李 玉，李剛強(qiáng)，徐永貴，趙建國(guó)，張 珂，金寶丹

（1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué) 材料與化學(xué)工程學(xué)院環(huán)境污染治理與生態(tài)修復(fù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001；2. 鄭州航空港區(qū)明港水務(wù)有限公司，河南 鄭州 450001；3. 河南省對(duì)外科技交流中心，河南 鄭州 450001）

鋼鐵、制藥、紡織、造紙等行業(yè)廢水以及垃圾焚燒、農(nóng)藥降解和水體氯消毒等過程產(chǎn)生的廢水中均含有多種氯酚類污染物［1-3］，質(zhì)量濃度高達(dá)幾十至上百mg/L［4］。一些市政污水和污染水體中的氯酚含量也在μg/L到mg/L范圍內(nèi)［5］。氯酚類化合物可通過食物鏈向高等生物體內(nèi)轉(zhuǎn)移，即使是低濃度的氯酚進(jìn)入人體，也會(huì)對(duì)其免疫、神經(jīng)、呼吸等系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用［6］。因此，氯酚類化合物已被許多國(guó)家列為優(yōu)先控制污染物，我國(guó)頒布的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749—2006）［7］也將其列為常規(guī)水質(zhì)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。

通常選用活性污泥工藝處理含氯酚廢水，在降解廢水中氯酚類污染物的同時(shí)可去除其他污染物［8］。為實(shí)現(xiàn)活性污泥中降解氯酚的優(yōu)勢(shì)菌群快速富集，可在氯酚廢水處理過程中投加易降解碳源，通過共代謝的方式去除氯酚。但碳源類型及添加比例會(huì)引起污泥絮體結(jié)構(gòu)和菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［8］。另外，可通過采用不同的反應(yīng)器以及調(diào)整運(yùn)行參數(shù)等手段提高活性污泥的抗沖擊和耐受能力，進(jìn)而更有效地降解氯酚［5，9］。廢水中污染物的降解是通過微生物代謝過程中產(chǎn)生的酶實(shí)現(xiàn)的，氯酚類污染物在降解過程中會(huì)產(chǎn)生過量自由基，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活、脂質(zhì)過氧化和DNA損傷等［10-11］。而微生物產(chǎn)生的過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）可清除自由基，在維持微生物活性方面起到重要作用［12］。脫氫酶（DHA）活性可用來表征污染物的降解程度［13］。

本研究采用序批式生物反應(yīng)器（SBR）處理進(jìn)水質(zhì)量濃度為10 mg/L的2，4，6-三氯苯酚（2，4，6-TCP）模擬廢水，考察2，4，6-TCP對(duì)污泥性能和菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為含氯酚廢水的處理提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

2，4，6-TCP（純度大于98.0%），Tokyo化工有限公司提供；HPLC級(jí)甲醇（純度大于99.9%），北京京科瑞達(dá)科技有限公司；碳酸氫鈉、鹽酸、磷酸、高錳酸鉀、磷酸二氫鉀和重鉻酸鉀等：均為分析純。

LC-10ATVP型高效液相色譜儀：日本島津公司；ICS 1000型離子色譜儀：美國(guó)瓦里安儀器公司；TGL-20bR型高速低溫離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；Five Easy TM型pH計(jì)：瑞士METTLER TOLEDO公司；YSI Pro1020型便攜式溶解氧（DO）計(jì)：美國(guó)YSI公司。

1.2 污泥接種及SBR運(yùn)行

取市政污水處理廠曝氣池污泥，用自來水清洗3次并曝氣24 h后接種至有效體積為5 L的2個(gè)圓柱形SBR中，SBR的外徑和高度分別為20 cm和25 cm?；旌弦簯腋」腆w濃度（MLSS）和污泥體積指數(shù)（SVI）分別為2.5 g/L和90 mL/g。實(shí)驗(yàn)期間，模擬廢水中的碳源由甲醇提供，進(jìn)水COD為（300 ±20）mg/L。模擬廢水中補(bǔ)充微生物代謝所需的氮、磷和金屬元素［8］。

