朱盼盼 邢麗紅 李兆新 孫海新 孫曉杰 鄭旭穎 張夢婷

摘要：? 針對養(yǎng)殖的甲殼類水產(chǎn)品多次被檢出未使用呋喃西林但氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)超標(biāo)的現(xiàn)狀，為解決呋喃西林特征性代謝產(chǎn)物氨基脲內(nèi)源性和外源性無法區(qū)分的問題，本文對氨基脲的本底質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氨基脲來源與產(chǎn)生機(jī)制、呋喃西林代謝物殘留檢測技術(shù)等方面進(jìn)行綜述。通過對甲殼類產(chǎn)品中氨基脲本底質(zhì)量分?jǐn)?shù)、甲殼類產(chǎn)品中氨基脲來源及產(chǎn)生機(jī)制、呋喃西林代謝物殘留檢測技術(shù)、存在問題及展望進(jìn)行綜述，并對內(nèi)源性氨基脲干擾導(dǎo)致的假陽性問題，尋找內(nèi)源性氨基脲形成機(jī)制，篩選檢測呋喃西林藥物的標(biāo)志物，建立有效的檢測方法。該綜述為后續(xù)研究呋喃西林代謝物的檢測方法和解決氨基脲假陽性問題提供參考。

關(guān)鍵詞：? 甲殼類水產(chǎn)品; 呋喃西林; 氨基脲; 氨基脲來源; 檢測方法

中圖分類號： S912? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

收稿日期： 20210315; 修回日期： 20210430

基金項(xiàng)目： 國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（41806148）;? 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（2020TD71）

作者簡介：? 朱盼盼（1995），女，山東聊城人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量與安全。

通信作者：? 李兆新，男，研究員，主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量與安全。 Email： Lizx@ysfri.ac.cn

氨基脲（semicarbazide， SEM）是呋喃西林的特征性代謝產(chǎn)物，呋喃西林藥物作為一種人工合成的抗菌藥，抗菌譜較廣，對多種革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抗菌作用，療效好、價(jià)格低廉、不易產(chǎn)生耐藥性，在畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)應(yīng)用廣泛。使用呋喃西林藥物后，原藥在生物體內(nèi)很快得到降解，產(chǎn)生代謝物氨基脲，在體內(nèi)和蛋白質(zhì)結(jié)合形成穩(wěn)定的殘留物質(zhì)存在數(shù)周。由于氨基脲對人體具有致癌致畸的副作用[1]，歐盟、日本等發(fā)達(dá)國家及我國先后制定了禁止使用該類藥物的規(guī)定。2003年，歐盟通過了2003/181/EC委員會決議，建立了用于水產(chǎn)品中呋喃西林代謝物氨基脲的各種檢測方法，并規(guī)定最小要求性能限值為1 μg/kg。近幾年監(jiān)督檢查結(jié)果表明，很多甲殼類水產(chǎn)品氨基脲含量嚴(yán)重超標(biāo)，尤其是沼蝦產(chǎn)品最為突出，但在養(yǎng)殖過程中沒有使用呋喃西林藥物，從而導(dǎo)致該類產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題備受質(zhì)疑，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展。為解決氨基脲內(nèi)源性和外源性無法區(qū)分的問題，許多研究者在不同蝦中進(jìn)行氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測，研究發(fā)現(xiàn)氨基脲作為內(nèi)源性物質(zhì)在甲殼類產(chǎn)品中普遍存在，且在不同甲殼類水產(chǎn)品中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異，至今還沒有方法可以直接檢測氨基脲的來源，因此不能將氨基脲作為檢測呋喃西林藥物的標(biāo)志物。當(dāng)前迫切需要解決內(nèi)源性氨基脲干擾導(dǎo)致的假陽性問題，尋找內(nèi)源性氨基脲形成機(jī)制，篩選檢測呋喃西林藥物的標(biāo)志物，建立有效的檢測方法，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)健康有效發(fā)展。本文主要從甲殼類產(chǎn)品中氨基脲的本底質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氨基脲來源與產(chǎn)生機(jī)制、呋喃西林代謝物殘留檢測技術(shù)等方面進(jìn)行綜述，希望能對后續(xù)研究提供參考。

