趙丙輝 李沅 李文嬌 天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 （天津 300384）

內(nèi)容提要：目的：探討3D打印技術(shù)制備骨科植入材料聚醚醚酮（PEEK）的力學(xué)性能及氨基改性對(duì)材料成骨性能的影響。方法：應(yīng)用3D打印技術(shù)制作骨科植入材料PEEK，通過(guò)單軸壓縮、單軸拉伸及三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)對(duì)其生物力學(xué)性能進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)樣品進(jìn)行低溫等離子表面改性，通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞增殖、形態(tài)及堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)來(lái)分析氨基改性對(duì)材料成骨性能的影響。結(jié)論：3D打印制備PEEK作為創(chuàng)傷骨科植入物具有穩(wěn)定、優(yōu)良、卓越的力學(xué)性能、化學(xué)性能和生物相容性，而通過(guò)在其表面引入氨基團(tuán)能夠進(jìn)一步提高材料的成骨性能。

聚醚醚酮（PEEK）是一種具有良好化學(xué)和熱穩(wěn)定性的高強(qiáng)度、高熔點(diǎn)及優(yōu)異的加工性能的芳香族的特種工程塑料材料。PEEK于1960年由美國(guó)杜邦和英國(guó)ICI聯(lián)合研制成功，1980年以來(lái)開(kāi)始作為新型植入物被廣泛應(yīng)用于骨折固定、脊柱外科、整形外科骨缺損修復(fù)、關(guān)節(jié)置換等領(lǐng)域[1]。相比純鈦，PEEK的彈性模量與骨組織更為接近，其力學(xué)性能更優(yōu)良，化學(xué)性能更穩(wěn)定，生物相容性也更優(yōu)越[2]。上世紀(jì)90年代以來(lái)，快速原型技術(shù)（RP）得到快速發(fā)展，3D打印技術(shù)的應(yīng)用不僅能實(shí)現(xiàn)植入材料的個(gè)體化定制，還進(jìn)一步提高了材料的適應(yīng)性和穩(wěn)定性。但PEEK仍屬于一種不利于和周圍骨組織形成良好骨性結(jié)合的生物惰性材料，而且其機(jī)械性還需要進(jìn)一步提高[3]。因此，本研究主要是對(duì)3D打印技術(shù)制備骨科植入材料PEEK的力學(xué)性能及氨基改性對(duì)材料成骨性能的影響進(jìn)行探討分析，為其臨床應(yīng)用領(lǐng)域的拓展提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 樣品材料

PEEK（型號(hào)Jugao-MT45，陜西巨高增材醫(yī)療科技有限公司），所有樣品表面均經(jīng)SiC水磨砂紙逐級(jí)拋光（240目、600目、800目、1200目、2000目），分別采用丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水清洗，時(shí)間為15min，之后放在烘箱中于50°C下干燥，于干燥皿中保存。

1.2 3D打印標(biāo)準(zhǔn)件制備

打印3D打印標(biāo)準(zhǔn)件，使用專用PEEK骨科植入物打印機(jī)進(jìn)行操作，成型方式采用熔融沉積成型（FDM），依照國(guó)際彎曲實(shí)驗(yàn)、壓縮實(shí)驗(yàn)和拉伸實(shí)驗(yàn)的要求制備標(biāo)準(zhǔn)試件，保證試件無(wú)扭曲，表面和邊緣應(yīng)無(wú)劃痕、凹陷、毛刺和空洞，相鄰平面相互垂直。

1.3 方法

1.3.1 力學(xué)性能測(cè)試

應(yīng)用電子靜態(tài)力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（Instron 3345）。實(shí)驗(yàn)室溫濕度分別為（23±2）°C和（50±5）%RH，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5次，具體參數(shù)為：?jiǎn)屋S壓縮實(shí)驗(yàn)參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T1041-2008進(jìn)行，采用A型試件作為壓縮模量試件，采用B型試件作為25%應(yīng)變對(duì)應(yīng)的壓縮強(qiáng)度試件，測(cè)試速度為1mm/min；三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)的參照標(biāo)準(zhǔn)為GB/T9341-2008，跨距69mm，測(cè)試速度2mm/min；單軸拉伸實(shí)驗(yàn)參照GB/T1040.1-2006&GB/T1040.2-2006標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，試件為1BA型，拉伸模量和拉伸強(qiáng)度的測(cè)試速度分別為1mm/min和5mm/min，初始夾具間距分別為60mm和65mm。