采用碳酸氫鈉溶液和稀鹽酸溶液調(diào)整進(jìn)水pH為7.2±0.4。實(shí)驗(yàn)組SBR投加進(jìn)水質(zhì)量濃度為10 mg/L的2，4，6-TCP，對(duì)照組SBR則不投加2，4，6-TCP。SBR每天運(yùn)行2個(gè)周期，每個(gè)周期12.00 h，包括進(jìn)水0.15 h，運(yùn)行11.00 h，靜置0.70 h和排水0.15 h。采用定時(shí)開關(guān)控制SBR運(yùn)行期間為間歇曝氣，曝氣與不曝氣時(shí)間均設(shè)置為2.00 h，DO為（1.5±0.5）mg/L，并通過攪拌使DO與活性污泥充分接觸。2個(gè)SBR共計(jì)運(yùn)行76 d。

1.3 分析方法

采用pH計(jì)和DO計(jì)定期測(cè)定SBR運(yùn)行過程中的pH和DO；采用重鉻酸鹽法［14］和重量法［15］分別測(cè)定出水COD和MLSS；采用高效液相色譜儀測(cè)定水相和泥相中的2，4，6-TCP質(zhì)量濃度；采用離子色譜儀測(cè)定水相中Cl-質(zhì)量濃度。

1.4 酶活性分析

取SBR泥水混合液在12 000 r/min和4 ℃條件下高速低溫離心5 min，棄去上清液，用磷酸緩沖液清洗污泥3次，所得污泥用于酶活性的測(cè)定。采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定CAT活性［16］；采用加入人工受氫體氯化三苯基四氮唑（TTC）的方法測(cè)定DHA活性［16］；采用購自南京建成科技有限公司的試劑盒測(cè)定SOD活性。每個(gè)樣品的酶活性測(cè)定重復(fù)3次。

1.5 菌群結(jié)構(gòu)分析

當(dāng)實(shí)驗(yàn)組SBR運(yùn)行結(jié)束后，采用溶酶菌-SDS-氯仿異戊醇法提取污泥的基因組DNA［17］。細(xì)菌16 S擴(kuò)增上游引物（357-F-GC）和下游引物（518r）序列分別為5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCG GGGCGGGGGCACGGGGGGGGCCTACGAGGC AGCAG-3’，5’- ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。按照BioLinker公司提供的說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)和Reconditioning PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增產(chǎn)物通過40%～60%的變性梯度凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后對(duì)凝膠染色、拍照，并用滅菌刀切割優(yōu)勢(shì)條帶。

采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN）回收切割條帶中的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物的二次擴(kuò)增引物去掉GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)，利用BioLinker公司的pED-T載體試劑盒克隆PCR產(chǎn)物。挑選平板上的克隆，用Amp抗性LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌液濃度培養(yǎng)至OD600值為2～3時(shí)，對(duì)菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海BioSune 生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序和整理。為保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 SBR出水COD隨運(yùn)行時(shí)間的變化情況

SBR出水COD隨運(yùn)行時(shí)間的變化見圖1?？紤]到溫度顯著影響微生物的代謝［18］，故從運(yùn)行第10天開始利用加熱棒控制SBR的水溫為（25±1）℃，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組SBR出水COD短暫升高，表明微生物需要一定的時(shí)間來應(yīng)對(duì)水溫的突然升高。此后，對(duì)照組SBR出水COD逐漸降低并趨于穩(wěn)定。從22 d至運(yùn)行結(jié)束，其出水COD在（85.7±14.0）mg/L的范圍內(nèi)波動(dòng)。

圖1 SBR出水COD隨運(yùn)行時(shí)間的變化

SBR運(yùn)行1～14 d，實(shí)驗(yàn)組SBR出水COD逐漸升高，在第14 天時(shí)達(dá)到292.8 mg/L，推斷認(rèn)為進(jìn)水中的2，4，6-TCP顯著抑制污泥活性；運(yùn)行14～60 d，SBR出水COD逐漸降低，60 d后COD在（143.0±7.6）mg/L的范圍內(nèi)波動(dòng)。在整個(gè)SBR運(yùn)行階段，實(shí)驗(yàn)組SBR的出水COD顯著高于對(duì)照組，表明2，4，6-TCP的毒性持續(xù)影響污泥活性。

2.2 MLSS隨運(yùn)行時(shí)間的變化情況

MLSS隨運(yùn)行時(shí)間的變化見圖2。由圖2可見：對(duì)照組SBR的MLSS在2.5 g/L附近上下波動(dòng)；實(shí)驗(yàn)組SBR的MLSS隨運(yùn)行時(shí)間逐漸降低，在第25天時(shí)低至1.6 g/L；隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)，降解2，4，6-TCP的優(yōu)勢(shì)菌逐漸富集，污泥活性部分恢復(fù)。在整個(gè)SBR運(yùn)行階段，實(shí)驗(yàn)組SBR的MLSS一直低于對(duì)照組，這是因?yàn)槁确宇惢衔锸且活惤馀悸?lián)劑，可抑制微生物的代謝生長(zhǎng)［19］。