1 甲殼類氨基脲的來源與產(chǎn)生機(jī)制

氨基脲又名氨基甲酰肼，化學(xué)式為CH5N3O，是一種白色晶體，易潮解，溶于水，不溶于無水乙醇和乙醚，用于醫(yī)藥、農(nóng)藥等有機(jī)合成的中間體。氨基脲分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。氨基脲來源廣泛，其來源與產(chǎn)生機(jī)制主要包括以下幾方面。

1.1 呋喃西林代謝產(chǎn)生

呋喃西林作為廣譜抗菌藥物，效果好，不易產(chǎn)生抗藥性，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。黃宣運(yùn)等人[2]研究了室外池塘自然養(yǎng)殖環(huán)境下呋喃西林在中華絨螯蟹中代謝規(guī)律，用濃度為20 mg/L和80 mg/L的呋喃西林溶液浸泡中華絨螯蟹60 min后，移至不含藥的池塘中飼養(yǎng)，停藥2 h，中華絨螯蟹的肌肉、肝胰腺和鰓中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到高峰，其中20 mg/L實(shí)驗(yàn)組的測定值分別為152±21.7，234.0±12.0，3160±169 μg/kg;80 mg/L實(shí)驗(yàn)組測定值分別為327±31.2，372±27.2，4623±247 μg/kg，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組氨基脲的殘留濃度遠(yuǎn)高于判定限量;樊新華等人[3]研究呋喃西林在中國絨螯蟹體內(nèi)的代謝規(guī)律，35 d后不同實(shí)驗(yàn)組中華絨螯蟹殘留氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為95、91、80、11 μg/kg;李東利等人[4]研究了呋喃西林在中國對蝦中的代謝規(guī)律，發(fā)現(xiàn)20 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組織中氨基脲殘留量依次為肌肉（11.09±0.47） μg/kg>鰓（1.77±0.53） μg/kg>甲殼（1.56±0.66） μg/kg>血淋巴（0.69±0.13） μg/kg>肝胰腺（0.55±0.07） μg/kg，肌肉中最高;辛少平等人[5]測定氨基脲在對蝦中的代謝規(guī)律，發(fā)現(xiàn)停藥后氨基脲在對蝦肌肉內(nèi)富集質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為51.5 μg/kg;王明興等人[6]研究呋喃西林在凡納濱對蝦中的代謝規(guī)律，發(fā)現(xiàn)30 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組織氨基脲殘留濃度仍然較高，肌肉、鰓、血淋巴、肝胰腺、腸線質(zhì)量濃度分別為30.36，9.97，6.05，5.49，1.90 μg/kg，其中肌肉組織中的殘留量明顯高于其它組織。

1.2 加工過程產(chǎn)生

除了使用呋喃西林藥物導(dǎo)致氨基脲殘留外，J. Johnston等人[7]用雞肉作為檢測樣品，雞肉樣品加工處理前未檢出氨基脲，加工處理后檢出氨基脲，表明樣品檢出氨基脲并不是呋喃西林藥物造成;程波等人[8]分析了非呋喃西林氨基脲的來源，包括外界遷移性污染、生產(chǎn)加工過程產(chǎn)生等外界因素;R. H. Stadler等人[9]收集了多種食品的數(shù)據(jù)，并檢測海鮮（甲殼類動物、魚粉）、肉類（牛肉、雞肉粉）、乳制品（如奶粉、酸奶）、蜂蜜和其他種類中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明氨基脲普遍存在，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)有差異，加工過程中使用的原料有產(chǎn)生氨基脲的成分，加工過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)也會產(chǎn)生氨基脲;李紅權(quán)等人[10]發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品在生產(chǎn)加工過程中原料檢驗(yàn)合格，加工過程中使用消毒水、保鮮劑等輔料后檢出含有氨基脲。

