黃文，馬石庭，姚軍

1 賀州市人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，廣西賀州542800；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種好發(fā)于膝關(guān)節(jié)，以關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙為主要特點(diǎn)的退行性關(guān)節(jié)炎，可致關(guān)節(jié)嚴(yán)重畸形［1］。研究顯示，全球OA 患者已經(jīng)超過3.6 億，其中80% 的患者存在運(yùn)動(dòng)局限性，25% 存在肢體殘疾［2］。OA 的主要病理基礎(chǔ)是軟骨細(xì)胞損傷、凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成分泌減少［3-4］。目前研究認(rèn)為，炎癥因子蓄積在OA 的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，是導(dǎo)致軟骨細(xì)胞病變的主要原因［5］。黃連素是從毛茛科植物黃連根莖中提取出的一種生物堿，臨床顯示具有清熱解毒的作用［6］。近些年研究顯示，黃連素具有較強(qiáng)的抗炎作用［7-8］。但黃連素對(duì)OA 是否有治療作用，目前尚缺乏相關(guān)研究。2019年12 月—2020 年12 月，本研究觀察了黃連素對(duì)白細(xì)胞介素1β（IL-1β）誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性退變的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：1 周齡C57 小鼠8 只，雌雄不限，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑：細(xì)胞染色相關(guān)試劑（DMSO、MTT、FDA 染料）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑（黃連素、DMEM 高糖培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶、胎牛血清、膠原酶Ⅱ、青—鏈霉素混合液、PBS 溶液）均購(gòu)自北京Solarbio 公司，RT-PCR 相關(guān)試劑（細(xì)胞RNA快速提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒）均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司，Western blotting 相關(guān)試劑（細(xì)胞總蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、一抗、二抗）均購(gòu)自北京中杉金橋科技有限公司。主要儀器：超凈細(xì)胞操作臺(tái)購(gòu)自蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司，CO2培養(yǎng)箱、MultiSkan 酶標(biāo)儀、ABI 7500 型定量PCR 儀均購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司，熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司。

1.2 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨原代細(xì)胞提取、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 軟骨原代細(xì)胞提取、培養(yǎng) 將8 只C57 小鼠處死后置入75%乙醇內(nèi)浸洗5 min，在超凈操作臺(tái)內(nèi)解剖取出小鼠膝關(guān)節(jié)處軟骨組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊。 將組織塊放入含0.25% 胰蛋白酶的無菌離心管中，37 ℃條件下消化1 h；800 r/min 離心2 min 后去上清液，加入2 mg/μLⅡ型膠原酶，繼續(xù)消化2 h。反復(fù)吹打后收集消化液，800 r/min 離心2 min 后去上清液，用PBS 溶液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于含DMEM 培養(yǎng)基（內(nèi)含10%FBS、1% 青—鏈霉素）的培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)基，之后每3 d換液1次。細(xì)胞融合至80% 時(shí)以1∶2 比例傳代，取第3 代細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 軟骨細(xì)胞鑒定 將生長(zhǎng)狀況良好的第3 代軟骨細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片培養(yǎng)，2 d 后取出爬片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞基本形態(tài)，結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)多樣，呈類圓形、多角形、星形等。將爬片置入4% 多聚甲醛中，4 ℃條件下固定30 min，取出爬片，反復(fù)用PBS 清洗，每次3～5 min；清洗完畢后將爬片置入甲苯胺藍(lán)染色液中，充分覆蓋樣品，室溫避光孵育30 min；顯色至預(yù)期深淺后去除染色液，用蒸餾水洗滌1～2 次，光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果可見細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)豐富、細(xì)胞核清晰，多核。見OSID 碼圖1。

1.3 黃連素作用濃度篩選 采用MTT 法。選取生長(zhǎng)狀況良好的第3 代軟骨細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液，以5×103/孔接種于96 孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)1 d 后，更換含不同濃度黃連素（0～102.4 g/L）+IL-1β（10 ng/mL）的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)1 d 后，將終濃度為5 mg/mL 的MTT 加入96 孔板內(nèi)，37 ℃孵育箱中孵育4 h 后終止培養(yǎng)。小心吸除孔內(nèi)培養(yǎng)基，向孔中加入150 μL 二甲基亞砜，震蕩10 min 后使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在490 nm 處的吸光度值，以吸光度值表示軟骨細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，＞0～0.8 g/L 的黃連素對(duì)炎性退變的軟骨細(xì)胞具有低細(xì)胞毒性，6.25×10－3～0.05 g/L 的黃連素可濃度依賴性提高炎性退變的軟骨細(xì)胞活性（P均＜0.05），1.6～102.4 g/L 的黃連素對(duì)炎性退變的軟骨細(xì)胞活性有抑制作用（P均＜0.05）。選擇濃度為6.25×10－3g/L、0.05 g/L 黃連素分別作為低、高劑量進(jìn)行下一步研究。見圖1。