圖2 MLSS隨運(yùn)行時(shí)間的變化

2.3 2，4，6-TCP質(zhì)量濃度隨運(yùn)行時(shí)間的變化情況

實(shí)驗(yàn)組SBR水相和泥相中2，4，6-TCP質(zhì)量濃度隨運(yùn)行時(shí)間的變化見圖3。由圖3可見：運(yùn)行1～15 d，水相和泥相中積累的2，4，6-TCP質(zhì)量濃度均逐漸升高，兩者之和超過進(jìn)水的10 mg/L，這是因?yàn)檫M(jìn)水中的2，4，6-TCP逐漸積累至泥相還未被降解；運(yùn)行15～70 d，隨著降解2，4，6-TCP的優(yōu)勢(shì)菌的富集，進(jìn)水中的2，4，6-TCP逐漸被降解，水相和泥相中2，4，6-TCP的質(zhì)量濃度顯著下降；至SBR運(yùn)行結(jié)束，水相和泥相中仍可檢測(cè)到2，4，6-TCP的殘留，這是因?yàn)?，4，6-TCP的毒性和難降解特性導(dǎo)致其去除較慢。

圖3 實(shí)驗(yàn)組2，4，6-TCP質(zhì)量濃度隨運(yùn)行時(shí)間的變化

2.4 活性污泥的SEM表征結(jié)果

對(duì)照組SBR活性污泥和實(shí)驗(yàn)組SBR活性污泥的SEM照片見圖4。由圖4可見：實(shí)驗(yàn)組SBR活性污泥表面被微生物分泌的黏性物質(zhì)包裹；而對(duì)照組SBR活性污泥中的微生物則聚集成簇，單個(gè)微生物清晰可見。這是因?yàn)闉榈挚?，4，6-TCP的毒性作用，活性污泥中的微生物分泌了大量的胞外聚合物。而已有的研究也證實(shí)了氯酚類化合物會(huì)誘導(dǎo)活性污泥分泌胞外聚合物［15］。

圖4 對(duì)照組SBR活性污泥（a）和實(shí)驗(yàn)組SBR活性污泥（b）的SEM照片

2.5 單個(gè)SBR周期中2，4，6-TCP和COD的去除情況

當(dāng)實(shí)驗(yàn)組SBR運(yùn)行至第72天時(shí)，單個(gè)SBR周期不同時(shí)間點(diǎn)的COD、2，4，6-TCP質(zhì)量濃度和Cl-質(zhì)量濃度見圖5。由圖5a可知：對(duì)照組SBR進(jìn)水中的COD被快速降解，在9.00 h時(shí)COD最低（42.0 mg/L），12.00 h時(shí)略有升高（72.0 mg/L），推斷認(rèn)為甲醇屬于易降解碳源，前6.00 h被快速降解，12.00 h時(shí)升高則是由部分微生物因死亡釋放碳源引起；實(shí)驗(yàn)組SBR進(jìn)水COD的降解情況顯著低于對(duì)照組，在9.00 h時(shí)達(dá)到最低（88.0 mg/L），12.00 h時(shí)同樣略有升高，為148.0 mg/L。由圖5b可見，隨著COD的降解，進(jìn)水2，4，6-TCP吸附至污泥被降解，積累至污泥的最大2，4，6-TCP質(zhì)量濃度出現(xiàn)在3.00 h（2.87 mg/L），水相中Cl-質(zhì)量濃度的升高也表明2，4，6-TCP被有效地降解，2，4，6-TCP降解過程中釋放的Cl-證實(shí)部分氯代轉(zhuǎn)化產(chǎn)物存在于SBR中。推斷認(rèn)為，雖然降解2，4，6-TCP的優(yōu)勢(shì)菌隨運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)而富集，但2，4，6-TCP及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的毒性會(huì)長(zhǎng)期抑制污泥活性，導(dǎo)致其出水COD高于對(duì)照組。在后續(xù)的研究中，可考慮采用延長(zhǎng)運(yùn)行時(shí)間或縮短HRT的方式來降解2，4，6-TCP，以及通過鑒定2，4，6-TCP降解過程的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物推導(dǎo)其代謝路徑。