1.2.1 偶氮二甲酰胺產(chǎn)生

偶氮二甲酰胺（Azodicarbonamide，ADC）用作泡沫塑料發(fā)泡劑，廣泛用于聚乙烯等合成材料，作為高溫分解型發(fā)泡劑應(yīng)用在饅頭、面包等膨脹有氣孔的食品中，同時(shí)也是一種具有漂白和氧化作用的面粉改良劑，以增加產(chǎn)品的韌性彈性，還可作為化學(xué)發(fā)泡劑廣泛應(yīng)用于各種塑料級橡膠產(chǎn)品的生產(chǎn)。趙天祎等人[11]在蜂蜜中檢測到氨基脲，可能是由于密封罐內(nèi)墊圈的原因?qū)е掳被逋馊?Ye J等人[12]研究了不同面制品中ADC熱降解形成氨基脲的原因，在高溫和水分條件下，通過聯(lián)二脲中間體形成氨基脲;陳志鋒等人[13]在食品接觸材料中發(fā)現(xiàn)金屬墊圈中加入發(fā)泡劑ADC經(jīng)過加熱后分解成氨基脲;蔣志紅等人[1415]發(fā)現(xiàn)含ADC的面粉經(jīng)干熱、濕熱處理均能形成氨基脲，形成的氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)會受到不同條件的影響;姚敬等人[16]檢測ADC和產(chǎn)生氨基脲的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)證明濕熱條件下可以形成氨基脲。

1.2.2 次氯酸鹽

次氯酸鹽具有強(qiáng)氧化性和漂白性，廣泛用于食品加工、水產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)的衛(wèi)生處理和消毒，與菌體核酸和酶等產(chǎn)生氯化反應(yīng)，從而殺死病原微生物。袁濤等人[17]在雞肉中使用次氯酸鹽，結(jié)果表明次氯酸鹽處理的雞肉中氨基脲檢出值高于未經(jīng)次氯酸鹽處理的雞肉中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù);楊曦等人[18]通過改變次氯酸鹽的質(zhì)量濃度、浸泡時(shí)間、水產(chǎn)品接觸消毒水的面積等方面來檢測對氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，結(jié)果表明氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)和次氯酸鹽濃度、浸泡時(shí)間、消毒水的面積成正比;G.A.Abernethy等人[19]在次氯酸鹽處理食品中發(fā)現(xiàn)通過氨的氯化生成肼，然后任一途徑可在吖嗪形成時(shí)聚合，隨后與脲化合物反應(yīng)，氨基甲酸根離子可能通過與肼反應(yīng)生成氨基脲;J.G. Bendall等人[20]通過實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為尿素和次氯酸鹽在高酸堿度下發(fā)生霍夫曼反應(yīng)，產(chǎn)生氨基脲。

1.2.3 溫度影響

溫度對氨基脲的產(chǎn)生具有重要作用。曹愛玲等人[21]在不同溫度下檢測南美白對蝦及中華鱉中的氨基脲，發(fā)現(xiàn)溫度高低和氨基脲的檢出量成正比關(guān)系，并且甲殼中氨基脲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其它組織;Yu W L等人[22]檢測了不同條件下空白蝦樣品中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)在高溫下易形成氨基脲。

1.3 從外界環(huán)境中攝入

自然界中甲殼類生物攝食的天然食物在體內(nèi)可能轉(zhuǎn)化為氨基脲，生存環(huán)境可能受到氨基脲的污染，通過長時(shí)間富集導(dǎo)致生物體內(nèi)氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷累積。徐英江等人[23]調(diào)查潮河入海口鄰近海域海水、沉積物和生物體內(nèi)氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)氨基脲在潮河口鄰近海域海水、沉積物和生物體內(nèi)濃度都沿潮河向下呈放射性遞減分布;田秀慧等人[24]發(fā)現(xiàn)氨基脲作為一種新型的海洋環(huán)境污染物，在海水和沉積物中長時(shí)間存在并不斷地富集，最終在海洋生物體內(nèi)累積;于召強(qiáng)等人[25]檢測了四十里灣海洋貝類氨基脲的富集程度，隨著時(shí)間推移，海水中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加，貝類中的氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)也增加。

