李 飛，劉士力，卞玉玲，鄭建波，程 順，賈永義，遲美麗，顧志敏

池塘和稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道微生物對(duì)比分析

李 飛，劉士力，卞玉玲，鄭建波，程 順，賈永義，遲美麗，顧志敏*

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州 313001)

為探究池塘和稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道微生物組成的差異，采用16S rRNA高通量測(cè)序方法分析了對(duì)兩種養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道的微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，所有樣品共檢出2 007個(gè)種水平上的分類(lèi)操作單元（operational taxonomic units, OTU），歸屬于37個(gè)門(mén)，其中池塘養(yǎng)殖克氏原螯蝦的腸道微生物有1 260個(gè)OTU，稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦的腸道微生物有1 840個(gè)OTU，兩種模式下克氏原螯蝦的腸道微生物共同的OTU有1 093個(gè)；兩種模式下的腸道微生物優(yōu)勢(shì)菌均為厚壁菌門(mén)，其中池塘模式中占比67.40%，稻田模式中占比為32.69%；對(duì)兩種模式的克氏原螯蝦腸道微生物進(jìn)行Alpha多樣性分析顯示，池塘養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道微生物多樣性的Shannon、ACE和Chao指數(shù)均低于稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道微生物的指數(shù)，差異均達(dá)到極顯著的水平；物種差異分析顯示，在門(mén)水平上有21個(gè)門(mén)差異達(dá)到顯著水平，其中有12個(gè)門(mén)差異達(dá)到極顯著水平；在OTU水平上，有364個(gè)OTU差異達(dá)到顯著水平，其中有106個(gè)OTU差異達(dá)到極顯著水平。研究表明，池塘和稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道微生物在物種組成上、多樣性上都存在明顯差異，針對(duì)兩種模式的養(yǎng)殖管理應(yīng)有所區(qū)分，由于池塘模式下腸道微生物多樣性較低，因此，需要更多地注重蝦類(lèi)健康狀況動(dòng)態(tài)，加強(qiáng)管理。

池塘；稻田；克氏原螯蝦；腸道微生物

克氏原螯蝦（），俗稱(chēng)小龍蝦，原產(chǎn)于北美地區(qū)，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，目前已成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖蝦類(lèi)之一[1]，據(jù)《中國(guó)小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告（2020）》，2019年，我國(guó)小龍蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)208.96 萬(wàn)t，養(yǎng)殖總面積達(dá)1 929 萬(wàn)畝，小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)值約710 億元，養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖產(chǎn)量再創(chuàng)新高[2]。然而，在克氏原螯蝦養(yǎng)殖過(guò)程中，由于其免疫系統(tǒng)僅有天然免疫而不具有獲得免疫，使得其抵抗外部環(huán)境和病源等免疫能力較差，病害或大規(guī)模死亡也常有發(fā)生，也成為制約產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。

與其他動(dòng)物相類(lèi)似，水生動(dòng)物的腸道微生物與其健康有著密切關(guān)系，腸道菌群在宿主的代謝、生長(zhǎng)和免疫等方面發(fā)揮著重要作用，是維持動(dòng)物健康的必要因素，而水生動(dòng)物的遺傳背景、飼養(yǎng)環(huán)境和飼料組分均可以顯著影響其腸道微生物的結(jié)構(gòu)組成[3-4]。線(xiàn)粒體16S rRNA序列經(jīng)常被用于系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性研究[5]，由于其中的可變區(qū)一般具有菌種特異性，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展被廣泛運(yùn)用于腸道微生物領(lǐng)域的研究?？耸显r的養(yǎng)殖發(fā)展至今已形成了池塘主養(yǎng)、稻蝦共生（輪作）、蝦蟹混養(yǎng)和藕田養(yǎng)殖等多種養(yǎng)殖模式，對(duì)于不同的養(yǎng)殖模式，其生長(zhǎng)環(huán)境、餌料投喂和養(yǎng)殖管理都會(huì)存在不同之處，需要針對(duì)性地開(kāi)展研究。因此，本研究選擇池塘和稻田養(yǎng)殖兩種較為主流的克氏原螯蝦養(yǎng)殖模式，采用16S rRNA高通測(cè)序方法對(duì)相應(yīng)模式下的克氏原螯蝦腸道微生物組成和多樣性進(jìn)行對(duì)比分析，以期更深入地了解克氏原螯蝦的養(yǎng)殖模式，為下一步進(jìn)行針對(duì)性管理、模式優(yōu)化和病害防治等方面提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)與時(shí)間