圖5 單個(gè)SBR周期中COD（a）和實(shí)驗(yàn)組2，4，6-TCP質(zhì)量濃度、Cl-質(zhì)量濃度（b）隨運(yùn)行時(shí)間的變化

2.6 單個(gè)SBR周期中酶活性的變化

當(dāng)實(shí)驗(yàn)組SBR運(yùn)行至第72天時(shí)，單個(gè)SBR周期不同時(shí)間點(diǎn)的CAT、DHA和SOD活性見圖6。由圖6可見，實(shí)驗(yàn)組污泥中CAT和DHA活性顯著升高，分別為對(duì)照組的1.29～1.58倍和1.56～1.93倍。這是因?yàn)榻?jīng)長(zhǎng)時(shí)間馴化后，降解2，4，6-TCP的優(yōu)勢(shì)菌富集，污泥活性逐漸恢復(fù)，DHA活性升高可有效降解廢水中的2，4，6-TCP。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，氯酚類污染物降解過程中會(huì)產(chǎn)生多種有毒的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物［10］，而較高的CAT活性可消除有毒物質(zhì)對(duì)微生物的損傷。實(shí)驗(yàn)組SBR的SOD活性在6.00 h時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照組的1.49倍，其余時(shí)間略低于或與對(duì)照組相當(dāng)。推斷認(rèn)為，2，4，6-TCP在前6.00 h的降解導(dǎo)致有毒物質(zhì)的過量積累，誘導(dǎo)SOD活性在單個(gè)SBR周期的6.00 h達(dá)到最大值，而后隨著有毒物質(zhì)的降解，SOD活性降低。前期的相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)難降解有機(jī)污染物可誘導(dǎo)不同酶活性的升高，與本研究的結(jié)果一致［20］。

圖6 單個(gè)SBR周期中不同酶活性隨運(yùn)行時(shí)間的變化

2.7 2，4，6-TCP對(duì)污泥菌群結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)檢測(cè)，對(duì)照組SBR污泥經(jīng)不含2，4，6-TCP的模擬廢水馴化培養(yǎng)后，富集的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Chryseobacteriumsp.、Leadbetterellasp.、Erysipelothrixsp.、Pontibacillussp.、Boseasp.和Salimesophilobactersp.［17］。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組SBR運(yùn)行結(jié)束后，污泥中的優(yōu)勢(shì)菌主要為Methylobacillussp.、Pseudomonassp.、Pseudoxanthomonassp.、Leadbetterellasp.、Achromobactersp.、Stenotrophomonassp.和Salimesophilobactersp.，2，4，6-TCP顯著改變了污泥的菌群結(jié)構(gòu)。經(jīng)2，4，6-TCP馴化富集的優(yōu)勢(shì)菌大都具有降解氯酚類或芳香烴類污染物的能力［17，21-22］。另外，部分菌如Pseudoxanthomonassp.在代謝過程中可分泌表面活性劑等活性因子，可降低氯酚類污染物對(duì)微生物的毒害作用［23］。

3 結(jié)論

a）采用SBR處理2，4，6-TCP質(zhì)量濃度為10 mg/L的模擬廢水，2，4，6-TCP的存在顯著抑制污泥活性。隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)，污泥中降解2，4，6-TCP的優(yōu)勢(shì)菌逐漸富集，污泥活性逐漸恢復(fù)，進(jìn)水COD和2，4，6-TCP被有效降解。

b）進(jìn)水2，4，6-TCP及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的毒性會(huì)長(zhǎng)期抑制污泥活性，為抵抗其毒性并將其降解，活性污泥中的微生物分泌了大量的胞外聚合物。污泥中CAT和DHA活性顯著升高，SOD活性在單個(gè)SBR周期的6.00 h達(dá)到最大值，而后隨著有毒物質(zhì)的降解，SOD活性降低。

c）當(dāng)實(shí)驗(yàn)組SBR運(yùn)行結(jié)束后，污泥中富集的優(yōu)勢(shì)菌主要為Methylobacillussp.、Pseudomonassp.、Pseudoxanthomonassp.、Leadbetterellasp.、Achromobactersp.、Stenotrophomonassp.和Salimesophilobactersp.，大都具有降解氯酚類污染物的能力。