朱思榮，畢春元，杜祎，張金玲，高廣恒，張利群，趙曉華，楊艷

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院生物研究所 山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250103)

電流型酶電極生物傳感器是把具有生物活性的酶與電化學(xué)電極結(jié)合在一起的復(fù)合型傳感器，通常由過氧化氫電極和產(chǎn)過氧化氫的氧化酶組成，酶反應(yīng)產(chǎn)物過氧化氫在電極表面還原為水和氧氣，釋放電子，產(chǎn)生電極流。傳感器關(guān)鍵元件為具有催化活性的酶，通常是把酶固定化在載體膜上，再把膜緊貼在電化學(xué)電極上，也可把酶直接固定在電化學(xué)電極上。由于酶催化反應(yīng)只對其特定底物起作用，所以酶電極生物傳感器具有專一性好、反應(yīng)速度快，靈敏度高的優(yōu)點，不需要對待測樣品進行特殊處理，就能快速檢測樣品內(nèi)的特定成份。目前酶電極生物傳感器已廣泛應(yīng)用于臨床生化檢驗、食品分析、發(fā)酵檢測等領(lǐng)域。

酶電極生物傳感器由固定化酶和電化學(xué)電極組成，所以任何影響酶催化反應(yīng)和電化學(xué)電極電流大小的外部因素都會對測定分析形成干擾，影響儀器的分析測定精度。目前研究較多的是對電化學(xué)電極的干擾，因為一些具有氧化還原活性的小分子會在電極表面反應(yīng)，產(chǎn)生電極電流，影響測定的準確性。Shitanda等[1]根據(jù)酶電極對干擾物和測定物具有不同響應(yīng)速度的特點，利用小波變換算法排除抗壞血酸對電流型酶電極生物傳感器的干擾。Serkan等[2]在葡萄糖流動注射分析系統(tǒng)中用樣品流過裝填不溶性NaBiO3的流動腔，使樣品基底中的氧化還原活性物質(zhì)如抗壞血酸、多巴胺、尿酸在到達測定電極之前轉(zhuǎn)化為無活性的氧化態(tài)，使樣品中的抗壞血酸干擾降低96%，多巴胺干擾降低86%，尿酸干擾降低98%。何原子等[3]以納米Au修飾煤基活性炭為電極固載葡萄糖氧化酶，該系統(tǒng)對0.05 mol/L的尿酸和抗壞血酸干擾因素未引起顯著電流反應(yīng)。由于酶活抑制劑的存在會顯著抑制酶的催化活性，酶傳感器也通常用于酶抑制劑的檢測，如用乙酰膽堿酯酶傳感器檢測可逆抑制劑石杉堿甲和加蘭他明[4]、毒扁豆堿[5]、黃曲霉毒素B1[6]和有機磷農(nóng)藥[7-9]，用酪氨酸酶傳感器檢測黃曲霉毒素M1[10]，用葡萄糖氧化酶測定生物毒性痕量金屬離子[11-12]，用酪氨酸酶和葡萄糖氧化酶雙酶檢測雙酚A(BPA)、苯酚、Cr(III)、葡萄糖和Cr(VI)[13]。但對于抗酶活抑制劑干擾的處理方法目前尚未見報道。

1 電流型酶電極生物傳感器測定原理

酶是一種特殊的具有生物活性的蛋白質(zhì)，其生物活性隨保存時間的增長或測定樣品次數(shù)的增加會逐步降低，但這是一個很緩慢的過程，短時間(數(shù)分鐘到數(shù)十分鐘)內(nèi)其活性變化很小，可以忽略不計。酶電極生物傳感器的應(yīng)用正是基于酶的這一特點。通常在用酶電極檢測前，先用標樣連續(xù)檢測酶電極的響應(yīng)電流，直到酶電極的響應(yīng)電流基本恒定(誤差小于分析測定要求)，然后再檢測被測樣品，根據(jù)酶電極對被測樣品的響應(yīng)電流，與標樣比較，計算出被測樣品的濃度。在電化學(xué)電極表面酶反應(yīng)產(chǎn)物是一個生成與擴散的平衡狀態(tài)[14]，實際濃度與產(chǎn)物生成速度(即酶反應(yīng)速度)成正比。根據(jù)酶促反應(yīng)的米氏定律，酶催化反應(yīng)的反應(yīng)速度V與反應(yīng)底物濃度S的關(guān)系為：

