萬 兵，王 鶴

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，南寧 530021）

子宮頸癌（cervical cancer，CC）仍是最常見的婦科惡性腫瘤，在全球女性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均居第四位[1]。宮頸癌中約99.7%以上存在人乳頭狀瘤病毒DNA，高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)病變（squamous intraepithelial lesion，SIL）及宮頸癌發(fā)生的主要致病因子。但并不是所有的宮頸HPV感染者都會朝著宮頸癌變的方向進展[2]。除高危型HPV持續(xù)性感染外，宮頸微環(huán)境中的微生物群落的變化在對宮頸癌前病變（CIN）進展及宮頸癌的發(fā)生中也起著十分重要的作用。在宮頸上皮細胞癌變過程中，可能存在其他致癌因素或協(xié)同HPV作用的因素，增加宮頸上皮細胞感染HPV 的易感性，導(dǎo)致HPV持續(xù)存在最終發(fā)生癌變，但這種致癌作用的潛在機制大部分仍然不清楚[3]。這些致癌因素包括遺傳因素、環(huán)境因素、細胞防御、免疫功能，以及特定于機體的基因和細胞因子[4]。

陰道是一個相對密閉、缺氧和定植著多種菌群的微生態(tài)環(huán)境，而宮頸陰道部直接暴露在陰道微生態(tài)環(huán)境中。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌是陰道中最主要的優(yōu)勢菌，可占90%左右[5]，與其他微生物共同構(gòu)筑起人體黏膜微生物屏障，其在拮抗多種病原菌、維持陰道微生態(tài)平衡和抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要的作用。鑒于乳酸桿菌作為定植于人體黏膜上的益生菌，卷曲乳酸桿菌又是其中檢出率最常見菌種之一。因此，本研究采用卷曲乳酸桿菌與宮頸鱗癌細胞（SiHa細胞）共培養(yǎng)，探討其抗腫瘤作用，以期為預(yù)防和治療宮頸癌提供新的策略和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞系與細菌 宮頸鱗癌細胞株SiHa 由上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院贈送，經(jīng)STR鑒定與SiHa細胞完全匹配（EV 值為1.0），在含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和100 g/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）中培養(yǎng)。卷曲乳酸桿菌（CGMCC：1.2743）購自中國科學(xué)院微生物研究所，在MRS 固體/液體培養(yǎng)基（北京索萊寶公司）分離和增菌培養(yǎng)，置于厭氧培養(yǎng)箱中。

1.2 共培養(yǎng)體系的建立 以5×105個/孔的細胞密度將SiHa 細胞接種于6 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次，再加入無青―鏈霉素含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液。卷曲乳酸桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)48 h后，用無抗生素含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液重懸，按細菌∶細胞=200∶1（即感染復(fù)數(shù)=200）加入每孔細胞中，在細胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h，分別在6 h、12 h、18 h、24 h 顯微鏡下觀察細胞生長情況。以培養(yǎng)24 h 后未加卷曲乳酸桿菌的SiHa 細胞及細胞上清液作為對照組，記為0 h。

1.3 CCK-8法檢測共培養(yǎng)前、后的細胞活力 SiHa細胞以5×103個/孔接種于96孔板，每個檢測時間點設(shè)置3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后更換為無青－鏈霉素的培養(yǎng)基，按感染復(fù)數(shù)=200加入卷曲乳酸桿菌，混勻，在含5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。檢測前棄去原培養(yǎng)液，然后向每孔加入100 μL無青－鏈霉素含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基及10 μL CCK-8試劑，避光培養(yǎng)2 h。正常組的空白孔為不含卷曲乳酸桿菌的新鮮培養(yǎng)液，共培養(yǎng)組的空白孔為含有等量卷曲乳酸桿菌的無抗生素新鮮培養(yǎng)液。用酶標儀檢測各孔在450 nm 波長處的吸光度（OD）值，并減去同組的空白孔OD值，繪制細胞增殖曲線。

