趙 璐，侯俊德，陳永學(xué)

（邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科，邯鄲 056018）

創(chuàng)傷性腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的炎癥反應(yīng)有重要作用，由小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)能夠促進病原體清除及組織修復(fù)再生，但炎癥反應(yīng)可加劇對神經(jīng)元的損傷[1-3]。因此，臨床中應(yīng)積極尋求有效干預(yù)措施，以抑制小膠質(zhì)細胞的活化，以減輕腦損傷后神經(jīng)元損傷及促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)[4]。七氟烷為臨床常用麻醉藥物，且在兒童全麻誘導(dǎo)及維持中療效良好，研究發(fā)現(xiàn)，給予氧糖剝奪的神經(jīng)元七氟烷干預(yù)，可促進HO-1-mRNA的表達，降低Fas蛋白的表達，降低人神經(jīng)元的凋亡率，增加存活率[5-6]。但目前尚未明確其具體作用機制。NF-κB 存在于幾乎所有動物細胞類型中，并參與細胞對刺激的反應(yīng)，且可調(diào)節(jié)感染的免疫應(yīng)答過程，而NF-κB 信號通路在經(jīng)典通路、旁路通路和非典型通路中均被激活，具有重要的調(diào)節(jié)作用，而小膠質(zhì)細胞被認為是存在于腦內(nèi)的巨噬細胞，可表達NF-κB[7-9]，推測七氟烷或可降低小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)且其機制可能與NF-κB 信號通路有關(guān)。為此，本研究探討七氟烷處理對氧糖剝奪—復(fù)糖復(fù)氧（OGD/R）N9 細胞的影響，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

七氟烷（丸石制藥株式會社，進口藥物注冊證號：H20090714）。胎牛血清（FBS）和DMEM（美國Gibco 公司）；細胞培養(yǎng)板（德國Corning 公司）；MTT（美國Sigma 公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物有限公司）；ELISA 試劑盒（上海康成生物有限公司）；二甲基亞砜（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；NO 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗NF-κB（稀釋比例1∶800）（美國SAB 公司）；蛋白提取試劑盒（南京凱基生物有限公司）；大鼠抗CD11b（稀釋比例1∶200）（美國Abcam 公司）；蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物研究所）。電轉(zhuǎn)系統(tǒng)C（美國miniprotein-Ⅲwet transfer unit，Bio-Rad 公司）；PVDF 膜（美國Millipore 公司）；ECL（美國Thermo Scientific 公司）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

N9 細胞來源于小鼠，其細胞結(jié)構(gòu)、功能及形態(tài)與小膠質(zhì)細胞類似，細胞培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境37 ℃、5%CO2。隨機分為對照組、七氟烷+對照組、OGD/R組、七氟烷+OGD/R 組。其中對照組不做任何處理；七氟烷+對照組給予七氟烷處理30 min；OGD/R組給予行氧糖剝奪4h，復(fù)糖復(fù)氧24 h；七氟烷+OGD/R組在OGD/R組的基礎(chǔ)上給予七氟烷處理30 min。

1.3 構(gòu)建OGD/R模型

將正常細胞培養(yǎng)液替換為無糖DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2和95%N2混合氣體的培養(yǎng)箱內(nèi)氧糖剝奪4 h，換為正常細胞培養(yǎng)液后再培養(yǎng)24 h。將細胞培養(yǎng)瓶置于密閉容器內(nèi)，通過七氟烷揮發(fā)罐將不同濃度的（0、0.5%、1.0%、1.5%）七氟烷和含有95%N2及5%CO2的混合氣體連續(xù)吹入進氣口，并在出氣口處連接呼吸末氣體檢測儀，置于37 ℃恒溫孵箱內(nèi)孵育120 min。孵育結(jié)束后棄去舊培養(yǎng)基，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液洗脫30 min。

1.4 LDH活性檢測

各組細胞隨機取5 孔，細胞濃度稀釋為1×105/mL，接種于24 孔板內(nèi)，氧糖剝奪4 h，每孔吸取50 μL 培養(yǎng)基，加入適量LDH 測定試劑，于37 ℃下孵育30 min，采用分光光度計于490 nm 處檢測OD值，以反映LDH含量。