(1)

因為反應(yīng)速度V與傳感器電極電流成正比關(guān)系，可以導(dǎo)出酶電極響應(yīng)電流與底物濃度的關(guān)系為：

(2)

其中:C為電極響應(yīng)電流;a為常數(shù),與Vmax成一定的比例關(guān)系;b=Km即米氏常數(shù);S為底物濃度。

酶電極的線性校正就是通過定標時的標樣濃度及響應(yīng)電流、線性校正時的標樣濃度及響應(yīng)電流這兩組數(shù)據(jù)，按式(2)求出常數(shù)a和b，測定時再通過樣品響應(yīng)電流及常數(shù)a和b，計算出測定樣品的濃度。

2 抗抑制劑干擾實現(xiàn)

在測定底物中存在酶活性抑制劑的情況下，由于標樣定標時不存在酶活抑制劑，酶活較高，而在樣品測定中因酶活抑制劑的存在，酶活性較低，這樣定標過程和測定過程酶活基本不變這一測定的基本條件不再存在，所以用常規(guī)法測定無法得到準確的分析結(jié)果。只有使酶傳感器的定標過程和測定過程處于同一酶反應(yīng)的環(huán)境中，才能保證傳感器的酶活基本不變。本文提供的抗干擾測定方法就是用標樣在樣品測定環(huán)境中對酶活進行二次標定，消除酶活抑制劑對測定過程的影響。具體測定過程如下：

測定時先按常規(guī)方法對酶電極進行定標。如有必要在定標完成后對酶電極進行校線性操作，確保在標樣濃度范圍內(nèi)，酶電極的測定結(jié)果與樣品濃度一致。定標完成后進行測定操作，測定分兩步進行，第一步僅取樣品測定，為防止在第二步測定中樣品濃度超限，測定時樣品的進樣量改為常規(guī)法的一半，反應(yīng)結(jié)束后獲得測定結(jié)果R1，第二步用與第一步等量的樣品加上與樣品等量的標樣進行測定，獲得測定結(jié)果R2。

如樣品中有酶活抑制劑存在，則測定結(jié)果會明顯偏低?？紤]到進樣量僅為正常定標時的一半，測定結(jié)果R1與實際樣品濃度X的關(guān)系為：

(3)

其中K為為酶活抑制系數(shù)。

第二步測定因為所加的樣品量與第一步相同，所以反應(yīng)系統(tǒng)中酶活抑制劑含量與第一步測定相同，酶活抑制系數(shù)可視為不變。測定結(jié)果R2與實際樣品濃度X的關(guān)系為：

(4)

其中St為標樣濃度，根據(jù)式(3)和(4)可以算出：

(5)

(6)

兩次測定結(jié)束后，根據(jù)兩次測定結(jié)果R1和R2，按式(5)計算出抑制系數(shù)K，再按式(6)計算出實際樣品濃度X。因抗干擾測定方法中每個待測物的抑制系數(shù)不同，所以在正常定標和校線性后，每個樣品至少要測定兩次才能獲得分析結(jié)果，雖然測定速度慢一些，但在樣品中有酶活抑制劑干擾的情況下，這種測定方法去除了抑制劑的影響，測定結(jié)果更準確、更可靠。

3 酶抑制劑對測定的影響及抗抑制劑干擾法測定實驗

3.1 實驗試劑與儀器

3.2 用常規(guī)分析方法測定含(NH4)2SO4的標準樣品

圖1 (NH4)2SO4濃度對葡萄糖、谷氨酸生物傳感器分析結(jié)果的影響Fig.1 Influence of (NH4)2SO4 concentration on the analysis result of glucose and glutamic acid biosensors

表1 含(NH4)2SO4樣品對葡萄糖、谷氨酸生物傳感器的影響(10次測定結(jié)果)