1.4 流式細胞術(shù)檢測SiHa 細胞凋亡 收集正常組（未加卷曲乳酸桿菌）、陽性對照組（加入30 μg/mL順鉑并培養(yǎng)48 h）及與卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)6 h、12 h、18 h 及24 h 的細胞上清液。用不含EDTA 的胰酶消化SiHa 細胞，與同孔細胞上清液混合后離心，棄去上清，加入100 μL 1×Binding Buffer 重懸細胞，分別加入5 μL PI和5 μL FITC染料，冰上避光反應(yīng)15 min 后再分別加入200 μL 1×Binding Buffer 重懸細胞，200 目過濾網(wǎng)過濾后，用CytoFLEX 流式儀檢測細胞凋亡。

1.5 細胞上清液中白細胞介素（IL）-2含量檢測

收集正常組和與卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)6 h、12 h、18 h 和24 h 的細胞上清液，2 000 r/min 離心15 min 后收集上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測各組細胞上清液中IL-2含量。檢測過程嚴格按照試劑盒（武漢Elabscience 公司）說明書進行操作。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測增殖細胞核抗原（PCNA）基因表達量 收集細胞，Trizol法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)條件：95 °C 預(yù)變性30 s；95 °C 變性5 s，60°C 退火、延伸34 s，共循環(huán)40 次。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算PCNA相對表達量。引物序列如下：PCNA上游：5’-TCCATCCTCAAGAAGGTGTT-3’，下游：5’-GGTAGGTGTCGAAGCCC-3’；GAPDH 上 游：5’-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3’，下游：5’-CACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卷曲乳酸桿菌對SiHa 細胞形態(tài)的影響 正常組的SiHa 細胞體積較大，形態(tài)飽滿，呈梭形或多邊形，細胞核大，并可見較多處于分裂的細胞；加入卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)后，大量的卷曲乳酸桿菌黏附在SiHa細胞膜外，細胞體積逐漸縮小，形態(tài)變圓，細胞間隙逐漸增大，漂浮和死亡的細胞明顯增多，貼壁細胞明顯減少，見圖1。

圖1 卷曲乳酸桿菌對SiHa細胞生長形態(tài)的影響（200×）

2.2 卷曲乳酸桿菌對SiHa 細胞增殖的影響 與正常組比較，共培養(yǎng)組在12 h后SiHa細胞增殖被顯著抑制（P＜0.001），見圖2。

圖2 卷曲乳酸桿菌對SiHa細胞增殖的影響

2.3 卷曲乳酸桿菌對SiHa 細胞凋亡的影響 共培養(yǎng)6 h、12 h、18 h 和24 h 的細胞較正常組細胞凋亡率顯著增高（均P＜0.01），陽性對照組細胞凋亡率顯著高于共培養(yǎng)組（P＜0.001），見圖3。

圖3 卷曲乳酸桿菌對SiHa細胞凋亡率的影響

2.4 卷曲乳酸桿菌作用SiHa細胞不同時間后上清液中IL-2 含量變化 與正常組比較，IL-2 分泌量在共培養(yǎng)6 h 和12 h 顯著升高（P＜0.001），在共培養(yǎng)18 h 降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），共培養(yǎng)24 h顯著下降（P＜0.01），見圖4。

圖4 卷曲乳酸桿菌作用SiHa細胞不同時間后上清液中IL-2含量變化

2.5 PCNA 基因在共培養(yǎng)前后的表達變化 與卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h的SiHa細胞PCNA mRNA 相對表達量分別為0.650±0.147、0.430±0.226、0.212±0.241、0.242±0.081，與正常組（1.027±0.272）比較，在共培養(yǎng)12 h 開始顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

乳酸桿菌的抗腫瘤作用的機制是多方面的，既可以通過激活宿主的免疫系統(tǒng)，也可以通過產(chǎn)生胞外多糖、細菌素等發(fā)揮抗癌作用。Shiomi 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳中的乳酸桿菌，其產(chǎn)生的胞外多糖在活的生物體內(nèi)同樣具有抗腫瘤活性。不同屬、種、株的乳酸菌都能分泌出不同的細菌素，具有很好的抗腫瘤效果。乳酸桿菌激活宿主免疫系統(tǒng)的途徑包括誘導(dǎo)IL-12、IL-2、IL-4、IFN-γ 等抗腫瘤因子的表達[7]，增強多種免疫細胞的免疫效力[8]，增強樹突狀細胞對宮頸腫瘤細胞的免疫殺傷能力[9]，激活巨噬細胞及其他免疫細胞。