1.3.2 樣品表面改性

對(duì)PEEK材料樣品進(jìn)行低溫等離子表面改性，反應(yīng)室的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)頻率為13.56MHz，基礎(chǔ)壓強(qiáng)<1×103Pa（開(kāi)始放電前）。首先對(duì)樣品表面應(yīng)用氬氣進(jìn)行清潔和活化，參數(shù)為：壓強(qiáng)為5×10-2Pa，連續(xù)波50W，10s，之后對(duì)材料表面分別在連續(xù)波和偶連脈沖模式下用烯丙胺進(jìn)行輝光放電等離子改性，具體參數(shù)為：連續(xù)波的射頻功率和時(shí)間分別為45W和10min，脈沖的平均功率為13.5W，占空比3/10，時(shí)間為30min。

1.3.3 氨基標(biāo)定與檢測(cè)

應(yīng)用4-三氟甲基苯甲醛（TFBA）對(duì)氨基進(jìn)行標(biāo)定，2h后進(jìn)行材料表面元素測(cè)定，檢測(cè)儀器為X射線光電子能譜儀，檢測(cè)元素為碳元素、氧元素、氟元素和氮元素。

1.3.4 成骨性能檢測(cè)

成骨細(xì)胞培養(yǎng)及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色：在37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行MG-63成骨細(xì)胞孵育，應(yīng)用含2%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液（H-DMEM完全培養(yǎng)液）培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶消化，傳代。將MG-63稱骨細(xì)胞接種至24孔板中的樣品表面（實(shí)驗(yàn)前紫外線照射至少30min）培養(yǎng)，6h后用PBS緩沖液沖洗，重復(fù)3次，沖洗后用4%多聚甲醛固定10min，用DAPI染料染色10min，棄去PBS液，清洗5min，連續(xù)3次，用顯微鏡觀察細(xì)胞的黏附情況。

掃描電鏡觀察：在24孔板中的樣品表面接種MG-63成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為6h，之后用2.5%戊二醛進(jìn)行固定，時(shí)間為12h。用PBS液充分沖洗樣品，3次×15min，不同梯度乙醇脫水，風(fēng)干、噴金后用掃描電鏡進(jìn)行觀察。

細(xì)胞增殖檢測(cè)：在24孔板中的樣品表面接種MG-63成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第1天和第7天后，加入人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）試劑，體積比為10:1，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光光度值。

堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)：在24孔板中的樣品表面接種MG-63成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第7天和第14天時(shí)進(jìn)行ALP活性檢測(cè)：用PBS液重復(fù)沖洗3次，加入0.1%Triton-X，放置在冰箱中，4°C下裂解40min，之后檢測(cè)總蛋白量，應(yīng)用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所提供）進(jìn)行檢測(cè)，再進(jìn)行ALP量檢測(cè)，采用ALP試劑盒（京中生生物工程高技術(shù)公司提供）檢測(cè)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作并計(jì)算ALP活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.結(jié)果

2.1 力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果

力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果顯示：?jiǎn)屋S拉伸性能檢測(cè)顯示拉伸模量為（3742.60±271.92）MPa，拉伸強(qiáng)度為（96.02±1.71）MPa；單軸壓縮性能檢測(cè)顯示壓縮模量和壓縮強(qiáng)度分別為（2782.30±128.35）MPa和（143.08±7.16）MPa；三點(diǎn)彎曲性能檢測(cè)結(jié)果顯示彎曲模量和彎曲強(qiáng)度分別為（3577.70±133.81）MPa和（139.46±2.09）MPa。