1.5 MTT活性檢測

將各組細胞稀釋為5×104個/mL后接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)細胞直至其貼壁位置，在各細胞孔內(nèi)加入20 μL MTT 溶液（5 mg/L），置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，棄上清液在每孔內(nèi)均加入150 μL DMEM，振蕩并反應(yīng)10 min后，采用分光光度計于490 nm處檢測OD值。

1.6 TNF-α、IL-1β及NO 含量檢測

收集各組細胞，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒操作說明書進行操作。每組隨機取5 孔細胞，濃度為1×105/mL，接種于24 孔板，氧糖剝奪4 h，每孔加入500 μL 培養(yǎng)液，復(fù)糖復(fù)氧24 h，吸取等體積培養(yǎng)液，加入相應(yīng)抗體包被過的96 孔板，孵育30 min采用分光光度計于490 nm 處檢測OD 值，NO 的含量檢測則用分光光度計于550 nm處檢測OD 值，以間接計算NO含量。

1.7 免疫熒光化學(xué)法檢測CD11b表達水平

收集各組細胞棄除細胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）緩沖液洗滌細胞3 次。用4%多聚甲醛室溫固定細胞10 min，再用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌1次。分別加入一抗（大鼠抗CD11b，稀釋比例1∶200），4 ℃過夜。0.01 mol/L PBS 緩沖液洗滌1次，加入二抗（稀釋比例1∶5 000）并在37 ℃下孵育1 h，0.01 mol/L PBS 緩沖液洗滌細胞1次，加入終濃度為1 μg/mL 的熒光染料室溫孵育5 min。

1.8 NF-κB 蛋白的表達水平檢測

收集各組細胞棄上清液，加入裂解液并將細胞刮下，采用BCA 法測定細胞總蛋白含量。沸水煮5 min 使蛋白預(yù)變性。取30 μg 蛋白樣品，12%SDS-PAGE 膠電泳分離,利用電轉(zhuǎn)系統(tǒng)C 轉(zhuǎn)至PVDF 膜，10%脫脂奶粉-TBST（pH 7.5，10 mmol/L Tris-HCI，150 mmol/LnaCl，0.1%Tween-20）室溫封閉1 h，加入一抗（稀釋比例1∶200），4 ℃過夜。TBST 洗滌3次，加入二抗（稀釋比例1∶10 000）并在室溫孵育1 h。ECL發(fā)光底物染1 min。Omega 16IC全自動化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯影分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0 軟件進行作圖及統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，服從正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 N9細胞的活性

七氟烷濃度為0時，N9細胞經(jīng)OGD/R后，MTT活性無改變（P＞0.05），但LDH 活性增加（P=0.023）；對照組N9 細胞給予不同濃度的七氟烷（0.5%、1.0%和1.5%）后，LDH、細胞的活性均未改變（P＞0.05）；OGD/R 組N9 細胞給予不同濃度的七氟烷后，隨著濃度的增加細胞活性明顯增加（P＜0.05），但LDH 活性明顯降低（P＜0.05），當(dāng)七氟烷濃度為1.5%時，效果最為明顯，見圖1。

圖1 七氟烷逆轉(zhuǎn)OGD/R誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活力的降低

2.2 ELISA 實驗檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β及NO的含量

N9 細胞經(jīng)OGD/R 后，炎癥因子TNF-α、IL-1β及NO 的含量均較對照組升高（均P＜0.05）；給予1.5%的七氟烷后，對照組N9細胞的TNF-α、IL-1β及NO 的含量均無明顯變化（均P＞0.05），但OGD/R組N9 細胞的TNF-α、IL-1β 及NO 的含量明顯降低（均P＜0.05），見圖2。

圖2 七氟烷降低OGD/R誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞TNF-α、IL-1β及NO的含量

2.3 免疫熒光化學(xué)法檢測CD11b表達水平

正常狀態(tài)下，CD11b 表達在N9 細胞胞膜與細胞質(zhì)中（圖3A）。N9細胞OGD/R后，CD11b 表達水平較對照組N9 細胞升高（P＜0.05）；給予1.5%的七氟烷后，對照組N9 細胞的CD11b 表達水平無明顯變化（P＞0.05），但OGD/R組N9細胞的CD11b 表達水平明顯降低（P＜0.05，圖3B）。

