田仁江，鄭于臻，楊星萍，譚劍，申飄，蔡偉杰，廖洪映*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，廣東 廣州 510955；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院胸外科，廣東 廣州 510955)

肺癌是全世界最常見(jiàn)、最致命的惡性腫瘤之一。死亡人數(shù)約占癌癥總死亡人數(shù)的1/5[1]。在中國(guó)，相比于其它腫瘤發(fā)病率，肺癌發(fā)病率在男性中排名第一，在女性中排名第二，僅次于乳腺癌[2]。惡性胸腔積液(MPE)是癌癥的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，據(jù)估計(jì)，僅僅在美國(guó)每年至少有15萬(wàn)例癌癥患者出現(xiàn)胸腔積液癥狀[3]，引起MPE的最常見(jiàn)原因是肺癌和乳腺癌[4]，且出現(xiàn)MPE的肺癌和乳腺癌患者總數(shù)占所有癌癥患者合并MPE的一半以上[5]。非小細(xì)胞肺癌患者合并MPE的組織類型主要為腺癌[6]。根據(jù)國(guó)際肺癌腫瘤研究協(xié)會(huì)最新的TNM分期系統(tǒng)，肺癌合并胸腔積液歸類為M1a期疾病[7]，預(yù)后差，其中位生存期為3～12個(gè)月[8]，甚至有癌癥中心觀察到中位生存期為5個(gè)月[9]。

胸腔熱灌注是指用物理方法將生理鹽水升溫至高于37 ℃的某個(gè)溫度后，將生理鹽水注入胸腔，使腔內(nèi)保持一定的溫度并持續(xù)一段時(shí)間，最終殺滅胸腔內(nèi)殘余的腫瘤細(xì)胞。雙氯酚酸是一種非甾體抗炎藥(NSAID)，有解熱、鎮(zhèn)痛的療效。同時(shí)也是一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑，能夠影響腫瘤細(xì)胞代謝[10]，近年也有研究報(bào)道其可以用來(lái)治療癌癥[11-12]。本研究以人肺腺癌A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)體外模擬胸腔熱灌注的方法(不同溫度下細(xì)胞培養(yǎng))比較雙氯酚酸和順鉑在不同溫度下對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并觀察雙氯酚酸在43 ℃下能否增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞的熱化療作用。旨在為肺癌合并MPE患者探索潛在的、新的有效治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2主要試劑Ham’s F-12k培養(yǎng)基來(lái)源于武漢普諾賽生命科技有限公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，順鉑由中國(guó)齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，雙氯酚酸購(gòu)自山東京衛(wèi)制藥有限公司。MTS試劑來(lái)自上海普洛麥格生物制品有限公司，凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司公司，兔抗Bax BCL-2一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 向含有人肺腺癌A549細(xì)胞株的培養(yǎng)瓶中加入10%胎牛血清的Ham’s F-12K培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTS法測(cè)實(shí)驗(yàn)濃度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，混勻進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，往96孔板A板和B板每孔加入100 μL 5×104/mL濃度的單細(xì)胞懸液，向96孔板C板和D板每孔加入100 μL 8×104/mL濃度單細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后,棄去舊培養(yǎng)基，A板和B板分別加入200 μL含有不同順鉑濃度(0、1、2、4、8和16 μg/mL)的培養(yǎng)基,C板和D板分別加入200 μL含有不同雙氯酚酸濃度(0、0.025、0.05、0.1、 0.2和0.4 μmol/L)的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)一組只添加培養(yǎng)液而沒(méi)有細(xì)胞的孔為空白對(duì)照組，用于調(diào)零。A板和C板先放入43 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，再放回37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)23 h；B板和D板直接放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;向ABCD板中每實(shí)驗(yàn)孔加入20 μL 5 mg/mL MTS試劑，再放回37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2～4 h,用多功能酶標(biāo)儀讀取出各板在波長(zhǎng)490 nm時(shí)的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑率，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次，應(yīng)用Probit 回歸分析得出兩藥物的IC50(半數(shù)致死率)并確定兩藥物的實(shí)驗(yàn)濃度。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及處理 空白對(duì)照組：加2 mL不加任何藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)；順鉑組：加入2 mL含有順鉑實(shí)驗(yàn)濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)；雙氯酚酸+順鉑組：加入2 mL含有雙氯酚酸和順鉑實(shí)驗(yàn)濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)；三組細(xì)胞先放入43 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，再放回37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23 h。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 按上述實(shí)驗(yàn)分組及處理后，收集舊培育基和胰酶消化的細(xì)胞懸液，5×103rpm離心5 min，用PBS緩沖液洗滌2次，500 μL 1 X Binding Buffer重懸，每組細(xì)胞分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,輕柔混勻，室溫避光孵育5 min后進(jìn)行流式分析，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算各組細(xì)胞總凋亡率，取3次細(xì)胞總凋亡率平均值。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)RNA的表達(dá) 按上述實(shí)驗(yàn)分組及處理后，先將所需實(shí)驗(yàn)物品進(jìn)行去 Rnase 處理，按Trizol法提取出總RNA后，應(yīng)用超微量分光光度計(jì)儀器測(cè)出各組RNA濃度；冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件，得到cDNA,然后在冰上按試劑說(shuō)明書(shū)配置RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)程序后進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增曲線和溶解曲線，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次，分析數(shù)據(jù)，作圖。

