郭 露，夏 珂，王 蘭，鄧明剛，何 婷，鄧良偉

(1.華中農業(yè)大學 生命科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.農業(yè)農村部沼氣科學研究所，四川 成都 610041；3.山西農業(yè)大學生命科學學院，山西 晉中 030620)

隨著生豬養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；l(fā)展，大量豬場糞污集中產生，給當?shù)卦斐闪溯^大環(huán)境壓力。厭氧消化不僅能夠消減豬場糞污中的有機物，而且還產生清潔能源—甲烷，可為糞污處理產生經濟價值[1]。但是，豬場糞污厭氧消化后殘余的厭氧消化液(沼液)中氨氮含量仍然較高，資源化還田利用是沼液最佳處置方法。由于在土地緊張地區(qū)，沼液難以完全還田利用，因此，如何為數(shù)量巨大的豬場糞污尋找經濟有效的處理、處置方法，已經成為規(guī)模豬場亟需解決的問題。目前，難以還田的沼液只能達標處理以后排入附近水體，脫氮是達標處理主要目標[2]。

傳統(tǒng)硝化-反硝化工藝需大量易降解有機物作為碳源[3]，而豬場糞污在沼氣發(fā)酵技術回收能源后，厭氧消化液中有機物含量低，無法滿足硝化-反硝化工藝的碳源需求，使得其脫氮效能低、能耗高[4]。自養(yǎng)型同步脫氮(autotrophic nitrogen removal，ANR)工藝是以自養(yǎng)型好氧氨氧化菌(Ammonia-oxidizing microorganisms，AOM)和自養(yǎng)型厭氧氨氧化菌(Anammox菌)為主要功能微生物的脫氮工藝，其中AOM細菌將氨氧化為亞硝氮，而Anammox菌將剩余的氨氮和亞硝氮同時轉化成氮氣，達到廢水自養(yǎng)生物脫氮作用[5]。該工藝全程自養(yǎng)無需外加碳源，能有效減少曝氣能耗和外加碳源成本，是一種具有廣闊前景的自養(yǎng)生物脫氮技術，對于處理豬場厭氧消化液等低碳氮比廢水具有明顯優(yōu)勢。自養(yǎng)型同步脫氮工藝以顆粒污泥(ANR顆粒污泥)為主體，以往的研究主要以模擬廢水作為進水。大量研究表明，豬場糞污成分復雜，含有模擬廢水所沒有的大量抑菌物質，包括高濃度的抗生素[6]、重金屬[7]、高濃度的無機鹽類、激素類[8]物質等，這些抑菌物質可能給自養(yǎng)型同步脫氮工藝的穩(wěn)定運行帶來巨大障礙。

已有研究表明，存在大量有機物的情況下，厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌的競爭下處于劣勢，主要原因是有機物利于異養(yǎng)反硝化細菌的生長，而厭氧氨氧化細菌作為化能自養(yǎng)型細菌處于不利地位[9-10]。但在外部有AOM保護的情況下，有機物是否可對ANR顆粒污泥產生影響，目前尚不完全清楚。除此之外，一系列研究表明，Cu2+[11-12],Pb2+,Hg2+,Cd2+,Ag2+[13],Co2+,Zn2+,Mn2+,Ni2+[14]等金屬離子對廢水處理中的微生物菌群具有不利影響，可能會降低廢水處理效能。微量的某些金屬離子是某些酶和輔酶的重要組成部分，能夠促進微生物的活性，而過量重金屬離子的存在對微生物的生長代謝和繁殖具有較強毒性[15]。但其是否可對微生態(tài)較穩(wěn)定的ANR顆粒污泥產生影響，目前尚未見報道。隨著非洲豬瘟疫情爆發(fā)[16]，作為豬場常用消毒劑主要成分之一的戊二醛使用量激增，殘留的戊二醛隨豬場沖洗水一同匯入豬場廢水中。戊二醛在殺滅病原菌的同時，也可能對廢水生物處理系統(tǒng)中的功能微生物產生毒性，繼而干擾污水處理系統(tǒng)性能[17]。但經厭氧消化和一系列廢水處理以后，戊二醛是否仍存在殘留，其對ANR顆粒污泥是否產生影響，目前尚未見報道。

