸，230 nm 檢測苯甲酸，測定峰面積，計算10-羥基-2-癸烯酸和苯甲酸的含量，并按原料蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸100%轉(zhuǎn)移折算，計算原料蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸含量。測定結(jié)果分別見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=2）

2.6 樣品聚類分析

聚類分析是一種通過數(shù)據(jù)建模簡化數(shù)據(jù)的方法，依據(jù)研究對象的某些特征加以歸類，建立樣本間的相似關(guān)系，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量評價中。采用TBtools 進(jìn)行聚類熱圖分析，其中橫向聚類樣品，縱向聚類色譜峰，熱圖顏色代表峰面積，熱圖分析結(jié)果顯示11 批樣品化學(xué)成分比例有差異：3 號峰為苯甲酸，熱圖顏色可直觀顯示企業(yè)A 中S5 號樣苯甲酸含量最低，因而偏離同企業(yè)其他批次樣品；7 號峰為10-羥基-2-癸烯酸，企業(yè)E（S9）和企業(yè)F（S11）樣品中10-羥基-2-癸烯酸含量比較低；峰1、2、4、5、6 在各樣品中差異較大，峰1、峰4 成分在企業(yè)A（S1、S2、S3、S4、S5）、企業(yè)B（S6、S10）、企業(yè)D（S8）中含量很低，峰2 成分在企業(yè)D（S8）、企業(yè)E（S9）、企業(yè)F（S11）中含量很低，峰5、峰6 成分在企業(yè)F（S11）中含量最低，其次在企業(yè)D（S8）中含量也很低。樣品熱圖聚類分析結(jié)果表明相同生產(chǎn)企業(yè)的樣品質(zhì)量一致性相對較好，而不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品間的質(zhì)量一致性較差。因腦心舒口服液生產(chǎn)工藝簡單，無提取過程只有簡單的混合工序，質(zhì)量差異主要來源于其原料蜜環(huán)菌、蜂王漿、蜂蜜、防腐劑的差異。分析圖見圖2。各企業(yè)色譜圖見圖3。

圖2 聚類熱圖分析圖

圖3 企業(yè)A、B、C、D、E、F樣品色譜圖（207 nm）

3 討論

3.1 成分分析

6 家企業(yè)11 批樣品全部執(zhí)行的是國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3-B-3975-98-2002，標(biāo)準(zhǔn)中按化學(xué)反應(yīng)、薄層鑒別、相對密度、pH 值、裝量、微生物限度檢查項檢驗全部合格，但是產(chǎn)品中有效成分10-羥基-2-癸烯酸含量差別較大，最高達(dá)2.36 mg/支，最低只有0.44 mg/支，而標(biāo)準(zhǔn)WS-11356（ZD-1356）-2002-2012Z、WS3-B-3975-98-2002-1 中分別規(guī)定10-羥基-2-癸烯酸含量不得低于2.0 mg/支、2.5 mg/支，而本次流通環(huán)節(jié)抽檢的6個廠家11 批產(chǎn)品中10-羥基-2-癸烯酸含量全部低于2.5 mg/支，3 個廠家4 批次產(chǎn)品低于2.0 mg/支，說明執(zhí)行WS3-B-3975-98-2002 標(biāo)準(zhǔn)的腦心舒口服液產(chǎn)品有效成分10-羥基-2-癸烯酸含量普遍偏低。GB9697-2008《蜂王漿》國家標(biāo)準(zhǔn)強制性要求理化指標(biāo)10-羥基-2-癸烯酸≥1.4%為合格品，≥1.8%為優(yōu)等品。ISO12824《蜂王漿》國際標(biāo)準(zhǔn)要求10-羥基-2-癸烯酸≥1.4%。腦心舒口服液處方工藝較為簡單，按原料蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸100%轉(zhuǎn)換折算，11 批產(chǎn)品中原料蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸含量最高0.94%，最低只有0.18%，普遍含量偏低。10-羥基-2-癸烯酸有多種藥理活性作用，又是蜂王漿中特征性成分，是衡量蜂王漿品質(zhì)的重要理化指標(biāo)。此結(jié)果表明腦心舒口服液中原料蜂王漿質(zhì)量參差不齊。腦心舒口服液生產(chǎn)中無提取過程，只有簡單的混合工序，樣品間的差異主要來源于原料的差異。聚類分析顯示，各企業(yè)間產(chǎn)品色譜峰信息差異較大，表明不同生產(chǎn)企業(yè)腦心舒口服液原料蜜環(huán)菌、蜂王漿、蜂蜜等質(zhì)量的差異。成品執(zhí)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)太低，無法有效控制腦心舒口服液的質(zhì)量，腦心舒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亟待完善和提升。

3.2 防腐劑苯甲酸含量分析

防腐劑抑制微生物的生長和繁殖，延長藥品的保存期限，但過量攝入防腐劑會對人體產(chǎn)生危害，如苯甲酸類對咽喉、胃黏膜均有一定的刺激性?？诜后w制劑通常選用苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酯類防腐劑，苯甲酸的用量不得超過0.3%（鉀鹽、鈉鹽用量分別按酸計），腦心舒口服液中加防腐劑苯甲酸鈉，本實驗測得苯甲酸鈉（以苯甲酸計）含量0.13%～0.22%，均低于0.3%，其中8 批產(chǎn)品苯甲酸含量0.20%～0.22%，均符合要求。WHO 規(guī)定苯甲酸日允許總攝入量為5 mg/kg 。GB2760-2011 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中苯甲酸濃縮果蔬汁（僅限食品工業(yè)用）中限度為0.2%，其余醬油、醋、風(fēng)味飲料限度為0.1%，其他果酒、配制酒限度為0.08%、0.04%。所以腦心舒口服液作為滋補強壯、鎮(zhèn)靜安神滋補類藥物，其用量一定嚴(yán)格按照說明書用法用量服用（口服，一次10 mL，一日3 次）［10］，不可當(dāng)普通營養(yǎng)液超劑量隨意服用。作為滋補常用藥品，生產(chǎn)企業(yè)有待對產(chǎn)品原有老工藝用的防腐劑類型和質(zhì)量進(jìn)一步優(yōu)化。