圖1 炎性退變的軟骨細(xì)胞經(jīng)不同濃度黃連素作用后的細(xì)胞活性（MTT法）

1.4 細(xì)胞分組處理 將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為空白組（不采取任何干預(yù)）、模型組（僅加入10 ng/mL IL-1β干預(yù)）、黃連素低劑量組（10 ng/mL IL-1β +6.25×10-3g/L黃連素干預(yù)）、黃連素高劑量組（10 ng/mL IL-1β+0.05 g/L黃連素干預(yù)），分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

1.5 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用FDA 熒光染色。各組培養(yǎng)2 d后取出細(xì)胞爬片，用PBS將爬片輕柔清洗干凈，置入FDA（100 mg/L）染色液中，暗盒內(nèi)染色5 min，在倒置熒光顯微鏡下攝片分析活細(xì)胞數(shù)。綠色斑點(diǎn)為活細(xì)胞，相同接種底數(shù)，綠色斑點(diǎn)越多表示活細(xì)胞數(shù)越多，即增殖活性越強(qiáng)。

1.6 軟骨細(xì)胞分泌功能檢測(cè) 采用番紅O 染色。各組培養(yǎng)2 d后取出細(xì)胞爬片，用PBS將爬片輕柔清洗干凈，置入40 g/L多聚甲醛中固定30 min，固定結(jié)束再次清洗爬片，去除甲醛。按照番紅O 染色操作手冊(cè)，將軟骨細(xì)胞染色至預(yù)期深淺后，在倒置光學(xué)顯微鏡下攝片分析番紅O 染色面積。番紅O 可將軟骨細(xì)胞分泌的外基質(zhì)染為紅色，顏色越深、染色面積越大表示軟骨細(xì)胞分泌功能越強(qiáng)。

1.7 軟骨細(xì)胞特異性相關(guān)基因［蛋白聚糖（Acan）、Ⅱ型膠原1（Col2a1）］及炎癥相關(guān)基因［基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）、環(huán)氧合酶2（COX-2）］表達(dá)檢測(cè) 采用Real-time PCR 法。各組培養(yǎng)2 d后，按照細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒完成總RNA 提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Acan 引物序列：上游引物5'-GGCAACAACTCACCCAGCACTG-3'、下 游 引 物5'-AGGAGGCACGGGACGTAGTTC-3'，Col2a1 引 物序列：上游引物5'-CCAAGTGGCCAGGTTCAACG-3'、下 游 引 物5'-GGGATGAGGAATGCGCCCTA-3'，MMP-13 引物序列：上游引物5'-CCGGGAGAACAATCCGTGCC-3'、下游引物5'-AAAGCACTCGCCATCCCCAA-3'，COX-2 引 物 序 列：上 游 引 物5'-CAGGTGCAAAGCCCAGCGAC-3'、下 游 引 物5'-TGGGGCTCCAAGTCCATTGTT-3'，內(nèi)參β-actin 引物序列：上游引物5'-CATGAGCCGAAGCTAACCC-3'、下游引物5'-CTCCTATGACTTCTGCGTCTGG-3'。PCR 反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min，40 個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計(jì)算軟骨細(xì)胞目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）/Smad2/3 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。各組培養(yǎng)2 d 后，按照細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。參照試劑盒說明書進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入TGF-β1、Smad2、Smad3、β-actin 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；加入二抗（稀釋比例均為1∶5 000），室溫孵育1 h。曝光、顯影后采用Image Lab 圖像處理軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行分析，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算各組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組軟骨細(xì)胞增殖活性比較 模型組、空白組、黃連素低劑量組、黃連素高劑量組活細(xì)胞數(shù)分別為（212.50 ± 17.68）、（375.00 ± 35.35）、（530.00 ±42.43）、（650.00 ± 70.71）個(gè)，組間兩兩比較P均＜0.05。見OSID碼圖2。

2.2 各組軟骨細(xì)胞分泌功能比較 模型組、空白組、黃連素低劑量組、黃連素高劑量組染色面積分別為24.50% ± 4.95%、44.50% ± 6.36%、65.00% ±7.07%、77.5% ± 3.53%，組間兩兩比較P均＜0.05。見OSID碼圖3。

2.3 各組軟骨細(xì)胞Acan、Col2a1、MMP-13 及COX-2 mRNA 表達(dá)比較 模型組、空白組、黃連素低劑量組、黃連素高劑量組軟骨細(xì)胞Acan、Col2a1 mRNA表達(dá)依次升高，MMP-13、COX-2 mRNA 表達(dá)依次降低，組間兩兩比較P均＜0.05。見表1。

表1 各組軟骨細(xì)胞Acan、Col2a1、MMP-13及COX-2 mRNA表達(dá)比較（± s）

表1 各組軟骨細(xì)胞Acan、Col2a1、MMP-13及COX-2 mRNA表達(dá)比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與黃連素低劑量組比較，△P＜0.05。