1.2.6蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 按上述實(shí)驗(yàn)分組及處理后，分別加入適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min,收取裂解液，超聲，離心，吸取上清液蛋白；應(yīng)用BCA法測(cè)出各組蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，加熱變性，計(jì)算各組上樣體積，配12%下層膠和5%的濃縮膠，組裝電泳裝置進(jìn)行上樣、電泳；用甲醇預(yù)先活化PVDF膜，組裝轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將含目的蛋白條帶的PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2 h,剪膜，放入一抗(稀釋比例1∶1 000)孵育過(guò)夜；用TBST液洗膜3次，放入二抗(稀釋比例1∶8 000)室溫孵育2 h,TBST液洗膜3次，配置發(fā)光液，應(yīng)用全自動(dòng)發(fā)光圖像分析儀進(jìn)行發(fā)光，通過(guò)圖像處理軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 雙氯酚酸和順鉑實(shí)驗(yàn)濃度的測(cè)定

不同濃度的雙氯酚酸和順鉑對(duì)A549細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制效應(yīng)越強(qiáng)。在同一濃度下，順鉑43 ℃熱療時(shí)對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用均大于37 ℃熱療。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而雙氯酚酸43 ℃熱療時(shí)的抑制作用與37 ℃熱療時(shí)無(wú)明顯差異(圖1)；應(yīng)用Probit回歸分析得出結(jié)果：雙氯酚酸在37 ℃與43 ℃時(shí)得IC50分別是0.138 μmol/L、0.144 μmol/L；順鉑在37 ℃與43 ℃時(shí)的IC50分別是4.702 μg/mL、3.234 μg/mL。因此本研究分別選取接近IC50的藥物濃度(雙氯酚酸：0.15 μmol/L順鉑：4 μg/mL)來(lái)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

90807060504030201009080706050403020100增殖抑制率(%)AB37℃45℃37℃45℃0.00.10.20.30.40.5024681012141618藥物濃度(μmol/L)藥物濃度(μg/mL)增殖抑制率(%)

2.2 雙氯酚酸能增強(qiáng)熱化療對(duì)A549細(xì)胞的凋亡作用

流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，對(duì)照組、順鉑組和雙氯酚酸+順鉑組的平均細(xì)胞總凋亡率分別為(12.53±0.51)%、(24.82±3.93)%、(56.07±1.97)%(圖2)。順鉑組的平均細(xì)胞總凋亡率和雙氯酚酸+順鉑組平均細(xì)胞總凋亡率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3)，結(jié)果說(shuō)明雙氯酚酸可增強(qiáng)順鉑熱化療對(duì)A549細(xì)胞的凋亡。

對(duì)照組順鉑組雙氯酚酸+順鉑組

*806040200細(xì)胞總凋亡率(%)對(duì)照組順鉑組雙氯酚酸+順鉑組

2.3 雙氯酚酸能影響順鉑對(duì)凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2 mRNA的表達(dá)

以對(duì)照組2-ΔΔCt值為參照(設(shè)定為1)，順鉑組和雙氯酚酸+順鉑組Bax mRNA平均相對(duì)表達(dá)量分別為2.58±0.22、1.61±0.09；Bcl-2 mRNA平均相對(duì)表達(dá)量分別為0.28±0.04、0.04±0.02。與對(duì)照組相比，順鉑組和雙氯酚酸+順鉑組的促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)量均上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)量均下調(diào)；與順鉑組相比，雙氯酚酸+順鉑組Bax mRNA表達(dá)量、Bcl-2 mRNA表達(dá)量低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4A);圖3B為各組Bcl-2/Bax比值大小情況，與順鉑組相比，雙氯酚酸+順鉑組bcl-2/Bax比值明顯降低，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。證明雙氯酚酸總體促進(jìn)了順鉑熱化療對(duì)A549細(xì)胞的凋亡作用。

***3210210.20.10.0BaxBcl-2對(duì)照組順鉑組雙氯酚酸+順鉑組對(duì)照組順鉑組雙氯酚酸+順鉑組

2.4 雙氯酚酸能影響順鉑對(duì)凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2 蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比，順鉑組和雙氯酚酸+順鉑組促凋亡基因Bax 蛋白表達(dá)均上調(diào)，且雙氯酚酸+順鉑組上調(diào)更明顯；抗凋亡基因Bcl-2 蛋白均下調(diào)，且雙氯酚酸+順鉑組下調(diào)更明顯(圖5)。

