王 娟，雷 秦，許世娟

（陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院血液內(nèi)科，咸陽 712000）

干擾素（interferon，IFN）是人類發(fā)現(xiàn)最早的一類細胞因子，其中IFN-γ是Ⅱ型IFN中唯一的亞型，其可有效促進細胞表面的MHCⅠ分子表達，提高人體的免疫監(jiān)視能力，在臨床應用上具有重要的價值[1-4]。有研究指出，IFN-γ 在貧血和獲得性再生障礙中發(fā)揮著重要作用[5]，然而，IFN-γ 表達水平升高會導致血小板和中性粒細胞的減少[6]，從而影響機體造血干細胞（hematopoietic stem cells,HSPCs）的產(chǎn)生、分化、維持、更新等過程[7-8]。研究認為，細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路能促進機體胚胎干細胞的造血分化[9]。ERK 信號通路的缺失會造成動脈發(fā)育不完全，不利于患者HSPCs 的正常增殖[10]。因此，ERK信號通路的控制與HSPCs 是否順利產(chǎn)生具有顯著的相關性。艾曲波帕是一種促進血小板新生激動劑。研究報道，艾曲波帕能夠有效治療慢性免疫性的血小板減少性患者[11]。但目前關于艾曲波帕在IFN-γ介導的炎性環(huán)境中對HSPCs的作用機制尚不清楚。本研究旨在探討艾曲波帕對IFN-γ介導的炎性環(huán)境中調控ERK信號通路對HSPCs的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 重組人IFN-γ（貨號：TL-105）購自北京同立海源生物科技有限公司；重組人血小板生成素注射液（特比澳）（國藥準字S20050049）由沈陽三生制藥有限責任公司提供；艾曲波帕（REVOLADE）由瑞士諾華公司提供。

1.2 細胞分組及處理 選取2018 年3 月至2019 年11月陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院的15例健康志愿者，年齡18～55歲，所有志愿者均已簽署實驗知情同意書。本研究已取得機構審查委員會批準。通過髂前上棘骨髓穿刺取得受試者的HSPCs，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分為3 組：IFN-γ 組（加入100 μg/L IFN-γ 培養(yǎng)24 h）、艾曲波帕組（加入3 g/mL艾曲波帕含藥血清培養(yǎng)24 h）、艾曲波帕+IFN-γ組（100 μg/L IFN-γ干預1 h后加入3 g/mL艾曲波帕含藥血清培養(yǎng)24 h），每組設置6個復孔。

1.3 人CD34+HSPCs 的獲取與鑒定 連續(xù)5 d，每天給予受試者皮下注射10 μg/kg粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor,g-CSF），于第6天分離白細胞，并使用Clinimacs Plus儀器富集CD34+HSPCs后冷凍保存。對分離出的細胞進行流式細胞儀分析，使用CD34+抗體檢測調節(jié)性T 細胞CD34+。使用BD 流式細胞儀（BD 公司，美國）和Tree Star FlowJo分析軟件分析調節(jié)性T細胞CD34+的數(shù)量。

1.4 RT-PCR 法檢測轉錄激活因子1（ATF1）、環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）、c-fos 和P27 mRNA表達 用Trizol試劑（上海碧云天公司）提取HSPCs 細胞RNA，逆轉錄為cDNA，用TaqMan Universal PCR kit在熒光定量PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司，型號：ABI7500）上進行PCR 擴增。以GAPDH 為內(nèi)參，Bandscan 5.0軟件通過積分光密度值分析ATF1、CREB、c-fos 和P27 mRNA 相對表達量，采用2-△△t法計算目的基因mRNA 的相對表達量。引物由上海生工公司合成，引物序列如下：ATF1 上游：5’-CGCACGATATCTAGTGACAGAGG-3’，下游：5’-TGCAAACCTGTAGGGTAAAT-GG-3’；CREB上游：5’-TCAGCCGGGTACTACCATTC-3’，下游：5’-TCTCTTGCTGCTTCCCTG-3’；c-fos上游：5’-ACCAGCCCAGACCTGCAGTGG-3’，下游：5’-CCGGCACTTGGCTGCAGCCAT-3’；P27 上游：5’-GTCACGCGTATGTCAAACGAGTGTC-3’，下游：5’-ACCACTAGTTGACGTCTTCTGAGGCCAG-3’；GAPDH 上游：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，下游：5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’。