組別空白組模型組黃連素低劑量組黃連素高劑量組Acan 1.00 ± 0.14 0.58 ± 0.08*1.28 ± 0.11*#1.57 ± 0.10*#△Col2a1 1.00 ± 0.07 0.49 ± 0.13*1.36 ± 0.08*#1.61 ± 0.08*#△MMP-13 1.00 ± 0.11 1.75 ± 0.07*1.08 ± 0.04*#0.67 ± 0.09*#△COX-2 1.00 ± 0.15 1.80 ± 0.11*0.88 ± 0.09*#0.57 ± 0.06*#△

2.4 各組軟骨細(xì)胞TGF-β/Smad2/3 信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 模型組、空白組、黃連素低劑量組、黃連素高劑量組軟骨細(xì)胞TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白相對(duì)表達(dá)量均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表2、OSID碼圖4。

表2 各組軟骨細(xì)胞TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)比較（± s）

表2 各組軟骨細(xì)胞TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與黃連素低劑量組比較，△P＜0.05。

組別空白組模型組黃連素低劑量組黃連素高劑量組TGF-β1 0.55 ± 0.07 0.25 ± 0.04*0.78 ± 0.05*#1.04 ± 0.12*#△Smad2 0.43 ± 0.11 0.20 ± 0.07*0.65 ± 0.08*#0.77 ± 0.04*#△Smad3 0.38 ± 0.09 0.17 ± 0.57*0.48 ± 0.85*#0.62 ± 0.09*#△

3 討論

在OA 的發(fā)展過程中有各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并參與干擾軟骨細(xì)胞分解代謝和合成代謝過程。關(guān)節(jié)內(nèi)部不僅有炎癥因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13、IL-17、COX-2）誘導(dǎo)的分解代謝過程，同時(shí)還存在抗炎因子（IL-4、IL-10、IL-13）誘導(dǎo)的合成代謝過程［9］。盡管炎癥和抗炎因子在OA 發(fā)病過程中的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路尚不明確，但既往研究已證實(shí)早期OA已經(jīng)具有不同程度的炎癥反應(yīng)［10］。

研究表明，具有抗炎作用的中藥提取物可以減輕細(xì)胞炎癥，改善軟骨細(xì)胞功能，促進(jìn)軟骨合成及修復(fù)。臺(tái)灣學(xué)者發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠具有強(qiáng)效抗炎作用，可以明顯改善小鼠OA 病情［11］；李淑潔等［12］研究發(fā)現(xiàn)，牛膝提取物可能通過PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞凋亡，從而減輕碘乙酸鈉對(duì)軟骨細(xì)胞的損傷。此外，淫羊藿素、枸杞多糖、牛膝總皂苷也有相似作用［13-15］。 本研究結(jié)果顯示，黃連素在6.25×10-3～0.05 g/L 時(shí)可呈濃度依賴性提高炎性退變軟骨細(xì)胞的活性，并促進(jìn)細(xì)胞增殖；此外，黃連素可逆轉(zhuǎn)IL-1β 引起的軟骨細(xì)胞炎癥因子MMP-13、COX-2 mRNA 高表達(dá)，促進(jìn)軟骨合成因子Acan、Col2a1 表達(dá)，番紅O 染色進(jìn)一步表明黃連素可促進(jìn)發(fā)生炎性退變的軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)；這表明黃連素對(duì)軟骨細(xì)胞及軟骨修復(fù)均具有積極作用。

TGF-β1是TGF-β 超家族成員，Smad1、Smad2 是Smad 蛋白家族的重要成員，TGF-β/Smad2/3 信號(hào)通路參與調(diào)控許多細(xì)胞（如軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等）的增殖、分化［16-17］。Smad 蛋白可以將TGF-β 信號(hào)由細(xì)胞外傳導(dǎo)至細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄水平，干預(yù)細(xì)胞功能狀態(tài)。既往已有許多研究表明，TGF-β/Smad2/3 激活可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、合成Ⅱ型膠原蛋白和聚集相關(guān)的蛋白多糖，在軟骨合成及修復(fù)中具有重要作用；其機(jī)制主要是TGFβ/Smad2/3 信號(hào)通路激活可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Sox9，從而增加Ⅱ型膠原分泌，減少蛋白多糖消耗，最終促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成，起到修復(fù)軟骨的作用［18-20］。本研究結(jié)果顯示，炎性退變的軟骨細(xì)胞TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)量均有不同程度的下調(diào)，這可能是因?yàn)榧?xì)胞在炎性因子干擾下的自我修復(fù)功能受損所致；而黃連素可以促進(jìn)發(fā)生炎性退變的軟骨細(xì)胞合成TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白，從而正向調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖。

綜上所述，黃連素可促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)炎性退變軟骨細(xì)胞的增殖及活性，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)及激活TGF-β/Smad2/3信號(hào)通路有關(guān)。黃連素可促進(jìn)軟骨修復(fù)，減輕OA病變，是治療OA的潛在藥物。