1.4 天然來源氨基脲

氨基脲在很多產(chǎn)品中天然存在，如在一些未使用硝基呋喃藥物的雞蛋粉、雄峰蛹粉、紅藻提取物中均檢出過氨基脲，可能與加工過程或自身生長過程有關(guān)系。倪永付等人[26]檢測微山湖的小青蝦不同部位，結(jié)果顯示未使用呋喃西林藥物仍檢測到氨基脲，推測蝦本身產(chǎn)生氨基脲;于慧娟等人[27]測定了野生甲殼類水產(chǎn)品的氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明氨基脲作為內(nèi)源性物質(zhì)在甲殼類產(chǎn)品中普遍存在;M.Robert等人[28]研究羅氏沼蝦中氨基脲可能產(chǎn)生的途徑，收集了不同地點(diǎn)的樣品，包括未使用硝基呋喃藥物的羅氏沼蝦，結(jié)果表明氨基脲在羅氏沼蝦中天然存在;C.Van Poucke等人[29]在實(shí)驗(yàn)室中養(yǎng)殖羅氏沼蝦，經(jīng)檢測沼蝦中存在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氨基脲，養(yǎng)殖環(huán)境在實(shí)驗(yàn)室中，排除使用呋喃西林藥物處理之后產(chǎn)生的氨基脲。

1.5 甲殼類水產(chǎn)品氨基脲產(chǎn)生機(jī)制研究

曹愛玲等人[30]分析中華鱉粉中氨基脲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和來源，發(fā)現(xiàn)中華鱉骨粉中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于中華鱉肉粉中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)一步蛋白分析表明氨基脲的產(chǎn)生與樣品蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氨基酸組成密切相關(guān);彭婕等人[31]分析了中華絨螯蟹甲殼中氨基脲的殘留水平、甲殼素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及氨基酸組成，結(jié)果表明，蟹甲殼中甲殼素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與氨基脲殘留水平成正比，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及氨基酸組成與氨基脲殘留水平成反比，推斷甲殼素和蛋白質(zhì)及其水解氨基酸可能與氨基脲的形成具有相關(guān)性，并且前處理過程中可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生氨基脲;J.V.Samsonova等人[32]分離并鑒定了與呋喃西林體內(nèi)結(jié)合有關(guān)的蛋白質(zhì)，第1個(gè)被鑒定為含有質(zhì)量濃度高的氨基脲蛋白質(zhì)是白蛋白;謝冬冬等人[33]對雞肉中不同組織的氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示氨基脲的生成不僅與蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)，還和氨基酸組成有關(guān)，其中精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高;張樂年等人[34]研究不同雞組織經(jīng)NaClO處理后產(chǎn)生的氨基脲與樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)，其中精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異是氨基脲生成量差異的主要原因;Yu W等人[35]推測內(nèi)源性氨基脲的形成可能與精氨酸的胍基、瓜氨酸和尿素的酰胺結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2 甲殼類產(chǎn)品中氨基脲本底質(zhì)量分?jǐn)?shù)

氨基脲在不同甲殼類產(chǎn)品中的含量差異較大，同一產(chǎn)品在不同組織中也存在差異，本文對幾種主要甲殼類產(chǎn)品中氨基脲本底質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了分類總結(jié)。

2.1 蝦中氨基脲本底質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.1.1 日本沼蝦

日本沼蝦又名青蝦或河蝦，隸屬十足目長臂蝦科沼蝦屬，是我國主要淡水蝦養(yǎng)殖品種之一。于慧娟等人[27]對日本沼蝦不同組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)肌肉組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為4.06～11.87 μg/kg，頭部組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為58.6～81.3 μg/kg，甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為68.4～315.3 μg/kg;王鼎南等人[36]測得日本沼蝦甲殼中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍30.0～77.0 μg/kg，肌肉組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍1.38～9.82 μg/kg;舒秀君等人[37-38]對日本沼蝦中氨基脲存在特征進(jìn)行研究，一致認(rèn)為日本沼蝦各個(gè)組織中均含有結(jié)合態(tài)和游離態(tài)氨基脲，總氨基脲在日本沼蝦甲殼組織中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，肌肉組織中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少;舒秀君等人[37]發(fā)現(xiàn)氨基脲在甲殼、眼柄、附肢、頭胸部組織中主要以結(jié)合態(tài)形式存在;宋蓓等人[38]認(rèn)為肌肉、胰腺團(tuán)和目組織中氨基脲主要以結(jié)合態(tài)形式存在，比例大于50%，甲殼、足和鰓組織中氨基脲主要以游離態(tài)形式存在，結(jié)合態(tài)氨基脲比例小于20%;舒秀君[39]研究野生日本沼蝦的不同組織的氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)野生日本沼蝦各組織中均含有氨基脲，肌肉、甲殼、肝胰腺、鰓和眼柄組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.62～4.18 μg/kg，93.42～284.19 μg/kg，3.32～23.29 μg/kg，4.05～13.56 μg/kg，33.72～65.17 μg/kg。

