郭 川，張旭彬，張志華

廣東省汕頭市疾病預(yù)防控制中心，廣東汕頭 515041

登革熱(DF)是流行于熱帶與亞熱帶地區(qū)的一種蟲(chóng)媒傳染病。它以登革病毒(DENV)為病原體，以白紋伊蚊和埃及伊蚊為主要傳播媒介，每年在世界上造成超過(guò)5 000萬(wàn)人感染[1]，給世界公共衛(wèi)生體系帶來(lái)較大沖擊。登革熱根據(jù)所呈現(xiàn)的癥狀分為普通型和重癥兩種。普通型主要臨床表現(xiàn)以發(fā)熱(通常超過(guò)38 ℃)以及關(guān)節(jié)和肌肉疼痛為主；重癥則以登革出血熱(DHF)及登革休克綜合征(DSS)為代表，較為嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命[2]。有報(bào)道稱(chēng)登革病毒包膜蛋白上的潛在毒力位點(diǎn)決定了毒株的毒力，從而影響了病毒感染機(jī)體后的臨床表現(xiàn)[3-4]。因此，對(duì)流行毒株包膜蛋白的分子特征，特別是氨基酸進(jìn)行序列分析，可以對(duì)該毒株的毒力做出評(píng)估和預(yù)測(cè)，從而為登革熱疫情流行期間病例所呈現(xiàn)的臨床特征分析提供分子生物學(xué)依據(jù)[5]。本文將汕頭市2019年登革熱疫情期間的病例所呈現(xiàn)的臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行分析及總結(jié)，探討臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果同疾病病程之間的關(guān)系，為臨床醫(yī)生識(shí)別與判斷登革熱病例提供數(shù)據(jù)及技術(shù)支持；同時(shí)對(duì)主要流行毒株的包膜蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，對(duì)潛在毒力位點(diǎn)進(jìn)行判別和毒力評(píng)估，從分子生物學(xué)的角度為該年疫情中患者所呈現(xiàn)的臨床特征進(jìn)行解釋。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年汕頭市登革熱病例就診時(shí)所口述的發(fā)病時(shí)間，主要癥狀(劇烈頭痛、骨關(guān)節(jié)肌肉疼痛、眼眶痛)及呈現(xiàn)的體征(體溫、皮疹)等信息，以及病例的核酸檢測(cè)結(jié)果。

1.2方法 將該年發(fā)現(xiàn)的所有登革熱病例根據(jù)口述的發(fā)病時(shí)間進(jìn)行聚類(lèi)分組，發(fā)病24 h之內(nèi)的歸為0 d、列為0組，發(fā)病24～48 h的歸為1 d、列為1組，以此類(lèi)推，將發(fā)病≥10 d列為10+組，共分11個(gè)組。統(tǒng)計(jì)每個(gè)組的病例中各種臨床表現(xiàn)的比率(具有該臨床表現(xiàn)的病例數(shù)/該組病例數(shù))，以及實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)的陽(yáng)性率。對(duì)核酸陽(yáng)性的確診病例標(biāo)本進(jìn)行包膜蛋白編碼基因(E基因)的全長(zhǎng)擴(kuò)增和序列測(cè)定，方法參照之前的報(bào)道[6]。獲得序列以后，采用生物信息學(xué)軟件DNAstar/SeqMan進(jìn)行序列剪切和拼接，用MEGA6.0進(jìn)行編碼蛋白氨基酸翻譯和比對(duì)(氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建采用Neighbor-Joining鄰接法)，同時(shí)參考趙衛(wèi)等[7]所報(bào)道的潛在毒力位點(diǎn)，對(duì)流行毒株的毒力位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1核酸檢測(cè)結(jié)果隨發(fā)病時(shí)間增加的變化 2019年所報(bào)道的943病例中，根據(jù)發(fā)病到標(biāo)本采集的時(shí)間進(jìn)行聚類(lèi)分組，一共分為11個(gè)組，每組分別檢測(cè)63、172、177、141、136、104、66、32、27、11、14份標(biāo)本。從圖1可以看出絕大部分就診病例處于發(fā)病時(shí)間0～5 d的階段，此階段的核酸檢測(cè)結(jié)果大部分呈陽(yáng)性(構(gòu)成比>80%)。也有一部分病例在發(fā)病6 d后才就診，可見(jiàn)該部分病例的核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率明顯下降。發(fā)病時(shí)間越長(zhǎng)陽(yáng)性率下降越明顯，但也有病例發(fā)病10 d后核酸檢測(cè)結(jié)果依然呈陽(yáng)性。