池塘養(yǎng)殖與稻田養(yǎng)殖的克氏原螯蝦均采集自安吉縣梅溪草灘家庭農(nóng)場(chǎng)，取樣時(shí)間為2020年8月18日。稻田養(yǎng)殖的克氏原螯蝦用地籠取樣于稻田環(huán)溝，稻田面積約1 hm2，稻田中的水稻于2020年7月4日采用人工插秧的方式進(jìn)行插秧，插秧的株行距為中間25 cm×20 cm，四周30 cm×30 cm，環(huán)溝寬2～3 m，環(huán)溝水深50～60 cm；池塘養(yǎng)殖的克氏原螯蝦用地籠取樣于池塘，池塘面積約500 m2，水深60～70 cm。樣品采集后，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行腸道取樣。腸道取樣時(shí)，用無(wú)菌剪刀和鑷子將克氏原螯蝦腸道內(nèi)容物從前往后擠壓進(jìn)無(wú)菌離心管，每尾蝦的腸道內(nèi)容物作為一個(gè)樣品，其中池塘養(yǎng)殖的樣品有6個(gè)，編號(hào)為test1_1、test1_2、test1_3、test1_4、test1_5和test1_6，稻田養(yǎng)殖的樣品有4個(gè)，編號(hào)為test2_1、test2_2、test2_3和test2_4。所有樣品干冰保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取、16S rRNA基因擴(kuò)增和高通量測(cè)序

DNA提取、16S rRNA基因擴(kuò)增和高通量測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。收到樣品后，按照FastDNA? Spin Kit（MP Biomedicals，美國(guó)）提取試劑盒進(jìn)行DNA抽提，提取后，首先利用NanoDrop2000對(duì)DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)，用1% 瓊脂糖凝膠電泳（電壓5 V/cm，時(shí)間為20 min）對(duì)DNA完整性進(jìn)行檢測(cè)。樣品初步檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增。引物對(duì)應(yīng)區(qū)域?yàn)?6S V3～V4區(qū)，上游引物序列為338F（5'-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3'）和下游引物序列為806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'）。PCR擴(kuò)增采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系：5×FastPfu緩沖液 4 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、5 μmol·L-1上游引物0.8 μL、5 μmol·L-1下游引物0.8 μL、FastPfu 聚合酶0.4 μL、BSA0.2 μL和DNA模板10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增采用的是ABIGeneAmp9700型PCR儀。擴(kuò)增完成后的PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適后，進(jìn)行后續(xù)的構(gòu)建PE文庫(kù)（NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit）和Illumina測(cè)序（Miseq PE300平臺(tái)）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

1.3.1 數(shù)據(jù)優(yōu)化處理 對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾（使用的軟件為FASTP0.20.0和FLASH1.2.11），再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，從而使各樣本在相同序列水平上進(jìn)行對(duì)比，具體來(lái)說(shuō)是按照各樣本中最低序列的數(shù)量將所有樣本的序列數(shù)隨機(jī)抽取至統(tǒng)一數(shù)據(jù)量，即抽平。標(biāo)準(zhǔn)化后每個(gè)樣本的有效序列數(shù)為33 621個(gè)，用于進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析方法 得到優(yōu)化序列后，運(yùn)用Uparse（7.0.1090）將OTU（operational taxonomic units）代表序列在97%的相似水平下聚類(lèi)分析；運(yùn)用RDP classifier（2.11）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)缓笈cSilva（132）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。運(yùn)用mothur（version v.1.30.1）軟件，采用Chao、Shannon、ACE和Simpson等指數(shù)進(jìn)行Alpha多樣性分析，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)T檢驗(yàn)的方法檢測(cè)兩組之間的指數(shù)值是否具有顯著性差異。選擇97%相似度的OTU，利用mothur計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的Alpha多樣性指數(shù)，利用R語(yǔ)言工具制作稀釋曲線(xiàn)圖，同時(shí)進(jìn)行物種VENN圖分析和群落組成分析。運(yùn)用各樣本的群落豐度數(shù)據(jù)，檢測(cè)不同組微生物群落中表現(xiàn)出的豐度差異的物種，評(píng)估觀(guān)察到的差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序深度分析結(jié)果