因此，本研究通過對20個不同地區(qū)或不同處理階段豬場廢水的特性、重金屬以及戊二醛含量的檢測，解析了豬場廢水中抑菌物質的存在狀況，進而分析了有機物、戊二醛以及Cu2+對ANR顆粒污泥中主要脫氮微生物活性的影響，以期弄清ANR工藝運用于豬場廢水脫氮過程中可能存在的抑制問題，為自養(yǎng)型同步脫氮工藝在豬場廢水處理過程中的穩(wěn)定運行奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 不同豬場廢水的取樣

分別取20個不同豬場不同處理階段的廢水樣品，取樣后用冰袋保存寄送至實驗室，保存于-20℃冰箱，以備后續(xù)實驗使用。

1.2 抑菌物質對ANR顆粒污泥中主要脫氮微生物菌群的影響

1.2.1 活性試驗

本課題組的前期研究表明，AOM和Anammox細菌為ANR顆粒污泥的主要功能微生物[5]。因此，本研究分別測定不同濃度Cu2+和有機物濃度(葡萄糖，以COD計)、戊二醛對ANR顆粒污泥主要功能微生物活性的影響，包括好氧氨氧化菌(AOM)氨氧化活性、亞硝酸鹽氧化菌(NOB)亞硝酸鹽氧化活性和Anammox細菌的厭氧氨氧化活性、異養(yǎng)反硝化菌(DB)的反硝化活性。其中AOM,NOB,Anammox活性試驗參考Wang[18]等的方法進行。

1.2.2 戊二醛對ANR顆粒污泥形態(tài)特性的影響

取5 g ANR顆粒污泥于100mL血清瓶，加入100mL模擬廢水，分別加入一定量戊二醛儲備液，使得瓶內戊二醛終濃度為0,10,30,50 mg·L-1，在150 rpm，30℃條件下培養(yǎng)48 h后取上清液，過0.45 μm濾膜，使用蒽酮-硫酸法檢測其中的多糖含量[19]；取污泥沉淀物，使用QICPIC粒度儀(Sympatec GmbH，德國)測試污泥顆粒粒徑分布和粒徑相關參數(shù)。

1.3 廢水中抑菌物質及常規(guī)水質指標檢測方法

1.3.1 重金屬的檢測方法

Cu，Pb，Ni，F(xiàn)e，Zn和Cd采用原子吸收分光光度計法進行測定(PinAAcle900T，Perkin Elmer，美國)，As采用原子熒光光度計法進行測定(AFS-922，北京吉天儀器，中國)，檢測方法主要參照《水質銅、鋅、鉛、鎘的測定原子吸收分光光度法》(GB7475-1987)，《土壤質量鉛、鎘的測定石墨爐原子吸收分光光度法》(GB/T 17141-1997)和《食品安全國家標準 食品中鎳的測定》(GB 5009.138-2017)。

1.3.2 戊二醛的檢測方法

豬場廢水樣品中戊二醛含量使用液相色譜質譜聯(lián)用儀(LCMS-IT-TOF，島津，日本)進行檢測，采用電噴霧法進行樣品的離子化，掃描范圍：50～200 m/z；電離電壓：4.50 kV；界面溫度：250℃；噴霧器氣體(N2)流量：90 L·h-1；檢測器電壓：1.60 kV；采用連續(xù)模式進行檢測。

1.3.3 常規(guī)水質指標測定

pH值使用pH計(PHS-3E，雷磁，中國)進行測定；氨氮采用納氏試劑分光光度法測定，亞硝氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測定，硝氮采用紫外分光光度法測定；COD使用COD快速測定儀(LH-3C，連華科技，中國)進行測定；溶解氧(DO)濃度使用便攜式溶解氧儀(HQ30d, 哈希,美國)進行測定；VSS采用重量法測定。

2 結果與討論

2.1 不同豬場廢水的基本特性

從表1可以看出，各豬場廢水在各個階段的pH值都處在一個中性偏堿性的范圍內(7.0～9.3),該范圍恰好也在AOM和Anammox細菌的最適pH范圍內[20-21]，因此豬場廢水的pH值適合ANR顆粒污泥的生長與代謝。氨氮是ANR顆粒污泥的主要基質，在豬場廢水中，原水和沼液的氨氮濃度分別為1364±634和1293±546 mg·L-1。研究表明，AOM對NH3的半飽和常數(shù)和抑制濃度分別為0.0102～2.69 mg·L-1和6800 mg·L-1[22-23]；而Anammox細菌對NH3的親和力常數(shù)和抑制濃度分別小于0.1 mg N·L-1和大于1000 mg N·L-1[24]?？梢?，豬場廢水的氨氮濃度也是適宜ANR工藝的。