圖1 不同發(fā)病時(shí)間組核酸檢測(cè)陽(yáng)性率的變化

2.2臨床表現(xiàn)的分析結(jié)果 943例病例中共追溯到了790例就診時(shí)的臨床表現(xiàn)情況，根據(jù)追溯到的病例的發(fā)病時(shí)間分為11組(分別代表發(fā)病從0～≥10 d)，每組分別分析了41、139、147、120、126、83、51、32、27、10、14例，見(jiàn)表1。從總體上看，發(fā)熱是病例最主要的臨床表現(xiàn)，約有96.84%的病例有發(fā)熱體征，而且發(fā)熱體征在發(fā)病后10 d內(nèi)都基本存在，可見(jiàn)發(fā)熱是登革熱病例最重要的體征；具有骨關(guān)節(jié)肌肉疼痛臨床表現(xiàn)的病例構(gòu)成比也較高(53.16%)，主要分布在病程的前7 d，從第8天開(kāi)始，有該癥狀的病例數(shù)迅速下降；有頭痛癥狀的病例與骨關(guān)節(jié)肌肉疼痛類(lèi)似，病程前期所占比例較高，后期較低；有皮疹出血體征的病例隨著發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，構(gòu)成比逐漸上升，可見(jiàn)在病程后期，有較高比例的病例呈現(xiàn)皮疹出血體征；有眼眶痛癥狀的病例在整個(gè)病程中都呈現(xiàn)較低的構(gòu)成比。臨床上主要以輕癥為主，尚未發(fā)現(xiàn)DHF或DSS的病例，未發(fā)現(xiàn)死亡病例。

表1 各種臨床表現(xiàn)的病例數(shù)及構(gòu)成比[%(n/n)]

臨床表現(xiàn)各發(fā)病時(shí)間的臨床表現(xiàn)構(gòu)成比4 d5 d6 d7 d8 d9 d≥10 d 發(fā)熱95.24(120/126)97.59(81/83)98.04(50/51)93.75(30/32)96.30(26/27)100.00(10/10)78.57(11/14)劇烈頭痛31.75(40/126)26.51(22/83)35.29(18/51)43.75(14/32)29.63(8/27)10.00(1/10)14.29(2/14)骨關(guān)節(jié)肌肉疼痛60.32(76/126)57.83(48/83)66.67(34/51)59.38(19/32)29.63(8/27)40.00(4/10)14.29(2/14)眼眶痛11.90(15/126)9.64(8/83)15.69(8/51)3.13(1/32)7.41(2/27)10.00(1/10)0.00(0/14)皮疹出血25.40(32/126)36.14(30/83)41.18(21/51)62.50(20/32)37.04(10/27)50.00(5/10)42.86(6/14)

2.3毒株包膜蛋白分子特征分析 從811例病例中共獲得85條登革病毒E基因序列，其中1型病毒62條，2型病毒23條。3型和4型病毒由于陽(yáng)性較弱無(wú)法獲得其毒株序列。流行毒株包膜蛋白氨基酸序列經(jīng)過(guò)精簡(jiǎn)(對(duì)氨基酸相似度100%的序列進(jìn)行精簡(jiǎn)，1型病毒62條序列精簡(jiǎn)后剩下12條，2型病毒23條序列精簡(jiǎn)后剩下8條)后進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。從分析(圖2)結(jié)果可以看出，2019年流行的登革病毒毒株大致可分為主要流行毒株和次要毒株。主要流行毒株包括登革1型病毒中序號(hào)為D1/China/GDst19/9、D1/China/GDst19/16、D1/China/GDst19/600、D1/China/GDst19/604、D1/China/GDst19/793、D1/China/GDst19/961、D1/China/GDst19/1164等毒株(圖2A)，以及登革2型病毒中序號(hào)為D2/China/GDst19/25、D2/China/GDst19/340、D2/China/GDst19/413、D2/China/GDst19/532、D2/China/GDst19/846、D2/China/GDst19/983等毒株(圖2B)；同型主要流行毒株之間的氨基酸序列相似度達(dá)100%。次要毒株與主要流行毒株有1～2個(gè)位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生變異，包括登革1型病毒中序號(hào)為D1/China/GDst19/3、D1/China/GDst19/13、D1/China/GDst19/591、D1/China/GDst19/1117和D1/China/GDst19/1159等毒株(圖2A)，以及登革2型病毒中序號(hào)為D2/China/GDst19/53和D2/China/GDst19/584等毒株(圖2B)。將氨基酸序列相似度100%主要流行毒株序列中選擇一條作為代表序列(登革1型選序號(hào)D1/China/GDst19/9，登革2型選序號(hào)D2/China/GDst19/25)與次要毒株氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果顯示，主要流行毒株與次要毒株的氨基酸序列在潛在的毒力位點(diǎn)(DENV-1的E44-E、 E156-T、E366-N和 DENV-2的E71-A、E126-E、E383-385-E-P-G、E390-S)氨基酸殘基都保持一致。

注：A為登革1型病毒；B為登革2型病毒。

3 討 論

每年夏秋之際，登革熱疫情的預(yù)警及防控都得到各地衛(wèi)生行政及疾病控制部門(mén)的重視。2018年衛(wèi)生行政部門(mén)出臺(tái)了新版的《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)：WS218-2018》[8]，該方案將具有發(fā)熱、頭痛/骨關(guān)節(jié)痛/眼眶痛和皮疹臨床表現(xiàn)的患者作為疑似病例。病例的臨床表現(xiàn)判斷在該病的早期識(shí)別中起到至關(guān)重要的作用。