3.3 用抗抑制劑干擾法分析含離子樣品

測定前先按常規(guī)法用標準樣品進行酶活定標，然后用1/2濃度標樣對傳感器校線性，確保在標樣濃度范圍內(nèi)傳感器對樣品測量有很好的線性關(guān)系。定標和校線性按常規(guī)分析法進行。進樣量為20 μL。

完成正常定標和校線性后用抗干擾法測定干擾樣品，為使測定結(jié)果不超線性范圍，樣品量改為10 μL，測定分兩次進行，第一次向反應(yīng)池注入10 μL待測樣品，待反應(yīng)結(jié)束后獲得一組測定結(jié)果，因為進樣量是常規(guī)法的一半，所以該結(jié)果乘2即為按常規(guī)測定的結(jié)果，第二次向反應(yīng)池注入10 μL待測樣品加10 μL標樣。待反應(yīng)完成，再次獲得一組測定數(shù)據(jù)。根據(jù)兩次測定結(jié)果按式(5)、(6)計算出抗干擾校正結(jié)果。第二次測定時樣品和標樣的總進樣量為20 μL，只要待測樣品濃度不超標樣太多，測定就不會超出傳感器線性范圍。

圖5 不同濃度抑制劑下葡萄糖、谷氨酸重復(fù)測定變異系數(shù)比較Fig.5 Comparison of the coefficient of variation of glucose and glutamic acid for repeated determination under different concentrations of inhibitors

表2 抗抑制劑干擾法測定(NH4)2SO4濃度為10 mmol/L標準樣的重復(fù)測定結(jié)果

從圖2～4抗干擾校正后的結(jié)果可見，雖然用本方法重復(fù)測定的變異系數(shù)相對大，但抗酶活抑制劑的干擾效果明顯，分析結(jié)果更接近實際濃度。在檢測存在酶活抑制劑的樣品時可有效提高分析精度，降低分析誤差。由于本方法在第二次測定中使用標樣計算抑制系數(shù)，也有同定標相似的效果，測定過程酶活少許改變不會影響分析結(jié)果，測定過程可以適當(dāng)延長定標的時間間隔。

表3 抗抑制劑干擾法測定(NH4)2SO4濃度為5 mmol/L標準樣的重復(fù)測定結(jié)果

表4 抗抑制劑干擾法測定(NH4)2SO4濃度為2 mmol/L標準樣的重復(fù)測定結(jié)果

圖2 10次重復(fù)測定(NH4)2SO4濃度為10 mmol/L標準樣的結(jié)果比較Fig.2 Comparison of 10 repeated determinations of a standard sample with 10 mmol/L (NH4)2SO4

圖3 10次重復(fù)測定(NH4)2SO4濃度為5 mmol/L標準樣的結(jié)果比較Fig.3 Comparison of 10 repeated determinations of a standard sample with 5 mmol/L (NH4)2SO4

圖4 10次重復(fù)測定(NH4)2SO4濃度為2 mmol/L的標準樣的結(jié)果比較Fig.4 Comparison of 10 repeated determinations of a standard sample with 2 mmol/L (NH4)2SO4

4 結(jié)語

酶電極生物傳器以其測定速度快、專一性好、成本低等優(yōu)勢在醫(yī)療、發(fā)酵、食品、體育訓(xùn)練等多個領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。對于測定對象成份相對穩(wěn)定的試樣，如人體血液樣品，干擾是可預(yù)期的,并多為電極干擾,可以采取針對性的防干擾措施，獲得高精度測定結(jié)果。但在工業(yè)領(lǐng)域中，測定對象極其復(fù)雜，如發(fā)酵液樣品，在發(fā)酵后期菌體量極大，各種代謝產(chǎn)物復(fù)雜，其中極有可能有未知的酶活抑制劑，常規(guī)檢測方法獲得的測定結(jié)果偏差較大，限制了酶電極在這些領(lǐng)域中的應(yīng)用。本文設(shè)計的測定方法可有效消除酶抑制劑對測定結(jié)果的影響，降低酶電極生物傳感器在工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用中的測定誤差，有較好的應(yīng)用前景。