根據清糞工藝的不同，豬場廢水原水中COD濃度差異較大，在3154～50860 mg·L-1之間；經過厭氧消化以后，沼液COD濃度大幅削減，為2254±1773 mg·L-1(見表1)。研究表明，高濃度的非毒性有機物會抑制Anammox的活性，而低濃度的有機物甚至會促進Anammox反應器的效能[21]。這主要是由于，高濃度的有機物有助于異養(yǎng)微生物的生長，而異養(yǎng)微生物比自養(yǎng)微生物生長快速，從而對自養(yǎng)的Anammox細菌產生競爭性抑制；另一方面，有研究表明，Anammox細菌具有代謝多樣性，在高濃度有機物的情況下，其更傾向于利用有機物產生能量，而非氨和亞硝酸鹽，從而降低其脫氮活性[25-27]。同時，Li[28]等的研究也表明，100 mg·L-1COD濃度下，氨氮和總氮去除率大于90%，而當COD濃度增加到300 mg·L-1時，厭氧氨氧化的脫氮效能降低到69%。此外，過量的有機物對厭氧氨氧化顆粒污泥的EPS分布和微生物結構也有影響[29]。由此推測，過高的有機物濃度可能成為ANR顆粒污泥的脫氮抑制因子之一。

表1 20個豬場廢水樣品基本特性

2.2 豬場廢水中重金屬含量的分布

本研究分析了上述20個豬場廢水的主要重金屬含量(見表2)。結果表明，鐵離子在豬場廢水中大量存在，含量較高，除了眉山某豬場的好氧出水(本身含量低)以及簡陽某豬場的超濾和反滲透出水(膜過濾作用去除)外，其余廢水均在1.49～131 mg·L-1濃度范圍內，其中沼液中為30.1±47.6 mg·L-1。但是從目前的研究來看，鐵離子的存在對微生物的脫氮是有利的，它的存在可以促進微生物之間的凝聚作用[30]。而鉛和鎳在20個不同的豬場廢水中只有個別樣品檢出且含量極低(檢出鉛和鎳的濃度分別為0.0077±0.024 mg·L-1，0.058±0.063 mg·L-1)，作為ANR顆粒污泥脫氮抑菌因子來研究不具有代表性。鎳的含量在各廢水樣品中都處于較低水平，均在1 mg·L-1以下，而孫琪[31]等人的研究表明，在這個濃度水平下鎳離子對厭氧氨氧化幾乎沒有影響。砷在不同地區(qū)豬場廢水中的濃度差異較大，為0.011～35.5 μg·L-1，這可能跟地區(qū)土壤砷存在的環(huán)境背景相關。Zn幾乎在所有的豬場廢水中均存在，其中在原水、沼液、好氧出水和終水(絮凝出水或超濾出水)中的濃度分別為14.1，15.3，4.85，0.120 mg·L-1，可見，隨著豬場廢水的處理，一部分的Zn2+可隨污泥或者膜濃縮液排出。Cu2+在大部分的豬場廢水中也存在，其中在沼液中的含量為2.23 mg·L-1左右。從重金屬的角度來看，Zn2+和Cu2+在豬場廢水中含量較高，有可能成為ANR顆粒污泥脫氮抑制因子。盡管Zn2+在豬場廢水中的濃度大于Cu2+,但是，據Kimura[32]等人的研究，當鋅離子的添加量達到10 mg·L-1時，厭氧氨氧化活性僅下降14%，Zn2+的半抑制濃度為12.5 mg·L-1，而同實驗中，Cu2+的半抑制濃度為6.50 mg·L-1。這表明ANR工藝的主要功能菌群厭氧氨氧化細菌對Cu2+比對Zn2+要更加敏感。據以上分析，重金屬離子中Cu2+成為導致ANR顆粒污泥抑制因子的可能性更高。

表2 20個豬場廢水樣品中重金屬含量

2.3 豬場廢水中戊二醛含量的檢測

受非洲豬瘟的影響，各豬場均加大了消毒劑的使用量，而戊二醛是主要豬場消毒劑。為探究豬場廢水中戊二醛殘余含量的存在情況，本研究利用質譜法檢測了簡陽某豬場原水和沼液中戊二醛的含量。結果表明(見圖1～圖3)，在豬場廢水的原水和沼液中均可以成功檢測到戊二醛及其中間代謝產物戊二醇和戊二酸。由于戊二醛在好氧條件下易被氧化為戊二酸；在厭氧條件下，易被還原為1,5-戊二醇[33]；因此，在本研究的質譜峰中除了能找到小部分戊二醛的特征峰，還能找到較多戊二醇和戊二酸的特征峰?？梢姡捎诖罅课於┫緞┑氖褂?，導致在豬場廢水及沼液中仍可檢出戊二醛，但是其以本體形式單獨存在的比例較小，大部分都在厭氧消化階段還原為戊二醇或在好氧階段氧化為戊二酸，盡管如此，已有研究表明，低濃度的戊二醛仍對水體微生物存在顯著抑制，可使細菌活菌數(shù)下降97.5%[33]；因此戊二醛仍有可能是ANR顆粒污泥的抑制因子之一。