2019年，汕頭市暴發(fā)了嚴(yán)重的登革熱疫情，截至2019年末共報(bào)道了943例病例[9]。在所報(bào)道的病例中，大多數(shù)患者為癥狀輕微的普通型病例，未發(fā)現(xiàn)重癥登革熱病例。主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱(96.84%)和骨關(guān)節(jié)肌肉疼痛(53.16%)。之前有報(bào)道稱(chēng)登革熱患者最主要的臨床表現(xiàn)為發(fā)熱和肌肉關(guān)節(jié)疼痛[10-11]，本文結(jié)論與之基本一致。癥狀輕微有可能是因?yàn)榱餍卸局陮儆谌醵局?。?duì)登革病毒的包膜蛋白氨基酸序列分析結(jié)果顯示，主要潛在毒力位點(diǎn)登革1型病毒為E44-E、E156-T、E366-N；登革2型病毒為E71-A、E126-E、E383-E-P-G-E385、E390-S，不但2019年的所有毒株氨基酸殘基都保持一致，而且與2015-2017年的流行毒株氨基酸序列保持一致[5]。因此可以解釋病例的癥狀普遍與前些年流行的毒株十分相似，以發(fā)熱和骨關(guān)節(jié)肌肉疼痛為主，未見(jiàn)重癥病例。雖然在潛在毒力位點(diǎn)之外的區(qū)域，2019年毒株的包膜蛋白還是發(fā)生了1～2個(gè)氨基酸的變異，但是產(chǎn)生的變異對(duì)病例的臨床表現(xiàn)沒(méi)有產(chǎn)生明顯的影響。感染主要流行毒株與次要毒株的病例的臨床癥狀和體征沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的差異。

癥狀輕微，雖然說(shuō)明該病未對(duì)患者身體造成嚴(yán)重傷害，但也會(huì)造成患者未及時(shí)就醫(yī)導(dǎo)致病例控制上的遺漏，給社區(qū)的登革熱防控造成較大的壓力。在疫情流行期間，臨床醫(yī)生為了防止遺漏病例，往往將具有輕微臨床表現(xiàn)的患者列為疑似病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室篩查檢測(cè)。一般來(lái)說(shuō)，登革病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)共需要進(jìn)行NS1抗原、核酸及IgM和IgG抗體4個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)。其中NS1抗原在發(fā)病1 d后便可在患者體液中檢測(cè)到，并持續(xù)到第9天左右。在檢出NS1抗原的同時(shí)也可在體液中檢出登革病毒核酸，并持續(xù)到第7天[12]。核酸檢測(cè)結(jié)果作為登革熱病例的確診依據(jù)[8]，確立了核酸檢測(cè)在該病診斷中的地位。但核酸檢測(cè)主要適合應(yīng)用于發(fā)病早期病例標(biāo)本的檢測(cè)，此時(shí)血液中病毒核酸的豐度較高。在病程后期由于機(jī)體產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，病毒在血液中的濃度逐漸下降，此時(shí)無(wú)法在標(biāo)本中檢出核酸。但本文發(fā)現(xiàn)登革病毒核酸在發(fā)病7 d后的病例中仍有大部分能夠被檢出，可能是由于商業(yè)化檢測(cè)試劑的不斷優(yōu)化改進(jìn)，使得原來(lái)豐度較低的病毒核酸標(biāo)本依然能被檢出。這提示可將發(fā)病10 d之內(nèi)的病例都進(jìn)行核酸檢測(cè)及分型，以提高確證病例的比例。發(fā)病10 d之后的病例需輔以抗體檢測(cè)以區(qū)分恢復(fù)期病例或既往感染。

降低排查門(mén)檻(將具有輕微臨床表現(xiàn)的患者列為疑似病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室篩查檢測(cè))，增加排查檢測(cè)項(xiàng)目，雖然提高了檢出率，降低了遺漏病例的風(fēng)險(xiǎn)，但卻給實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)較大的排查壓力。本研究結(jié)果表明，可根據(jù)病例的臨床表現(xiàn)，對(duì)該病例進(jìn)行一定程度的病程研判，進(jìn)而采取不同的檢測(cè)策略。其中最有判別意義的兩個(gè)臨床表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)肌肉疼痛和皮疹。以發(fā)病7 d為界，骨關(guān)節(jié)肌肉疼痛提示病例可能處于發(fā)病7 d以?xún)?nèi)，核酸可能為陽(yáng)性；而皮疹出現(xiàn)預(yù)示著病例發(fā)病已有7 d，核酸豐度降低，可能檢測(cè)結(jié)果為陰性，必須進(jìn)行抗體檢測(cè)。