經(jīng)優(yōu)化，本試驗(yàn)共測(cè)序獲得424 272個(gè)序列，平均每個(gè)樣本獲得42 427.2個(gè)序列，其中有效序列為399 515個(gè)，平均每個(gè)樣本獲得有效序列39 951.5個(gè)，有效序列數(shù)目占原始序列數(shù)目的94.16%（表1）。采用對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表各分類(lèi)學(xué)水平的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線(xiàn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，稀釋曲線(xiàn)趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，本次測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠（圖1）。

表 1 數(shù)據(jù)優(yōu)化處理結(jié)果

圖1 不同樣本OTU水平的稀釋曲線(xiàn)圖

Figure 1 Dilution graph of different samples on OTU level

2.2 OTU聚類(lèi)和物種組成分析

所有樣品共檢出2 007個(gè)OTU，其中稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦的腸道微生物有1 840個(gè)OTU，池塘養(yǎng)殖克氏原螯蝦的腸道微生物有1 260個(gè)OTU，稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦的腸道微生物和池塘養(yǎng)殖克氏原螯蝦的腸道微生物共同的OTU有1 093個(gè)（見(jiàn)圖2），歸屬于37個(gè)門(mén)（Phylum）、102個(gè)綱（Class）、230個(gè)目（Order）、352個(gè)科（Family）、601個(gè)屬（Genus）和1 003個(gè)種（Species）。對(duì)所有樣品的OTU進(jìn)行主成分分析表明，池塘養(yǎng)殖和稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦的腸道微生物中的物種組成比較明顯地分別歸為相應(yīng)的分組（圖3）。

圖2 克氏原螯蝦腸道微生物OTU韋恩圖

Figure 2 OTU Venn diagram of the intestinal microbiotal community of red swamp crayfish

圖3 腸道微生物OTU水平的主成分分析

Figure 3 Principal component analysis of intestinal microbiota on OTU level

將所有樣本中相對(duì)豐度小于2%的物種歸為其他，圖4為個(gè)樣本在門(mén)分類(lèi)水平的細(xì)菌群落組成圖。通過(guò)對(duì)池塘養(yǎng)殖和稻田養(yǎng)殖的樣本群落組成比例分別取均值，從門(mén)水平上看，池塘養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道中厚壁菌門(mén)占67.40%，藍(lán)細(xì)菌門(mén)占18.21%，變形菌門(mén)占5.01%，放線(xiàn)菌門(mén)占5.21%，綠彎菌門(mén)占1.27%，其他占2.91%；稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道中厚壁菌門(mén)占32.69%，藍(lán)細(xì)菌門(mén)占21.61%，變形菌門(mén)占20.94%，放線(xiàn)菌門(mén)占15.66%，綠彎菌門(mén)占2.89%，其他占6.21%。

圖4 不同樣本在門(mén)分類(lèi)水平的細(xì)菌種群豐度圖

Figure 4 The bacterial population abundance diagram of different samples on phylum level

2.3 腸道微生物多樣性分析

對(duì)池塘養(yǎng)殖和稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道微生物進(jìn)行Alpha多樣性分析表明，池塘養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道微生物的Shannon、ACE和Chao多樣性指數(shù)分別為2.58±0.50、1 044±83.78和940.67±196.17，稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道微生物的Shannon、ACE和Chao多樣性指數(shù)分別為4.66±0.42、1 551±82.46和1 547.7±67.43，運(yùn)用T檢驗(yàn)檢測(cè)兩組之間的多樣性指數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)表明，值均小于0.01，達(dá)到極顯著的水平。

表2 腸道微生物多樣性分析及對(duì)比

圖5 均值總和前15在門(mén)水平差異顯著性檢驗(yàn)

Figure 5 Significance tests of the first 15 mean summations on phylum level

圖6 均值總和前15在OTU水平差異顯著性檢驗(yàn)