圖1 戊二醛標品品質譜圖

圖2 簡陽某豬場原水樣品質譜圖

圖3 簡陽某豬場沼液樣品質譜圖

2.4 有機物對ANR顆粒污泥中主要脫氮功能菌群活性的影響

本研究進行了有機物對Anammox和AOM活性影響的試驗，結果如圖4和圖5所示。結果表明，Anammox細菌的活性隨有機物濃度(以COD計)的上升而上升，當COD濃度由0逐漸升至2160 mg·L-1時，Anammox細菌活性也隨之由0.27 gN·g-1VSS·d-1升至0.38 gN·g-1VSS·d-1(升高約40%)；AOM活性卻隨著COD濃度的增加而逐漸降低，當添加540 mg·L-1COD時，AOM活性迅速由0.81 gN·g-1VSS·d-1下降至0.63 gN·g-1VSS·d-1，下降約22%；當添加2160 mg·L-1的COD時，AOM活性下降至0.52 gN·g-1VSS·d-1，下降約36%?？梢姡i場廢水厭氧消化液中，高濃度有機物可能會抑制AOM的活性，從而致使ANR脫氮效率的顯著降低。

圖4 有機物對ANR顆粒污泥中Anammox活性的影響

圖5 有機物對ANR顆粒污泥中AOM活性的影響

許多研究者都開展了有機物濃度對Anammox細菌活性影響的研究。一些研究表明，高濃度的有機物會抑制Anammox細菌的活性。例如Tang[34]等人的研究表明，當添加800 mg·L-1COD的有機物后，比厭氧氨氧化活性則從0.27 gN·g-1VSS·d-1下降至0.07 gN·g-1VSS·d-1，下降了74.1%；Ni[9]等人的研究表明，當添加400 mg·L-1COD有機物后，厭氧氨氧化反應器的氨氮去除率從97.9%±0.8%下降至71%±0.7%；Zhu[35]等人的研究表明，當添加240 mg·L-1COD蛋白胨后，比厭氧氨氧化活性從0.45 gN·g-1VSS·d-1下降至0.23 gN·g-1VSS·d-1，下降約50%。而本研究的結果卻表明，高濃度的有機物不僅不會抑制Anammox的活性，反而有助于Anammox細菌對氮素的脫除。反硝化細菌等其他菌群對底物亞硝酸鹽和生態(tài)位的競爭，以及有機物代謝途徑對氨和亞硝酸鹽代謝途徑的競爭是導致有機物影響Anammox活性的主要原因[21]。值得注意的是，本研究所采用的比厭氧氨氧化活性分析的是短期影響，無法分析有機物對Anammox活性的長期影響，因此，在未來的研究中，可通過反應器的運行進一步分析有機物對Anammox細菌的長期影響。

2.5 銅離子對ANR顆粒污泥中主要脫氮功能菌群活性的影響

本研究試驗了不同銅離子濃度對Anammox和AOM活性的影響，結果如圖6～圖7所示。結果表明，當Cu2+濃度逐增加到2.5 mg·L-1時，Anammox活性由0.32 gN·g-1VSS·d-1逐漸降低到0.28 gN·g-1VSS·d-1，下降了30%；當Cu2+濃度逐漸增加到5 mg·L-1時，AOM活性由0.83 gN·g-1VSS·d-1略微上升至1.01 gN·g-1VSS·d-1，上升了21.7%；當Cu2+濃度繼續(xù)由5 mg·L-1逐漸增加到50 mg·L-1時，AOM活性被明顯抑制，下降至0.54 gN·g-1VSS·d-1，下降了46.5%。由以上分析可以發(fā)現(xiàn)，Cu2+對Anammox活性有明顯的抑制作用，而Cu2+對AOM在低濃度條件下無抑制作用，只有當Cu2+濃度高達20 mg·L-1時才顯示出明顯的抑制。但是在前文20個不同豬場廢水樣品的檢測中，我們發(fā)現(xiàn)Cu2+在豬場廢水中的濃度為0～11.3 mg·L-1，均在20 mg·L-1以下水平，濃度較低，對AOM活性影響有限。此外，根據Zhang[36]等的研究認為，在細胞外Cu2+濃度過量的情況下，厭氧氨氧化細菌將主動運輸Cu2+進入細胞內，使得細胞內Cu2+濃度升高。因為過量Cu2+對聯(lián)氨脫氫酶(HDH)的抑制作用，使得HDH底物—聯(lián)氨在細胞內累積。這不僅將造成細胞合成ATP所需的電子短缺，而且因為聯(lián)氨的強還原性，細胞內損傷將會加劇。綜上，豬場廢水中，Cu2+是ANR顆粒污泥中主要脫氮微生物的抑制因子之一。

