林 楚，劉凱麗，王 瀟，蒙麗恒，秦映芬

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 530021）

原發(fā)性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上比較多見(jiàn)的一種腫瘤性疾病，每年因此疾病而死亡的人數(shù)約占全世界總死亡數(shù)的一半以上[1]。根據(jù)目前的研究可知，2 型糖尿?。═ype 2 diabetes，T2DM）與肝癌發(fā)生之間具有明確的相關(guān)性，T2DM患者患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)可以增加大約2.5倍[2-4]。作為糖尿病的早期表現(xiàn)，血糖水平的升高可能直接調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，特別是滿(mǎn)足癌細(xì)胞對(duì)高糖的需求[5-6]，提示高糖可促進(jìn)肝臟腫瘤形成的能力。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的主要因素。肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移后，5 年存活率不足15%[7]。大量證據(jù)顯示，肝細(xì)胞由惡性發(fā)展到肝癌，以及癌細(xì)胞脫落并獲得遷移和侵襲能力的所有過(guò)程中均可發(fā)生上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）[8-11]。EMT是肝癌發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的原始動(dòng)力。此外，大量的研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下，不論是正常細(xì)胞還是癌細(xì)胞都可能發(fā)生EMT 的改變[12-13]。然而，在高糖環(huán)境下肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制尚不清楚。

轉(zhuǎn)錄因子E2F1（E2F transcription factor 1，E2F1）作為新陳代謝的調(diào)節(jié)器可參與維持機(jī)體代謝與穩(wěn)態(tài)的所有組織的發(fā)育及分化過(guò)程[14]。近年來(lái)，E2F 家族的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)腫瘤的影響也逐漸被報(bào)道。研究報(bào)道[15]，高糖可以刺激E2F1 的表達(dá)，并通過(guò)促進(jìn)E2F1/RRBP1信號(hào)通路的激活可加速肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。E2F1 調(diào)控著肝癌的惡性發(fā)展過(guò)程[16-18]，但是關(guān)于高糖條件下E2F1 如何促進(jìn)肝癌發(fā)展尚不可知，E2F1 能否對(duì)肝癌早期轉(zhuǎn)移標(biāo)志的EMT產(chǎn)生影響，更是未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討高糖條件下E2F1與Huh-7肝癌細(xì)胞EMT的相關(guān)關(guān)系，并初步探索可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人Huh-7肝癌細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。人Huh-7 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)在包含有DMEM 完全培養(yǎng)基3～5 mL 的培養(yǎng)瓶中，用含胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)Huh-7 細(xì)胞。放于37 ℃恒溫5%CO2的溫箱中。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選用的siRNA 靶序列：GAGACCTCTTCGACTGTGA。為了獲得E2F1 沉默的Huh-7 細(xì)胞，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)采用riboFECT?CP Reagent 的轉(zhuǎn)染試劑對(duì)Huh-7細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 細(xì)胞活力測(cè)定

采用CCK-8試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力。將Huh-7細(xì)胞鍍?cè)?6孔板中。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞培養(yǎng)為分別為0 h、24 h、48 h 和72 h，然后在每個(gè)孔中加入10 μL CCK8（10 mg/mL），孵育2 h，在450 nm的測(cè)試波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）

細(xì)胞在添加PMSF 的RIPA 緩沖液中裂解，用SDS-PAGE分離蛋白裂解液并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。在此之后，在5%脫脂牛奶緩沖液中室溫孵育2 h，4 ℃搖床孵育一晚。用TBST緩沖液洗滌3次，PVDF膜與二抗孵育放在室溫下?lián)u床1～2 h即可。然后采用ECL試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行曝光顯影，在Image J軟件中對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行計(jì)算，目的蛋白/內(nèi)參灰度值的比值便是相應(yīng)的相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-PCR）

采用Trizol（America Invitrogen）制備總RNA。采用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA。實(shí)時(shí)PCR 引物序列，見(jiàn)表1。應(yīng)用qPCR 擴(kuò)增儀（Bio-Rad CFX connect Real-Time System，Bio-Rad，Hercules，CA）進(jìn)行定量PCR。以GAPDH用作內(nèi)參。

表1 各引物序及其序列

1.6 侵襲和遷移試驗(yàn)

采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的遷移和侵襲能力。對(duì)于侵襲試驗(yàn)，用移液槍混勻DMEM 培養(yǎng)基與Corning Matrigel 膠后吸取100 μL加入到Transwell小室的上室。對(duì)下室給予10%FBS的培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)24 h 后用蘸有PBS 的濕棉簽溫柔地將上室中的細(xì)胞擦拭干凈，將小室底面先后放入甲醇及0.1%的結(jié)晶紫中各半小時(shí)，最后在顯微鏡下觀察侵襲的細(xì)胞數(shù)并保存照片留檔。對(duì)于劃痕試驗(yàn)，細(xì)胞被生長(zhǎng)在6 孔板中匯合，在0 h 受傷，并在0 h和48 h的時(shí)間點(diǎn)拍照。用移液槍100 μL規(guī)格的槍頭劃傷細(xì)胞。然后用PBS液清洗，去除游離漂浮的細(xì)胞和碎片，在不同糖濃度的DMEM培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24 h。最后在Imag J軟件中計(jì)算出各組的劃痕愈合率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或者方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖促進(jìn)了Huh-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