Figure 6 Significance test of the first 15 of the summation of mean values on OTU level

2.4 物種差異分析

采用T檢驗(yàn)對(duì)兩組樣本的門(mén)水平和種水平的組成進(jìn)行差異分析，結(jié)果表明，在門(mén)水平上有21個(gè)門(mén)差異達(dá)到顯著水平，其中有12個(gè)門(mén)差異達(dá)到極顯著水平；在OTU水平上，有364個(gè)OTU差異達(dá)到顯著水平，其中有106個(gè)OTU差異達(dá)到極顯著水平。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道微生物組成存在差異和相似之處

與其他動(dòng)物相類(lèi)似，目前的研究表明水生動(dòng)物的遺傳背景、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料組分均可以顯著影響其腸道微生物的結(jié)構(gòu)組成。張美玲等對(duì)生活在不同鹽度環(huán)境中的尼羅羅非魚(yú)及凡納濱對(duì)蝦的腸道微生物組成進(jìn)行研究表明，鹽度可以顯著影響水生動(dòng)物腸道微生物的組成[1]。李倩等對(duì)池塘內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖下和普通池塘養(yǎng)殖的太湖魴鲌腸道微生物組成情況研究表明，池塘內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖模式中的太湖魴鲌腸道微生物多樣性和菌群的均一性相對(duì)于普通池塘養(yǎng)殖模式均降低，優(yōu)勢(shì)菌群所占比例發(fā)生較大改變[6]。趙月季等對(duì)不同養(yǎng)殖模式下凡納濱對(duì)蝦腸道菌群影響研究表命名，淡水池塘養(yǎng)殖模式和高位池養(yǎng)殖模式的腸道細(xì)菌群落的豐富度、Shannon index和均勻度均顯著高于海水池塘養(yǎng)殖模式和生物絮團(tuán)養(yǎng)殖模式，4種養(yǎng)殖模式的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異[7]。本研究對(duì)兩種養(yǎng)殖模式下的克氏原螯蝦腸道微生物組成分析得出，無(wú)論是各種微生物的組成比例，還是微生物的多樣性，都存在顯著性差異，在門(mén)水平上有21個(gè)門(mén)差異達(dá)到顯著水平，其中有12個(gè)門(mén)差異達(dá)到極顯著水平，在OTU水平上，有364個(gè)OTU差異達(dá)到顯著水平，其中有106個(gè)OTU差異達(dá)到極顯著水平；在微生物多樣性方面，兩種模式下的Shannon、ACE和Chao多樣性指數(shù)差異達(dá)到極顯著的水平。之所以?xún)煞N模式下的克氏原螯蝦腸道微生物會(huì)存在顯著差異，是因?yàn)閮煞N模式下的克氏原螯蝦生長(zhǎng)環(huán)境存在很大的不同，其中稻田養(yǎng)殖模式下因?yàn)樗镜姆N植和管理為克氏原螯蝦提供了更為豐富和多樣的餌料、微生物和水質(zhì)環(huán)境。兩種模式下的克氏原螯蝦腸道微生物也存在相似的地方，在所有檢測(cè)出的2 007個(gè)OTU中，稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦的腸道微生物和池塘養(yǎng)殖克氏原螯蝦的腸道微生物共同的OTU有1 093個(gè)；從門(mén)水平上看，兩種模式的優(yōu)勢(shì)菌也均為厚壁菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、變形菌門(mén)占、放線(xiàn)菌門(mén)和綠彎菌門(mén)，但所占的比例在不同養(yǎng)殖模式下存在較大差異。