BaxBcl-2β-actinβ-actin對(duì)照組順鉑組雙氯酚酸+順鉑組

3 討 論

惡性胸腔積液是非小細(xì)胞肺癌的常見(jiàn)并發(fā)癥之一。在非小細(xì)胞肺癌患者中，肺癌合并胸腔積液患者約占15%[13]。胸腔積液是肺癌的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，當(dāng)肺癌患者出現(xiàn)惡性胸腔積液癥狀時(shí)，往往意味著晚期肺癌，預(yù)后差,主要是用化療、胸水穿刺引流、胸膜固定術(shù)等進(jìn)行姑息治療[14]。胸腔熱化療是臨床上可供患者選擇的一種安全、有效的治療方法，有研究報(bào)道，56例肺癌合并胸腔積液患者經(jīng)VATS(電視胸腔鏡)下胸腔熱化療后胸腔積液得到完全緩解，且中位生存期延長(zhǎng)至21.7個(gè)月[15]。雙氯酚酸在臨床上常常作為非甾體抗炎藥來(lái)發(fā)揮解熱、陣痛的效應(yīng)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)雙氯酚酸具有潛在的抗腫瘤效應(yīng)[11-12]。本研究用體外模擬胸腔熱化療聯(lián)合或不聯(lián)合雙氯酚酸的方法，觀察雙氯酚酸能否促進(jìn)順鉑在43 ℃下對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響。

本研究MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙氯酚酸和順鉑對(duì)A549細(xì)胞均有增殖抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制率越大。Smirnova等[16]的研究也證實(shí)了雙氯酚酸對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴形式；而關(guān)于雙氯酚酸與溫度在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面是否具有協(xié)同作用，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，在同一藥物濃度下，雙氯酚酸43 ℃條件下對(duì)A549細(xì)胞的抑制率相較于37 ℃條件下抑制率無(wú)明顯差異(P>0.05)，表明溫度與雙氯酚酸對(duì)A549細(xì)胞的抑制無(wú)協(xié)同作用；而順鉑在43 ℃條件下的抑制率比37 ℃熱療抑制率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明43 ℃溫度下能增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用。Sukovas等[17]的研究也說(shuō)明溫度可以增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性作用。為提高順鉑等傳統(tǒng)金屬藥物的抗腫瘤效應(yīng)，Intini等[18]研究了雙氯酚酸-鉑結(jié)合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雙氯芬酸-鉑結(jié)合物對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的抑制作用比順鉑更強(qiáng)的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)雙氯酚酸可以減少人卵巢癌細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，并通過(guò)改變線粒體膜電位、抑制侵襲和遷移等和順鉑發(fā)揮雙重抗腫瘤增殖的作用。Johnsen等[19]的研究結(jié)果也表明雙氯酚酸能改變神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的線粒體膜電位，激活procaspase-9和procas-pase-3，最終誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與順鉑組細(xì)胞總凋亡率相比，雙氯酚酸聯(lián)合順鉑組細(xì)胞總凋亡率明顯高于順鉑組，提示雙氯酚酸能促進(jìn)順鉑熱化療對(duì)A549細(xì)胞的凋亡作用。并且這種促進(jìn)作用可能是通過(guò)線粒體相關(guān)途徑實(shí)現(xiàn)的。Bcl-2與Bax分別是常見(jiàn)的抗凋亡和促凋亡基因，Bcl-2低表達(dá)或Bax高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。Bcl-2/Bax比值大小對(duì)細(xì)胞凋亡起決定性作用[21]。Bcl-2/Bax比值高提示細(xì)胞處于抗凋亡狀態(tài)，Bcl-2/Bax比值低說(shuō)明細(xì)胞處于促凋亡狀態(tài)。本研究RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，順鉑組與雙氯酚酸+順鉑組的Bax mRNA表達(dá)均上調(diào)，且順鉑組上調(diào)更明顯，順鉑組與雙氯酚酸+順鉑組Bcl-2mRNA表達(dá)均下調(diào)，且雙氯酚酸+順鉑組下調(diào)更明顯。雙氯酚酸+順鉑組的Bax mRNA表達(dá)量比順鉑組低考慮與雙氯酚酸的負(fù)性作用有關(guān)，但就Bcl-2/Bax比值來(lái)說(shuō)，順鉑+雙氯酚酸組Bcl-2/Bax比值較順鉑組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與順鉑組相比，雙氯酚酸+順鉑組的促凋亡Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。與預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。證明雙氯酚酸能促進(jìn)順鉑熱化療對(duì)A549細(xì)胞的凋亡。值得注意的是，雙氯酚酸+順鉑組Bax mRNA表達(dá)低于順鉑組，但Bax蛋白表達(dá)水平高于順鉑組，可能是樣本量不足，下一步需提高樣本量來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，體外雙氯芬酸和順鉑均能抑制A549細(xì)胞增殖，熱療聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞的抑制有協(xié)同作用，而與雙氯酚酸則無(wú)。雙氯酚酸聯(lián)合熱化療對(duì)A549細(xì)胞的促凋亡效應(yīng)優(yōu)于單純熱化療。