謝寧 蔡妮娜

【摘要】 目的：建立五花解毒顆粒微生物限度檢查方法。方法：對樣品進行5種試驗菌株的回收率試驗及控制菌檢查法的驗證來確定適宜的檢查方法。結(jié)果：各試驗菌的回收比值在0.5～2之間，控制菌檢查中試驗組可檢出試驗菌。結(jié)論：可采用常規(guī)法進行五花解毒顆粒的微生物限度檢查。

【關(guān)鍵詞】 微生物限度檢查;常規(guī)法;方法驗證

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.04.016

Methodology Validation of Microbial Limit Test of

Wuhua Jiedu Grain

XIE Ning，CAI Ni-na

（Nanning Hospital Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

Abstract： Objective： To establish a method of microbial limit test of Wuhua Jiedu grain. Methods： The recovery tests of 5 bacterial strains and the me thodological validation of control bacteria examination method were done referring to the microbial limit test methods.Results： The recovery of the strain rate was 0.5～2，the experimental group were verified by test bacteria in the control bacteria detection. Conclusion： The Routine Method can be applied to the microbial limit test of Wuhua Jiedu Grain.

Key words： microbial limit test;routine method;method validation

五花解毒顆粒為固體口服制劑，處方含木棉花、金銀花、菊花、槐花、葛花，具有清熱解毒，涼血止痢的功效。根據(jù)《中國藥典》四部通則相關(guān)規(guī)定，本品需檢測需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，不得檢出大腸埃希菌。經(jīng)方法學驗證，本品的微生物限度檢查方法符合規(guī)定，方法可行。

1 實驗用品

1.1 菌種名稱及來源

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]，均購于中國食品藥品檢定研究院。

1.2 樣品

五花解毒顆粒批號：180425、180427、180509。生產(chǎn)廠家：南寧市中醫(yī)醫(yī)院。

1.3 稀釋劑及培養(yǎng)基

稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

培養(yǎng)基：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。均購于北京三藥科技開發(fā)公司。

1.4 儀器

立式壓力蒸氣滅菌鍋（LDZX-30FBS）、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9246A）、潔凈工作臺（SW-CJ-2FD）、生物安全柜（11231 BBC 86）、微機生化培養(yǎng)箱（SPX-15OB-Ⅱ）、生化培養(yǎng)箱（SPX-200-Ⅱ）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-360）等。

2 計數(shù)方法的驗證

2.1 菌液制備

用0.9%氯化鈉溶液將枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物制成適宜濃度的菌懸液，備用;用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將黑曲霉孢子懸液制成適宜濃度的菌懸液，備用。

2.2 供試液的制備

1）取供試品10 g，用稀釋劑加至50 mL，制成1∶5的供試液。

2）取供試品10 g，用稀釋劑加至100 mL，制成1∶10的供試液。

2.3 驗證試驗方法

試驗組：取2.2中2）項下1∶10供試液5份，每份9.9 mL，分別加入0.1 mL的各試驗菌液，混勻，使含菌量不大于100 cfu/1 mL，取1 mL注皿，傾注相應的培養(yǎng)基，需氧菌置30～35 ℃培養(yǎng)3天，霉菌置20～25 ℃培養(yǎng)5天。

陽性組：取稀釋液代替供試液，方法同試驗組。

供試品組：取供試液，以稀釋液代替菌液，方法同試驗組。

2.4 方法的確定

經(jīng)查詢，部分處方藥味對銅綠假單胞菌有不同程度的抑制作用，用銅綠假單胞菌進行預試驗，結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，供試液濃度為1∶5時，銅綠假單胞菌的回收比值小于0.5，供試液稀釋到1∶5濃度時未能消除樣品的抑菌性，方法不可行。供試液濃度為1∶10時，銅綠假單胞菌的回收比值達到要求，取供試液濃度1∶10以平皿法-傾注法測定五花解毒顆粒需氧菌總數(shù)應可行。

2.5 計數(shù)方法的驗證試驗

取三批次五花解毒顆粒按2.2中2）項下制備供試液，按2.3驗證試驗方法進行加菌回收，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，以常規(guī)法進行試驗，五個試驗菌的回收比值均在0.5～2之間，符合藥典規(guī)定。

五花解毒顆粒的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法確定為制成1∶10供試液的常規(guī)法。

3 控制菌檢查方法的驗證

菌液制備同2.1。供試液制備同2.2中2）。

1）試驗組：取10 mL的1∶10供試液，直接接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，加入大腸埃希菌（不大于100 cfu），30～35 ℃培養(yǎng)18小時。取1 mL培養(yǎng)物接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基，42～44 ℃培養(yǎng)24小時，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)物，在麥康凱瓊脂平板上劃線接種，30～35 ℃培養(yǎng)18小時。

2）陽性組：取大腸埃希菌（不大于100 cfu）接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同試驗組操作。

3）陰性組：以稀釋液代替供試品液，接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同試驗組操作。

試驗結(jié)果見表3。

結(jié)果表明，取規(guī)定量樣品接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法檢查，可檢出所加大腸埃希菌。

4 討論

為保證微生物限度檢查方法的科學性和檢查結(jié)果的準確性，中國藥典規(guī)定藥品的微生物限度檢查方法需通過方法適用性試驗加以驗證，從而真實反映藥品的質(zhì)量。2010年版《中國藥典》微生物計數(shù)中明確要求進行三次獨立的平行試驗進行方法驗證，2015年版《中國藥典》微生物計數(shù)法未對試驗次數(shù)提出具體要求。參照2010年版要求，無論是采用一批樣品進行3次試驗，還是采用3批樣品各進行一次試驗，其目的都是為了說明操作中樣品的抑菌性是否存在消除不徹底的現(xiàn)象，保證方法的重現(xiàn)性。通過對三批樣品的方法驗證，可采用常規(guī)法對五花解毒顆粒進行需氧菌、霉菌和酵母菌的計數(shù)及控制菌檢查。

【參考文獻】

[1]??? 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：140-149.

[2]??? 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典臨床用藥須知（中藥飲片卷）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：237.

[3]??? 國家藥典委員會.中國藥典分析檢測技術(shù)指南[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2017：568-569.

【作者簡介】

謝寧（1980-），女，學士，研究方向為制劑檢驗和質(zhì)量標準。