3.2 克氏原螯蝦腸道微生物組成對(duì)養(yǎng)殖指導(dǎo)作用

腸道微生物與養(yǎng)殖生物的健康有著密切的關(guān)系，腸道菌群在宿主的代謝、生長(zhǎng)和免疫等方面發(fā)揮著重要作用，是維持動(dòng)物健康的必要因素[1-2,8]。腸道細(xì)菌群落的指示類(lèi)群可用于評(píng)估對(duì)蝦的健康狀況，Xiong等[9]采用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體和對(duì)蝦腸道分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦腸道中細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化與對(duì)蝦疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，同時(shí)也采用了指示物種來(lái)指示對(duì)蝦的健康狀態(tài)，并且指示物種能夠區(qū)分樣品的來(lái)源和健康狀態(tài)。吳金鳳等[10]研究61個(gè)敏感物種在健康塘和發(fā)病塘水樣、健康和發(fā)病對(duì)蝦腸道樣品4 個(gè)組別間展現(xiàn)了清晰的差異，認(rèn)為這些敏感物種相對(duì)豐度的改變可能作為評(píng)價(jià)對(duì)蝦健康狀態(tài)的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)，可提高對(duì)對(duì)蝦病害發(fā)生概率的預(yù)測(cè)能力。張立強(qiáng)等[8]對(duì)健康和患病克氏原螯蝦腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析表明，患病組的優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門(mén)，對(duì)照組腸道微生物的優(yōu)勢(shì)菌為厚壁菌門(mén)，患病組變形菌門(mén)的占比顯著高于對(duì)照組，Simpson指數(shù)提示，患病組的生物多樣性較對(duì)照組顯著下降。本研究對(duì)兩種模式下的克氏原螯蝦腸道微生物研究結(jié)果與張立強(qiáng)等對(duì)健康組（對(duì)照組）中的優(yōu)勢(shì)菌結(jié)果一致，優(yōu)勢(shì)菌均為厚壁菌門(mén)。本研究結(jié)果表明，池塘養(yǎng)殖模式下的克氏原螯蝦腸道微生物多樣性低于稻田養(yǎng)殖模式下的多樣性，差異達(dá)到極顯著水平，因此，根據(jù)其他已有研究結(jié)果推斷，池塘養(yǎng)殖模式下的克氏原螯蝦可能會(huì)比稻田養(yǎng)殖模式下的克氏原螯蝦更容易患病，因此，針對(duì)這兩種不同的養(yǎng)殖模式需要具有不同的養(yǎng)殖管理模式和強(qiáng)度。

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Comparison of intestinal microbiota ofin pond and ricefiled culture patterns

LI Fei,LIU Shili, BIAN Yuling , ZHENG Jianbo,CHENG Shun, JIA Yongyi , CHI Meili, GU Zhimin

(Key Laboratory of Freshwater Aquatic Animal Genetic and Breeding of Zhejiang Province,Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001)

To explore the differences of intestinal microbiota of red swamp crayfish () in pond and ricefield culture patterns, microbiota diversity and community composition of red swamp crayfish from the above two patterns were studied by using the 16S rRNA high-throughput sequencing technology. The results showed that there are 2 007 OTUs(Operational taxonomic units) in total in all the tested samples, which belong to 37 phylums, there are 1 260 OTUs in the intestinal micorbiota of red swamp crayfish in pond, and 1 840 OTUs for the rice field pattern, and there are 1 093 OTUs which exist in both patterns. The first dominant phylum of the two culture patterns is the same”, i.e. Firmicutes, which occupies 67.40% in pond culture and 32.69% in ricefiled culture respectively. The Alpha diversity of the two patterns is extremely different(<0.01), the diversity of the pond culture is lower than that of the ricefield culture,which could be showed by the Shannon、ACE and Chao indexes. The intestinal microbiota compositions of the two patterns are different in different levels, on phylum level, there are 21 phylums significantly different(<0.05), in which 12 phylums are extremly different(<0.01), on OTU level, there are 364 OTUs significantly different(<0.05), in which 106 OTUs are extremly different(<0.01). The results indicated that there are obvious difference in both composition and diversity of intestinal microbiota in pond and ricefield culture patterns, therefore, there should be some difference in the management during culture. As the diversity in the pond pattern is lower, thus, more attention should be paid to, and the management should be strenthened.

pond; ricefield; red swamp crayfish; intestinal microbiota

S966.12

A

1672-352X (2021)03-0423-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.001

2021-7-7 11:35:20

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1640.002.html

2020-09-25

湖州市公益性技術(shù)應(yīng)用研究（重點(diǎn)）（2018GZ11）資助。

李 飛，副研究員。E-mail：lifeibest1022@163.com

顧志敏，研究員。E-mail：guzhimin2006@163.com