1.5 Western blotting 法檢測ATF1、CREB、c-fos、P27 和磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表達 取HSPCs，加入裂解液裂解細胞，BCA 法檢測蛋白濃度，SDSPAGE 電泳分離蛋白，蛋白轉移至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉1 h，PBS 緩沖液漂洗3 次，一抗ATF1（1∶1 000；美國Sigma 公司，批號ASF000125）、CREB（1∶1 000；美國Sigma公司，批號BNO009587）、c-fos（1∶1 000，上海碧云天公司，批號2019-005247）、P27（1∶1 000，上海碧云天公司，批號2019-000957）、ERK（1∶1 000，上海碧云天公司，批號2019-0124450）和p-ERK 抗體（1∶1 000，美國Sigma 公司，批號BGC010248）4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次，采用辣根酶標記標記的羊抗小鼠IgG（1∶5 000，美國Pierce公司，批號AB00987）室溫孵育2 h，PBS 緩沖液漂洗3 次。DBA 顯色，并于化學發(fā)光成像儀上進行成像并拍照。各組細胞p-ERK 水平的檢測時間點為作用12 h或24 h。采用Image J 6.0分析蛋白條帶灰度值。計算目的蛋白相對表達量（相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值×100%）。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)；計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 艾曲波帕在IFN-γ介導的炎癥環(huán)境下對HSPCs的影響 艾曲波帕+IFN-γ 組CD34+細胞百分比為（50.22±3.10）%，顯著高于IFN-γ組的（30.17±2.13）%，顯著低于艾曲波帕組的（88.49±3.89）%（均P＜0.05）。

2.2 3組細胞p-ERK 相對表達量比較 作用12 h后，與IFN-γ組和艾曲波帕組比較，艾曲波帕+IFN-γ組細胞p-ERK均顯著升高（P＜0.05），而IFN-γ組和艾曲波帕組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；作用24 h 后，與IFN-γ 組比較，艾曲波帕組和艾曲波帕+IFN-γ 組細胞p-ERK 表達水平均顯著升高，艾曲波帕+IFN-γ組則較艾曲波帕組顯著升高（P＜0.05），見表1、圖1。

圖1 Western blotting法檢測p-ERK蛋白表達

表1 3組細胞p-ERK相對表達量比較%， ，n=5

表1 3組細胞p-ERK相對表達量比較%， ，n=5

與IFN-γ組比較，aP＜0.05；與艾曲波帕組比較，bP＜0.05。

2.3 3組細胞ATF1、CREB、c-fos 和P27 mRNA 相對表達量比較 與IFN-γ 組比較，艾曲波帕組和艾曲波帕+IFN-γ組ATF1、CREB和P27 mRNA相對表達量均顯著升高，而c-fos 相對表達量顯著降低（均P＜0.05）；與艾曲波帕組比較，艾曲波帕+IFN-γ 組ATF1、CREB和P27 mRNA相對表達量均顯著降低，而c-fos 相對表達量顯著升高（均P＜0.05），見表2。

表2 3組細胞ATF1、CREB、c-fos和P27 mRNA相對表達量比較

2.4 3組細胞ATF1、CREB、c-fos和P27 蛋白表達量比較 與IFN-γ 組比較，艾曲波帕組和艾曲波帕+IFN-γ 組ATF1、CREB 和P27 蛋白相對表達量均顯著升高，而c-fos相對表達量顯著降低（P＜0.05）；與艾曲波帕組比較，艾曲波帕+IFN-γ 組ATF1、CREB和P27 蛋白相對表達量均顯著降低，而c-fos相對表達量顯著升高（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 3組細胞ATF1、CREB、c-fos和P27蛋白表達量比較%，