CCK-8 試驗(yàn)結(jié)果顯示，在0 h 時(shí)兩組細(xì)胞的吸光度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高糖組細(xì)胞的吸光度值增長(zhǎng)較對(duì)照組明顯加快（P＜0.05）（圖1）。Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明，高糖組細(xì)胞的侵襲數(shù)目明顯多于對(duì)照組（圖2）；劃痕試驗(yàn)顯示，高糖組細(xì)胞的劃痕愈合率較對(duì)照組增加（P＜0.05）（圖3）。

圖1 兩組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值

圖2 不同濃度葡萄糖對(duì)Huh-7細(xì)胞侵襲的影響

圖3 不同葡萄糖濃度對(duì)Huh-7細(xì)胞遷移能力的影響

2.2 高糖條件下加速了Huh-7細(xì)胞的EMT過(guò)程

與對(duì)照組相比，高糖組EMT 相關(guān)標(biāo)志物（βcatenin、Vimentin、α-SMA）表達(dá)升高（P＜0.05）（圖4）。

圖4 不同葡萄糖濃度下EMT的表達(dá)情況

2.3 高糖下E2F1表達(dá)情況

對(duì)照組和高糖組分別培養(yǎng)Huh-7 細(xì)胞48 h。Western blotting 和RT-PCR 結(jié)果顯示，高糖組E2F1相對(duì)蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖5）；高糖組E2F1 mRNA水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖5 不同葡萄糖濃度下E2F1的表達(dá)

2.4 高糖通過(guò)上調(diào)E2F1促進(jìn)Huh-7細(xì)胞EMT和侵襲、遷移

在高糖環(huán)境下，培養(yǎng)沉默E2F1 的Huh-7 細(xì)胞為HG+SIE 組，未沉默E2F1 的Huh-7 細(xì)胞為HG+NC 組。分別對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行Transwell 侵襲、遷移試驗(yàn)，結(jié)果表明，HG+SIE組細(xì)胞的侵襲數(shù)和遷移數(shù)均少于HG+NC 組細(xì)胞的侵襲數(shù)（P＜0.05）（圖6、圖7）。用Western blotting 和RT-PCR 實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞中EMT 相關(guān)標(biāo)記物（E-cadherin、Vimentin、α-SMA）的表達(dá)，結(jié)果表明，HG+SIE組細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)較HG+NC組下降（P＜0.05）（圖8）。

圖6 E2F1對(duì)Huh-7細(xì)胞侵襲性的影響

圖7 E2F1對(duì)Huh-7細(xì)胞遷移的影響

圖8 E2F1對(duì)EMT表達(dá)的影響

3 討論

糖尿病的發(fā)病率越來(lái)越高，預(yù)計(jì)到2045年將有近7 億人受到糖尿病的影響。而HCC 將成為全球第6 大最常見(jiàn)診斷癌癥和第4 大癌癥相關(guān)死亡原因[19]。超過(guò)一半的新診斷癌癥病例和死亡病例發(fā)生在中國(guó)[1,20-22]。因此，中國(guó)作為糖尿病及肝癌的高發(fā)區(qū)，糖尿病與肝癌的關(guān)系理應(yīng)給予更多的關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖可促進(jìn)Huh-7細(xì)胞的增殖，并且通過(guò)Transwell 侵襲試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)也提示高糖可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，與既往的研究結(jié)果相似。

E2F1可以參與對(duì)癌細(xì)胞的代謝重組，與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，為重要的促癌因子[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在小細(xì)胞肺癌的進(jìn)程中，E2F1 參與調(diào)控其中的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程[23]；在對(duì)腎細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，E2F1 表達(dá)上調(diào)可加速細(xì)胞周期中G1/S 期的轉(zhuǎn)變，使癌細(xì)胞的增值、遷移和侵襲作用增強(qiáng)[24]；在通過(guò)對(duì)E2F1 轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中也觀察到其肝臟中腫瘤的形成[25]。雖然E2F1 在肝癌中的作用已被公認(rèn)，但E2F1調(diào)控肝癌的機(jī)制卻是復(fù)雜多樣的。研究表明，E2F1 可以通過(guò)Cyclin E1/E2、Pin-1、SKP2、EZH2/CCRK、miR429/RBBP4 等作用促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及生長(zhǎng)[9,26]。此外，過(guò)表達(dá)的E2F1 還可通過(guò)調(diào)節(jié)H19使肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲能力增加[27]。本研究結(jié)果顯示，Huh-7肝癌細(xì)胞在高糖環(huán)境中E2F1的表達(dá)量相對(duì)于正常糖濃度培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，再次證實(shí)了高糖對(duì)E2F1的促進(jìn)作用。