圖6 銅離子對ANR顆粒污泥中Anammox活性的影響

圖7 銅離子對ANR顆粒污泥中AOM活性的影響

2.6 戊二醛對ANR顆粒污泥活性和形態(tài)的影響

本研究還探究了戊二醛對ANR顆粒污泥中主要脫氮功能菌群活性和形態(tài)的影響。結果表明，戊二醛對ANR顆粒污泥中的AOM，Anammox和DB活性均有較大抑制作用，但由于ANR顆粒污泥中NOB活性極低，因此戊二醛對NOB活性影響趨勢不明顯(見圖8～圖11)。當戊二醛濃度為10 mg·L-1時，AOM，Anammox和DB活性分別下降了35%，11%和34%；當戊二醛濃度提升至50 mg·L-1時，AOM，Anammox和DB活性分別下降87%，71%和80%。戊二醛可使細胞外表面的蛋白質和脂質交聯(lián)[37-39]，導致微生物細胞中的酶蛋白失活，從而使得ANR顆粒污泥主要功能微生物的生長代謝發(fā)生障礙，抑制微生物脫氮產能等過程。

圖8 戊二醛處理對ANR顆粒污泥中AOM活性的影響

圖9 戊二醛處理對ANR顆粒污泥中Anammox活性的影響

圖10 戊二醛處理對ANR顆粒污泥中NOB活性的影響

圖11 戊二醛處理對ANR顆粒污泥中DB活性的影響

本研究進一步探究了戊二醛對ANR顆粒污泥形態(tài)特性的影響，結果表明，戊二醛可使ANR顆粒污泥粒徑逐漸變小，且戊二醛濃度越高，粒徑越小(見圖12)，當戊二醛濃度為10 mg·L-1時，可使ANR顆粒污泥的體積平均粒徑(VMD)和表面積平均粒徑(SMD)分別降低10%和30%；當戊二醛濃度為50 mg·L-1時，可使VMD和SMD分別降低31%和61%。同時，處理過程中，隨著ANR顆粒污泥的解聚，培養(yǎng)液中的多糖含量也隨戊二醛濃度增加而增加，當戊二醛濃度為50 mg·L-1時，培養(yǎng)液中的游離多糖含量由3.3 mg·L-1增加至11.4 mg·L-1，增加了3.5倍。眾所周知，胞外多聚物(EPS)在ANR顆粒污泥的聚集中發(fā)揮著重要作用，EPS能夠將細菌與其他細菌連接成一個聚集體，從而促進生物膜的形成[40]，而EPS主要由胞外蛋白和胞外多糖組成。總之，戊二醛不僅能夠抑制ANR顆粒污泥的主要功能微生物活性，還可使ANR顆粒污泥中的多糖不斷溶出至培養(yǎng)液中，從而導致顆粒的解聚和粒徑的減小。

圖12 不同濃度戊二醛處理ANR顆粒污泥48 h后粒徑對比

3 結論

(2)有機物可顯著抑制ANR顆粒污泥中主要功能菌群—好氧氨氧化菌(AOM)的活性。

(3)Cu2+對ANR顆粒污泥中AOM活性影響有限，對厭氧氨氧化細菌活性有明顯的抑制影響。

圖13 不同濃度戊二醛處理ANR顆粒污泥48 h后上清液多糖含量

(3)戊二醛對ANR顆粒污泥中AOM，Anammox，DB等脫氮微生物活性均有較強的抑制作用，且可使ANR顆粒污泥中起重要團聚作用的胞外多糖不斷向環(huán)境中溶出，從而使得ANR顆粒污泥的穩(wěn)定性降低，脫氮性能變差。