本研究發(fā)現(xiàn)，SiHa細胞加入卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)后，細胞內(nèi)空亮、體積變小、形態(tài)變圓的細胞逐漸增多，漂浮的細胞明顯增多。同時，CCK8細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)12 h后SiHa細胞生長開始受到顯著抑制，細胞凋亡率顯著增高（P＜0.05），說明卷曲乳酸桿菌對SiHa 細胞生長有顯著的抑制作用。Si-Ha細胞與卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)6 h和12 h后IL-2水平均顯著升高（P＜0.05），但隨著共培養(yǎng)時間繼續(xù)延長，SiHa 細胞分泌的IL-2 水平出現(xiàn)了下降，在共培養(yǎng)24 h時IL-2水平顯著下降（P＜0.05），此時IL-2的表達下降可能與細胞凋亡和死亡顯著增高、活細胞數(shù)量大大減少有關(guān)。有文獻報道，宮頸癌細胞中有IL-2的表達，加入低劑量的IL-2可促進宮頸癌細胞的增殖，而高劑量的IL-2 則表現(xiàn)出抑制作用[10]。宮頸癌細胞分泌的IL-2 可能在免疫逃逸和腫瘤細胞生長方面起著重要作用。本研究結(jié)果提示，卷曲乳酸桿菌可刺激SiHa細胞分泌大量的IL-2，大量分泌出的IL-2 可能是抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的重要因素，可能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞微環(huán)境中Th1 型向Th2 型細胞因子漂移的現(xiàn)象，后續(xù)將進一步研究卷曲乳酸桿菌作用細胞分泌IL-2的機制。

本課題組前期通過生物信息學(xué)分析初步篩選發(fā)現(xiàn)PCNA 是SIL 發(fā)生的差異基因。PCNA 作為細胞增殖的標志蛋白，參與DNA 合成、復(fù)制及損傷修復(fù)過程，其表達與腫瘤的惡性程度關(guān)系密切，PCNA表達越高，細胞增殖分裂的越快[11]。本研究中，宮頸癌SiHa細胞中PCNA表達在加入卷曲乳酸桿菌12 h后顯著下降（P＜0.05），PCNA基因降低趨勢與細胞生長受抑制的情況一致。表明卷曲乳酸桿菌能通過下調(diào)宮頸癌SiHa 細胞的PCNA 表達而抑制宮頸癌SiHa 細胞的增殖。提示卷曲乳酸桿菌在抑制宮頸癌的增殖具有潛在應(yīng)用價值。本研究中PCNA的差異表達驗證了本課題組此前的發(fā)現(xiàn)，可作為SIL預(yù)警分子靶標。

鑒于益生菌對人體安全無毒，卷曲乳酸桿菌的抗癌研究近年來成為熱點。國外研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可以靶向定植于實體腫瘤中，而在正常的組織中并未發(fā)現(xiàn)其的存在[12]。乳酸桿菌作為兼性厭氧菌，對實體腫瘤有著良好的靶向，可選擇性聚集于腫瘤的低氧區(qū)域，這為乳酸桿菌在腫瘤基因治療上提供了臨床應(yīng)用的新方向。Aires等[13]發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可較完整地表達HPV16型的病毒顆粒，并引起小鼠產(chǎn)生HPV16型病毒的抗體，可為乳酸桿菌作為黏膜疫苗用于防治宮頸病變提供重要的理論依據(jù)。隨著乳酸桿菌的深入研究和應(yīng)用，可為治療HPV感染及宮頸病變開辟新的途徑，為防治SIL 和宮頸癌提供實驗和理論依據(jù)。