2.1.2 羅氏沼蝦

羅氏沼蝦又稱泰國蝦。于慧娟等人[27]測定結(jié)果表明，羅氏沼蝦肌肉組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.23±0.05 μg/kg，頭部組織氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.8±2.3 μg/kg，甲殼中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為73.2±9.7 μg/kg;王鼎南等人[36]研究發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦肌肉組織中氨基脲檢出值在1.63～4.41 μg/kg;張睿等人[40]對羅氏沼蝦中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，整蝦中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在2.3～6.1 μg/kg，甲殼中氨基脲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在27.2～29.2 μg/kg;范清濤等人[41]研究結(jié)果顯示，羅氏沼蝦肌肉組織氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.71～2.72 μg/kg，甲殼組織氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.38～64.16 μg/kg。

2.1.3 南美白對蝦

曹愛玲等人[21]研究南美白對蝦肌肉和甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)肌肉組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5 μg/kg，甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍12.3±1.96 μg/kg;于慧娟等人[27]研究發(fā)現(xiàn)，在南美白對蝦肌肉組織中未檢出氨基脲，頭部組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85±0.06 μg/kg，甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.4±1.5 μg/kg;C.Van Poucke等人[29]檢測不同地區(qū)的南美白對蝦，甲殼中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.5～2.6 μg/kg，肌肉中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5 μg/kg;王鼎南等人[36]對南美白對蝦肌肉組織中氨基脲進(jìn)行測定，結(jié)果表明氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～6.36 μg/kg;范清濤等人[41]檢測南美白對蝦肌肉組織氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.76 μg/kg，甲殼組織氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.42～10.27 μg/kg。

2.1.4 中國對蝦

中國明對蝦，又稱中國名對蝦、東方對蝦，屬對蝦科。李東利等人[4]研究呋喃西林代謝物在中國對蝦體內(nèi)的消除代謝規(guī)律時(shí)，測得空白中國對蝦各組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于1 μg/kg。

2.1.5 克氏原螯蝦

于慧娟等人[27]檢測克氏原螯蝦不同組織中的氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明肌肉組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.52±0.03 μg/kg，頭部組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.06±0.09 μg/kg，甲殼中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.57±0.09 μg/kg。

2.1.6 斑節(jié)蝦

于慧娟等人[27]在斑節(jié)蝦肌肉組織中未檢出氨基脲，但頭部組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.95±0.07 μg/kg，甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.46±0.41 μg/kg;范清濤等人[41]發(fā)現(xiàn)斑節(jié)蝦肌肉組織氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.76 μg/kg，甲殼組織氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.04～15.36 μg/kg。

2.2 蟹中氨基脲本底質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2.1 中華絨螯蟹

黃宣運(yùn)等人[2]在中華絨螯蟹肌肉、肝胰腺和鰓組織中均未檢出氨基脲;于慧娟等人[27]檢測中華絨螯蟹甲殼組織氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.55±0.53 μg/kg，肌肉組織氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.05 μg/kg;彭婕等人[31]研究發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹肌肉、肝臟和鰓等組織中均未檢出氨基脲，但蟹殼中均有氨基脲檢出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.48～24.31 μg/kg，且不同處理方式氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)有很大差別，活體蟹甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為3.50～10.74 μg/kg死體蟹甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為3.99～9.81 μg/kg，煮熟蟹甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為4.22～9.49 μg/kg，新長軟殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為3.45～3.85 μg/kg;王鼎南等人[36]對中華絨螯蟹進(jìn)行了氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為0.597 μg/kg，肌肉組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～1.19 μg/kg;張睿等人[40]檢測中華絨螯蟹甲殼組織中，氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.4 μg/kg，肌肉組織中零氨基脲。