表3 3組細胞ATF1、CREB、c-fos和P27蛋白表達量比較%，

與IFN-γ組比較，aP＜0.05；與艾曲波帕組比較，bP＜0.05。

圖2 Western blotting法檢測ATF1、CREB、c-fos和P27蛋白表達

3 討論

艾曲波帕片（REVOLADE）是一種促血小板生成素受體激動劑適用于治療慢性免疫性血小板減少性紫癜患者的血小板減少，對皮質激素、免疫球蛋白或脾切除反應不佳的患者。近年來，眾多實驗室研究證實艾曲波帕可通過刺激機體HSPCs 的增殖誘導免疫耐受及免疫調節(jié)等過程，從而促進機體系統(tǒng)造血功能恢復[12]。IFN-γ 是一種具有免疫和炎癥的有效性介質，其在機體炎癥誘導反應中，在貧血和獲得性再生障礙中發(fā)揮著重要作用[13]。研究顯示：造血過程中眾多信號調控通路之間存在著一定的相互作用，對機體HSPCs 的增殖、分化和更新等過程具有嚴密的調控機制[14-17]。本研究探究艾曲波帕在IFN-γ介導的炎性環(huán)境中對HSPCs衰竭的影響機制。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，艾曲波帕能夠在IFN-γ 的作用下激活機體CMPL 通路[18]。研究發(fā)現(xiàn)，艾曲波帕對骨髓衰竭患者中，亦具有一定的治療作用，包括自身免疫疾病或慢性感染等，而其與重組人血小板生成素（rhTPO）的比較中發(fā)現(xiàn)，rhTPO 能夠對PIK13/AKT、JAK2/STST-1信號通路具有傳導作用，而艾曲波帕僅能激活JAK2/STAT-1 信號通路，認為rhTPO可有效促進血小板聚集，艾曲波帕無此功能，可能原因與CMPL 的氨基酸序列位點不同相關[19-20]。研究顯示：在敲除STAT5a和5b的小鼠模型中，STAT 可與和DNA 結合并促使受損機體內(nèi)血小板的產(chǎn)生，證實JAK/STAT 通路和血小板的產(chǎn)生相關[21]。而當機體內(nèi)Ras 通路被激活后，可進一步激活ERK通路，進而導致p90rsK磷酸化，促進ERK下游多種因子ATF1、CREB磷酸化和c-fos轉錄[22]。

艾曲波帕不僅可促使巨核細胞的增殖、分化，促進血小板的生成，還有促進骨髓HSPCs的增殖和分化，從而改善造血功能的作用，故批準用于治療經(jīng)免疫抑制療法無效的重型再生障礙性貧血患者。艾曲波帕可能通過以下4 種機制在AA 治療中發(fā)揮作用：刺激并維持HSPCs，減少IFN 對HSPCs的抑制；促進免疫耐受，抑制巨噬細胞活性、削弱樹突狀細胞成熟、增加調節(jié)性B 細胞及調節(jié)性T 細胞數(shù)量；免疫調節(jié)，進而減少IFN及TNF的釋放、增加轉化生長因子（TGF）釋放；還有一點的療效驗證是鐵清除，可以促使細胞鐵動員、減少鐵過載的現(xiàn)象。結合本研究結果筆者推測，艾曲波帕可在促炎細胞因子IFN-γ介導的炎癥環(huán)境中防止人類HSPCs和祖細胞衰竭，其機制與ERK通路激活下游多種蛋白激酶的表達密切相關。在免疫介導的骨髓衰竭綜合征中，促炎細胞因子IFN-γ 參與人類HSPCs 和祖細胞的耗竭。IFN-γ復合物形成紊亂以及所導致的生長因子細胞信號的重要通路抑制或可代表IFN-γ損害人HPSCs功能的一般機制。這一發(fā)現(xiàn)或可為各類慢性炎性疾病提供廣泛的治療應用。

綜上所述，艾曲波帕能在IFN-γ 介導的炎癥環(huán)境中，通過ERK通路激活下游多種蛋白激酶的表達水平，達到防止HSPCs衰竭的作用。