EMT 在人體中主要參與胚胎形成、器官發(fā)育、組織愈合，同時(shí)也參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，通過(guò)改變細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和運(yùn)動(dòng)[28]。EMT 通常伴隨著間充質(zhì)細(xì)胞特有的蛋白質(zhì)表達(dá)（比如β-catenin，Vimentin、α-SMA）和上皮標(biāo)志物的丟失（比如E-cadherin）[29]。如前所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖促進(jìn)了Huh-7 細(xì)胞侵襲和遷移能力，并且證實(shí)了高糖對(duì)E2F1 的促進(jìn)作用。但E2F1 和EMT 的關(guān)系尚不清楚。本研究中將Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)于不同糖濃度的培養(yǎng)基中，通過(guò)Transwell 侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明，高糖環(huán)境僅可以加強(qiáng)Huh-7 細(xì)胞的侵襲遷移能力，而且EMT 相關(guān)指標(biāo)（E-cadherin、Vimentin、α-SMA）的表達(dá)水平均增加。雖然在經(jīng)典的EMT過(guò)程中，通常被定義為E-cadherin等指標(biāo)的丟失和Vimentin等指標(biāo)的上調(diào)，本研究中高表達(dá)的E-cadherin 似乎與既往典型EMT標(biāo)志物的改變相矛盾，但仍有大量的研究結(jié)果與此結(jié)論并不一致甚至相反。在對(duì)乳腺癌和唾液腺癌的分析中顯示，E-cadherin 的表達(dá)與腫瘤的侵襲性之間并不存在完全的相關(guān)關(guān)系[30-31]。雖然在腫瘤巢邊緣和多細(xì)胞簇浸潤(rùn)前沿的癌細(xì)胞中，Ecadherin 是呈現(xiàn)較低表達(dá)的狀態(tài)，但在實(shí)體腫瘤巢中心的癌細(xì)胞中卻幾乎是正常表達(dá)E-cadherin[32]。甚至一些晚期癌癥在表達(dá)細(xì)胞間質(zhì)性改變的同時(shí)，也保留E-cadherin高表達(dá)水平以及高度分化的上皮細(xì)胞的特征[30]。從最近Karaosmano?lu 等[33]的研究中也發(fā)現(xiàn)，Huh-7肝癌細(xì)胞中，Slug介導(dǎo)細(xì)胞在發(fā)生EMT 過(guò)程時(shí)呈現(xiàn)出E-cadherin 表達(dá)的升高，其分子的改變也和經(jīng)典的EMT并不相同。此外，有證據(jù)表明，EMT 可以分為部分性EMT[34]和完全性EMT[35]。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷完全性EMT 時(shí)，以E-cadherin 為代表的上皮性“開(kāi)關(guān)”將會(huì)完全喪失；然而，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生部分性EMT 時(shí)，并非所有的上皮特征（如E-cadherin）完全被間質(zhì)特征的標(biāo)記物（如Vimentin）所取代，而是出現(xiàn)的一個(gè)同時(shí)表達(dá)的共存現(xiàn)象。因此，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生部分性EMT時(shí)，可在上皮特征不完全喪失或間質(zhì)特征不完全獲得的情況下便啟動(dòng)轉(zhuǎn)移[37]。有研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的犬腎MDCK細(xì)胞在發(fā)生部分性EMT 過(guò)程中，E-cadherin 的表達(dá)也可呈現(xiàn)瞬時(shí)性上調(diào)，說(shuō)明E-cadherin 的上調(diào)是可參與至EMT的發(fā)生[41]。為探討在高糖條件下Huh-7肝癌細(xì)胞EMT 的發(fā)生是否由E2F1 介導(dǎo)，本研究采用沉默Huh-7肝癌細(xì)胞中E2F1的表達(dá)，以便進(jìn)一步探討二者之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境中，將細(xì)胞中E2F1 沉默后，與對(duì)照組相比，Huh-7 肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力都隨之減弱，同時(shí)EMT相關(guān)標(biāo)志物Vimentin、α-SMA 的表達(dá)也出現(xiàn)降低，綜合本研究結(jié)果得知在高糖的條件下細(xì)胞中E2F1 可介導(dǎo)EMT 的發(fā)生，但其中的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究仍然存在一些不足之處。首先，本研究結(jié)果均只在細(xì)胞層面上進(jìn)行驗(yàn)證，且也僅限于Huh-7肝癌細(xì)胞。其次，與眾多研究相符，本研究顯示高糖時(shí)細(xì)胞在功能上發(fā)生EMT的改變，但是在分子層面上細(xì)胞發(fā)生EMT 時(shí)E-cadherin 的結(jié)果卻與多數(shù)研究不盡相同，后續(xù)可以在此方面進(jìn)行更深入的探索。

綜上所述，本研究證實(shí)高糖可通過(guò)上調(diào)E2F1，促進(jìn)EMT增強(qiáng)Huh-7細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，為后續(xù)肝癌及糖代謝相關(guān)關(guān)系的研究提供了可靠理論基礎(chǔ)。