圖3 七氟烷抑制OGD/R 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞表面分子CD11b 的表達

2.4 Western blot 實驗檢測NF-κB 蛋白表達水平

N9 細胞OGD/R 后，細胞核內(nèi)NF-κB 蛋白表達水平較對照組N9 細胞升高（P＜0.05）；給予1.5%的七氟烷后，對照組N9 細胞的NF-κB 蛋白表達水平無明顯變化（P＞0.05），但OGD/R 組N9 細胞的NFκB 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 七氟烷抑制OGD/R誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞NF-κB 蛋白的表達

3 討論

腦缺血再灌注損傷和修復(fù)過程中炎性反應(yīng)均有重要作用，依據(jù)炎性反應(yīng)的程度和反應(yīng)時間的不同，可對神經(jīng)元產(chǎn)生保護或者損傷的效果[10]。發(fā)生缺血性卒中后小膠質(zhì)細胞可在短時間內(nèi)激活，并釋放TNF-α、IL-β、NO等炎性因子，并誘導(dǎo)細胞黏附分子表達，誘導(dǎo)大量白細胞聚集并穿過血管壁，浸潤腦組織，進一步加重神經(jīng)元損傷[11-12]。本研究中，與正常N9細胞比較，OGD/R組細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β 及NO 的含量升高。分析其原因，細胞因OGD/R后受到刺激導(dǎo)致氧化和抗氧化能力失衡，引起大量TNF-α、IL-β、NO 等炎性因子的釋放，導(dǎo)致OGD/R組細胞炎癥因子的含量顯著上升[13-14]。CD11b是小膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物，小膠質(zhì)細胞活化時，CD11b 表達上調(diào)，當(dāng)細胞過度激活出現(xiàn)凋亡時CD11b 表達下降[15]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，N9 細胞OGD/R后，CD11b 表達水平較正常N9細胞升高，提示N9細胞氧糖剝奪—復(fù)糖復(fù)氧模型制備成功，可用于后續(xù)實驗。

有研究發(fā)現(xiàn)，使用2%七氟烷預(yù)處理2 h 后洗脫30 min能夠減少隨后缺氧和血清剝奪誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）凋亡，且不會增加正常培養(yǎng)MSCs 的凋亡[16]。亦有學(xué)者提出，高于2.3%的七氟烷孵育4 h可誘發(fā)細胞死亡或形態(tài)學(xué)的變化[17-18]，說明七氟烷濃度＜2.3%時安全有效。進一步研究結(jié)果顯示，盡管OGD/R 組N9 細胞隨著七氟烷處理濃度的增加細胞活性也不斷增加，但LDH活性明顯降低，而當(dāng)七氟烷濃度為1.5%時，效果最為明顯，因此考慮選擇濃度為1.5%的七氟烷進行后續(xù)實驗。

NF-κB 廣泛存在于真核細胞內(nèi)，且在多種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中均有重要作用，參與多種病理生理過程[19-20]。NF-κB不僅表達于神經(jīng)元內(nèi)，亦可表達于血管內(nèi)皮細胞及膠質(zhì)細胞中，當(dāng)發(fā)生腦缺血再灌注損傷后，NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性增強[21-22]。激活NF-kB能夠降低氧化應(yīng)激反應(yīng)及興奮性毒性所造成的神經(jīng)元損傷，當(dāng)敲除NF-κB 基因后，腦缺血再灌注損傷程度加重[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷預(yù)處理的OGD/R N9 細胞的培養(yǎng)液中胞核NF-κB 蛋白表達水平降低。提示七氟烷處理的OGD/R N9細胞損傷緩解可能與NF-κB信號通路的活性抑制有關(guān)，擔(dān)尚需更多的實驗研究證實。由于NF-κB 涉及到多種基因的表達，其能夠受限識別TNF-α 等基因的啟動因子，并與啟動序列中的共同序列相結(jié)合以使各炎性因子水平升高[25-26]。因此，本實驗結(jié)果進一步說明七氟烷使各炎性因子水平降低，緩解神經(jīng)炎性反應(yīng)，其機制可能與NF-κB信號通路有關(guān)，但是否通過抑制NF-κB 信號通路進而降炎性因子的水平仍有待下一步驗證。

綜上所述，七氟烷可降低OGD/R誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)，其機制可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。