2.2.2 海蟹

海蟹一般指三疣梭子蟹。于慧娟等[27]檢測海蟹甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.2±1.4 μg/kg，肌肉組織中未檢出氨基脲;張睿等人[40]對海蟹組織中的氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)海蟹甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)26.5 μg/kg，肌肉組織中未檢出氨基脲。

2.2.3 鋸緣青蟹

于慧娟等人[27]檢測鋸緣青蟹不同組織的氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在肌肉組織中未檢出氨基脲，甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.8±7.0 μg/kg。

2.2.4 珍寶蟹

于慧娟等人[27]檢測珍寶蟹不同組織的氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，頭部組織中未檢出氨基脲，甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.3±4.8 μg/kg。

2.3 中華鱉

中華鱉，又名水魚、甲魚、團(tuán)魚，屬龜鱉目鱉科。于慧娟等人[27]檢測中華鱉不同組織的氨基脲，結(jié)果表明肌肉組織中未檢出氨基脲，甲殼組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.36 μg/kg;曹愛玲等人[21]研究中華鱉不同組織的氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn)鱉肉和鱉殼中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于0.5 μg/kg。

3 呋喃西林代謝物殘留檢測技術(shù)

3.1 氨基脲檢測方法

使用呋喃西林藥物后，原藥在生物體內(nèi)很快降解，半衰期只有數(shù)小時(shí)，但其代謝物氨基脲能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成穩(wěn)定的殘留物質(zhì)長期存在，因此常以氨基脲作為檢測食品中非法使用呋喃西林的標(biāo)志物。氨基脲常用的檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，免疫學(xué)測定方法等。

3.1.1 高效液相色譜法

早期國內(nèi)外報(bào)道的關(guān)于硝基呋喃藥物殘留檢測方法多數(shù)是檢測原藥化合物，常用的檢測儀器有紫外檢測器和二極管陣列檢測器。我國于2004年發(fā)布了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3022—2004，用于檢測水產(chǎn)品中呋喃唑酮的殘留量，然而硝基呋喃類原藥在體內(nèi)代謝快速，原型藥物很短時(shí)間就降至檢出限以下，而其代謝產(chǎn)物則以蛋白結(jié)合態(tài)形式長期穩(wěn)定存在，因而檢測代謝產(chǎn)物更有意義。由于呋喃結(jié)構(gòu)的紫外光譜吸收不明顯，直接測定靈敏度低，無法滿足硝基呋喃類代謝殘留限量的檢測要求。為提高靈敏度，需通過衍生化方式生成具有強(qiáng)紫外吸收的化合物。Wang Y等人[42]將高效液相色譜法和熒光檢測法相結(jié)合，檢測限和定量限分別為0.15 μg/kg和0.5 μg/kg，檢測限低于歐盟規(guī)定的最低要求性能水平。我國于2008年發(fā)布了農(nóng)業(yè)部1077號公告22008[43]，該方法以二氯苯甲醛作為衍生化試劑，采用高效液相色譜法紫外檢測法分析水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物，方法定量限為1.0 μg/kg，能夠滿足我國現(xiàn)行判定標(biāo)準(zhǔn)。Sheng L Q等人[44]以2羥基1萘甲醛為衍生化試劑，在酸性條件下與硝基呋喃類代謝物衍生化，建立了高效液相色譜熒光檢測法分析動物源性產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物，4種代謝物定量限均低于1.0 μg/kg，滿足我國現(xiàn)行判定標(biāo)準(zhǔn)。