2.2 氨基改性對(duì)材料成骨性能的影響

XPS分析結(jié)果顯示，PEEK樣品表面在氨基改性前僅含有氧和碳兩種元素，氨基改性后可檢測(cè)到氟元素和氮元素，說(shuō)明等離子體氨基改性在材料表面引入了氨基。DAPI染色后在掃描電鏡下觀察可見(jiàn)，成骨細(xì)胞在經(jīng)改性后的PEEK材料表面上黏附增多（見(jiàn)圖1），細(xì)胞在材料表面呈梭形，扁平狀，伸展較好，板狀偽足向材料表面伸展（見(jiàn)圖2）。培養(yǎng)1d和7d時(shí)，經(jīng)改性后的PEEK材料的OD值較改性前均明顯增加；培養(yǎng)7d和14d時(shí)，經(jīng)改性后的PEEK材料的ALP活性較改性前也明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見(jiàn)表1）。

圖1.MG-63成骨細(xì)胞在材料樣品表面培養(yǎng)6h后的DAPI染色結(jié)果

圖2.MG-63成骨細(xì)胞在材料樣品表面培養(yǎng)6h后細(xì)胞形態(tài)

表1.經(jīng)氨基改性前后細(xì)胞增殖能力和ALP檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

表1.經(jīng)氨基改性前后細(xì)胞增殖能力和ALP檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

注：與改性前比較，aP<0.05

時(shí)間 OD值 ALP活性培養(yǎng)1d 培養(yǎng)7d 培養(yǎng)7d 培養(yǎng)14d改性前 0.21±0.06 0.47±0.11 0.24±0.03 0.63±0.17改性后 0.36±0.08a 0.63±0.14a 0.34±0.04a 0.76±0.08a

3.討論

從生物力學(xué)角度來(lái)看，相比金屬植入體（180GP），PEEK材料的彈性模量（3-4GP）與皮質(zhì)骨（約18GP）更為接近，通過(guò)對(duì)含碳纖維PEEK碳纖維長(zhǎng)度和方向進(jìn)行調(diào)節(jié)，該材料的彈性模量可達(dá)到與皮質(zhì)骨相同的程度。鈦等傳統(tǒng)金屬生物材料的彈性模量很高，容易引發(fā)應(yīng)力遮蔽作用，導(dǎo)致種植體邊緣骨質(zhì)流失而出現(xiàn)松動(dòng)和脫落，并為細(xì)菌的侵入提供了路徑。相較而言，PEEK的彈性模量與骨組織更為激進(jìn)，其對(duì)骨組織和植入物之間骨結(jié)合的牢固性和穩(wěn)定性更有益。研究顯示，PEEK材料在一定溫度條件下，在不同且持續(xù)應(yīng)力等級(jí)的拉伸中不會(huì)產(chǎn)生明顯蠕變，其經(jīng)過(guò)一萬(wàn)次循環(huán)的拉伸疲勞測(cè)試后仍能維持高強(qiáng)度的力學(xué)性能[4]。而且，PEEK還是具有優(yōu)良摩擦學(xué)性能的自潤(rùn)滑材料，摩擦系數(shù)較超高分子量的聚乙烯復(fù)合材料明顯降低，在填充碳纖維或其他材料后磨損率會(huì)進(jìn)一步顯著降低。從化學(xué)結(jié)構(gòu)角度來(lái)看，PEEK結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性極高，其是由苯環(huán)通過(guò)酮鍵和醚鍵在對(duì)位連接而成，因此具有熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和射線穩(wěn)定性，可反復(fù)經(jīng)γ射線、高壓、高溫消毒。已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，PEEK材料在肌肉內(nèi)植入測(cè)試和皮下毒性測(cè)試中均顯示出無(wú)任何致癌致畸毒性，有很好的生物相容性[5,6]。而鈷鉻合金、鈦合金等臨床應(yīng)用最多的傳統(tǒng)金屬骨替代生物材料，因?yàn)椴牧媳旧淼耐俗兒驮谏硭釅A性條件下會(huì)釋放金屬離子，往往引起植入物修復(fù)失敗。