3.1.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法比高效液相色譜法靈敏度高、選擇性好、精密度高，提高了目標(biāo)化合物的定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以排除高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法檢測的假陽性結(jié)果，能夠進(jìn)行代謝物的確證。氨基脲是一類小分子化合物，分子質(zhì)量在75 g/mol，在該質(zhì)荷比范圍內(nèi)質(zhì)譜背景干擾較大，離子碎片不具備特征性，因此直接測定氨基脲的結(jié)果是不理想的。通過衍生化之后，增加了分子質(zhì)量和特征碎片離子的選擇性，提高了質(zhì)譜響應(yīng)?，F(xiàn)有方法多以2硝基苯甲醛為衍生化試劑，衍生化氨基以增加代謝物的離子化效率，生成硝基苯衍生物，再經(jīng)提取凈化后，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。氨基脲在水生動物體內(nèi)有兩種存在形式結(jié)合態(tài)和游離態(tài)。李金強(qiáng)等人[45]建立了偶氮二甲酰胺分解產(chǎn)生氨基脲的檢測方法;丁磊等人[4549]建立了水產(chǎn)品中氨基脲總量的測定方法。Du N N等人[5052]建立了甲殼類水產(chǎn)中氨基脲總量的測定方法;李虞明[53]建立了貝類中氨基脲總量的測定方法;Tang T等人[54]建立了魚類中氨基脲總量的測定方法;C.Van Poucke等人[29，5559]建立了結(jié)合態(tài)氨基脲的測定方法;劉正才等人[60]開展不同方法對氨基脲測定結(jié)果的對比研究，結(jié)果表明由于樣品制備中洗滌和不洗滌的差異，各檢測方法中檢測結(jié)果差異顯著。

3.1.3 免疫分析法

免疫分析法操作簡單，靈敏度高，不需要昂貴的儀器操作，檢測成本低，同時(shí)可以滿足現(xiàn)場大批量樣品快速檢測，節(jié)省時(shí)間和資源。

3.1.3.1 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法利用特異性抗體，可以在短時(shí)間內(nèi)篩查大量的水產(chǎn)樣本。李泳寧等人[61]采用間接競爭酶聯(lián)免疫技術(shù)建立呋喃西林檢測方法，在0.1～10.0 ng/mL具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998 7，IC50為1.43 ng/mL;Fang Z等人[62]建立直接酶免疫吸附檢測方法，檢測限低至0.07 μg/L，該方法比競爭酶免疫吸附方法更快速;閆葉娜[63]以人工合成的氨基脲單克隆抗體檢測氨基脲，最低檢測限為0.03 ng/mL，IC50為2.19 ng/mL;任海濤等人[64]設(shè)計(jì)合成半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備免疫原并免疫新西蘭大白兔，IC50為12.37 ng/mL，定量檢測限范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.439～110.78 ng/mL，檢測限IC10達(dá)到0.07 ng/mL，黃登宇等人[65]用衍生化后的氨基脲半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)成為包被原，線性范圍為0.123～2.398 ng/mL，IC50為0.544 ng/mL;Wang Q等人[66]以山羊抗小鼠免疫球蛋白為對照，得出氨基脲最低檢測線為0.75 μg/kg;李軍[67]以5硝基糠醛為分子模板合成了硝基呋喃類藥物的共有半抗原，制備相應(yīng)的免疫抗原并免疫新西蘭白兔，交叉反應(yīng)率為95%，IC50為95 ng/mL，最低檢測限為8.3 ng/mL。

3.1.3.2 膠體金免疫法

免疫膠體快速檢測法具有操作簡便、攜帶方便、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，可以在現(xiàn)場對樣品進(jìn)行快速檢測。王佳[68]通過膠體金定量免疫層析方法檢測氨基脲，蝦肉中氨基脲檢測限為0.15 μg/kg;謝世紅等人[69]檢測南美白對蝦肌肉組織中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)，最低檢出限為1.0 μg/kg，假陽性率小于5%，假陰性率為0;趙正苗等人[70]用膠體金免疫層析法檢測氨基脲，檢測限為1.0 μg/kg，和謝世紅等人[69]假陽性率和假陰性率結(jié)果一致，對其他藥物無交叉反應(yīng);柳愛春等人[71]在對水產(chǎn)品中氨基脲快速衍生化之后建立免疫膠體金檢測方法，最低檢出限為1.0 μg/kg，與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測結(jié)果相比，符合率為98%。