從制造方法角度看，PEEK材料目前主要存在熱塑成型、機(jī)械加工和3D打印3種加工方法。熱塑成型是可用于形狀復(fù)雜部件加工和生產(chǎn)的傳統(tǒng)高分子材料加工工藝，尤其是批量生產(chǎn)，但其在個(gè)性化材料的設(shè)計(jì)和制作優(yōu)勢(shì)不足，工序復(fù)雜且繁瑣，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，成本高，經(jīng)濟(jì)性差。機(jī)械加工也具有成本高的缺點(diǎn)，而且其對(duì)材料的利用率較低。而3D打印技術(shù)是一種以數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)的構(gòu)造物體技術(shù)，其通過(guò)在立體模型上勾勒出以CT或MRI數(shù)據(jù)為依據(jù)的幾何形態(tài)，進(jìn)行區(qū)域重建，并通過(guò)逐層精確堆積材料來(lái)最終構(gòu)造出所需的物體，該制作工藝最大的優(yōu)點(diǎn)能在實(shí)現(xiàn)復(fù)雜形狀結(jié)構(gòu)精密成形的基礎(chǔ)上定制出個(gè)體化的植入材料，具有很高穩(wěn)定性配適性[7]。本研究中使用PEEK骨科植入物3D打印機(jī)并采用FDM成型方式制備PEEK材料樣件，通過(guò)力學(xué)性能測(cè)試顯示，3D打印材料的拉伸強(qiáng)度、抗壓能力、抗彎能力均處于較高水平，其拉伸強(qiáng)度與皮質(zhì)骨接近，壓縮強(qiáng)度與皮質(zhì)骨基本一致，抗彎強(qiáng)度則明顯高于皮質(zhì)骨。

盡管PEEK材料的機(jī)械性能、可加工性和穩(wěn)定性都較好，但其屬于生物惰性材料，其機(jī)械性能和骨結(jié)合能力比純鈦都更低，這會(huì)極大地影響其臨床應(yīng)用的范圍。低溫等離子表面改性技術(shù)是一種較為先進(jìn)的新型材料表面改性技術(shù)。等離子體指完全或部分電離氣體，是物質(zhì)的第四態(tài)，而低溫等離子體是在高能量放電（包括輝光放電、直流電弧放電、電暈放電、微波放電、射頻放電等）的條件所產(chǎn)生的包含大量不同類型粒子（電子、離子、原子、自由基、分子等）的部分電離氣體，這些大量存在的不同類型粒子會(huì)產(chǎn)生極其復(fù)雜的相互作用，從而能使一些普通情況下難以實(shí)現(xiàn)的事被完成。低溫等離子表面改性具體是在高能量的電流放電狀態(tài)下，將揮發(fā)的氣態(tài)的單體化學(xué)鍵打斷，然后這些化學(xué)鍵在材料表面以共價(jià)鍵形式重組、結(jié)合，形成新的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)，而且這些結(jié)構(gòu)有不同的活性功能層。該方法能處理各種不同形狀的材料表面，通過(guò)在低溫處理過(guò)程中引入占空比、脈沖等能對(duì)單一有機(jī)分子產(chǎn)生激活作用，同時(shí)不會(huì)對(duì)其基本化學(xué)功能產(chǎn)生破壞作用，不改變材料基體性質(zhì)，進(jìn)而使表面具有穩(wěn)定性、功能性和高特異性的特點(diǎn)，還具有強(qiáng)大的殺菌作用。氨基表面帶正電荷，其活血反應(yīng)活性良好，被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境中蛋白質(zhì)等生物分子的偶連[8]。有研究指出，氨基改性有利于促進(jìn)稱骨細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在純鈦表面的黏附和增殖，材料的成骨活性也大大提高[9]。本研究結(jié)果顯示，PEEK材料表面成骨細(xì)胞黏附增多，表面稱骨細(xì)胞呈偏平狀，伸展較好，細(xì)胞OD值明顯增加，且ALP活性明顯升高。提示氨基改性有利于稱骨細(xì)胞在材料表面的增殖和分化，細(xì)胞的黏附數(shù)量增加，伸展形態(tài)增強(qiáng)，細(xì)胞增殖能力升高，同時(shí)對(duì)材料表面稱骨細(xì)胞具有促進(jìn)其早期分化的作用，但這種作用的具體機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究。

綜上所述，3D打印制備PEEK作為創(chuàng)傷骨科植入物具有穩(wěn)定、優(yōu)良、卓越的力學(xué)性能、化學(xué)性能和生物相容性，而通過(guò)在其表面引入氨基團(tuán)能夠進(jìn)一步提高材料的成骨性能。