3.2 新型生物標(biāo)志物5硝基2糠醛

5硝基2糠醛（5nitro22furaldehyde，5NF）是呋喃西林藥物代謝的另一種產(chǎn)物，微溶于水，性質(zhì)不穩(wěn)定，對光敏感，代謝較快。呋喃西林代謝物與衍生物化學(xué)式如圖2所示。J.G.Bendall等人[20，7276]研究了5硝基2糠醛作為標(biāo)志物檢測呋喃西林，并用2，4二硝基苯肼進(jìn)行柱前衍生，將5硝基2糠醛轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的腙類化合物，再進(jìn)行分離提取純化并檢測;Zhang S等人[77]以2，4二硝基苯肼作為衍生劑、對二甲基氨基苯甲醛為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行柱前衍生化，并成功地用于5硝基2糠醛的測定，定量限和檢測限分別為0.2，0.1 ng/g;Wang Y等人[78]提出了呋喃西林一種新的標(biāo)志物氰基代謝物，經(jīng)過使用呋喃西林藥物喂養(yǎng)鯰魚檢測氰基代謝物，發(fā)現(xiàn)氰基代謝物可以在體內(nèi)存在長達(dá)2周，消除半衰期為81 h。不管是5硝基2糠醛還是氰基代謝物，其在生物體內(nèi)半衰期短，代謝快速，均不宜作呋喃西林的代謝標(biāo)志物。

4 結(jié)束語

甲殼類水產(chǎn)品中氨基脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)超標(biāo)的原因不僅僅是呋喃西林藥物產(chǎn)生的代謝物，而且其他途徑也會產(chǎn)生氨基脲，具體機(jī)理仍在研究中。氨基脲的產(chǎn)生原因包括內(nèi)源性和外源性，目前內(nèi)源性氨基脲的形成機(jī)制尚不明確，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是目前測定氨基脲最通用的確證技術(shù)，但現(xiàn)有檢測技術(shù)無法區(qū)分呋喃西林源氨基脲和非呋喃西林源氨基脲。氨基脲在甲殼類不同生物和同種生物不同組織中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異，其來源和具體的產(chǎn)生機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。隨著多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和成熟，借助蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)建立新型呋喃西林代謝標(biāo)志物的方法成為可能。優(yōu)化檢測技術(shù)，并且提高殘留風(fēng)險(xiǎn)評估方法的應(yīng)用，利用各種方法學(xué)研究氨基脲形成機(jī)制。開展內(nèi)源性氨基脲鑒別技術(shù)研究對解決氨基脲假陽性問題、探究內(nèi)源性氨基脲形成機(jī)理有重要意義。研究氨基脲控制技術(shù)可以減少并控制氨基脲的污染源，提高質(zhì)量安全，減少食品安全問題。

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Research Progress of Semicarbazide in Crustacean Products

ZHU Panpan1，2，3， XING Lihong1，3， LI Zhaoxin1，3， SUN Haixin2， SUN Xiaojie1，3， ZHENG Xuying1，3， ZHANG Mengting1，3

（1. Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao 266100， China;

2. College of Life Sciences， Qingdao University， Qingdao 266071， China;

3. Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology （Qingdao）， Qingdao 266237， China）

Abstract：? For breeding of shellfish aquatic products in which many times unused nitrofurazone was detected but semicarbazide excessive levels of the status qua， in order to solve the problem that nitrofurazone semicarbazide endogenous and exogenous characteristic metabolites can′t distinguish， in this paper， the background content of semicarbazide， semicarbazide sources and generation mechanism， nitrofurazone metabolite residues detecting technology， etc.， were summarized. Semicarbazide has been identified as a characteristic metabolite of nitrofurazone drugs and as a marker to monitor illicit use of nitrofurazone in food. After the use of nitrofurazone， the active drug degrades quickly in living organisms， and its metabolite， semicarbazide， combines with protein to form stable residues， which are referred to human through the food chain and harm human health. Semicarbazide from natural sources is found in crustacean products without using nitrofurazone， which seriously affects the effective implementation of aquatic product quality and safety supervision and law enforcement. Of shellfish products， crustaceans semicarbazide background content in the product source and generation mechanism， semicarbazide nitrofurazone metabolite residues detection technology， problems and prospects were reviewed. For the false positive problem caused by endogenous semicarbazide interference， it looks for endogenous semicarbazide formation mechanism， screening to detect markers of nitrofurazone drugs， and establishes an effective detection method. This review provides a reference for further research on the detection methods of nitrofurazone metabolites and solving the problem of false positive semicarbazide.

Key words： crustacean aquatic products; nitrofurazone; semicarbazide; semicarbazide sources; detection technology