烏鳳章 王賀新

（大連大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，大連 116622）

低溫影響植物生長發(fā)育，限制植物地理分布，降低作物產(chǎn)量。因此，為了維持農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，了解植物低溫度脅迫反應(yīng)的機制是很重要的［1］。低溫脅迫可分為冷脅迫（0-15℃）和冰凍脅迫（<0℃）［2］。冷脅迫使膜硬化，破壞蛋白質(zhì)復(fù)合物，損害光合結(jié)構(gòu)，而冰凍脅迫會對植物造成更嚴(yán)重的損傷。冰凍溫度促進植物組織原生質(zhì)體（細胞間空間）中冰晶的形 成。細胞間冰晶的積累在物理上破壞了細胞膜，導(dǎo)致細胞外水勢下降及嚴(yán)重的細胞脫水［3-4］。低溫鍛煉是溫帶植物暴露于低溫但非冰凍溫度下獲得抗凍性的過程。如溫帶樹木、冬小麥（Triticum aestivum L.）、黑麥（Secalece reale L.）等已經(jīng)進化出復(fù)雜的低溫鍛煉機制，從而提高其抗凍性［5-6］。

在低溫脅迫下，植物通過Ca2+內(nèi)流通道等感受器感知低溫信號［7］，引起胞質(zhì)游離Ca2+的迅速上升，隨后通過磷酸化和轉(zhuǎn)錄級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致植物轉(zhuǎn)錄組的大量重新編程。因此，發(fā)生了一系列的細胞調(diào)整，如光合保護機制、保護細胞膜和其他細胞結(jié)構(gòu)免受冷誘導(dǎo)的活性氧和脫水的影響等［8］。許多蛋白質(zhì)已被確定為低溫脅迫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子或功能因子［9］。低溫脅迫反應(yīng)非常復(fù)雜，在所有層面都受到嚴(yán)格的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后水平［10］。目前，關(guān)于低溫脅迫反應(yīng)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控已有報道，但有關(guān)這種反應(yīng)的翻譯和翻譯后調(diào)控的數(shù)據(jù)相當(dāng)缺乏。本文回顧和討論了有關(guān)調(diào)節(jié)植物低溫脅迫反應(yīng)的泛素化修飾的分子機制，尤其是泛素連接酶（ubiquitin-ligase enzymes，E3）參與植物低溫脅迫反應(yīng)的調(diào)節(jié)機制。

1 泛素化體系

泛素化體系包括泛素、泛素激活酶（ubiquitinactivating enzyme，E1）、泛 素 結(jié) 合 酶（ubiquitinconjugating enzymes，E2）、E3、完整的26S蛋白酶體。泛素化修飾是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，參與蛋白酶體降解、細胞周期進展、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等細胞過程。

1.1 泛素

泛素是由76個氨基酸組成的多肽，通過共價鍵與靶蛋白的賴氨酸殘基連接，這一過程稱為泛素化。泛素化影響靶蛋白活性、豐度、運輸或定位。在一系列酶的催化下，單個泛素分子以其C-末端賴氨酸與靶蛋白的1個賴氨酸側(cè)鏈相連實現(xiàn)單泛素化，或與多個賴氨酸殘基相連實現(xiàn)多泛素化，然后，其他泛素分子的賴氨酸與先前結(jié)合泛素分子的賴氨酸殘基連接，實現(xiàn)多聚泛素化。由于泛素分子可以與上一個泛素分子的7個賴氨酸的任意一個連接，多聚泛素鏈能夠形成不同的拓撲結(jié)構(gòu)，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位連接的泛素鏈形式［11］。結(jié)合在底物蛋白上的泛素鏈形式一定程度上決定了被修飾蛋白的命運。例如，K63位連接的泛素鏈修飾和單泛素化修飾可能參與DNA修復(fù)和細胞內(nèi)吞作用［12］，與48位連接的多聚泛素鏈?zhǔn)墙到庑揎椀鞍椎男盘枺?3］。

1.2 泛素化相關(guān)酶

泛素化體系包含的3個主要的酶在泛素化過程中依次行使它們的功能。E1激活泛素分子，并把激活的泛素連接到E2上。E3直接或間接地把泛素從E2轉(zhuǎn)移到底物蛋白的賴氨酸殘基上。此外，半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等殘基也可被泛素修飾［14］。26S蛋白酶體識別泛素化的蛋白，由去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）將泛素鏈從底物蛋白上移除并供循環(huán)利用，去泛素化的蛋白進一步被26S蛋白酶體中的蛋白酶降解［15］。不同物種的E1數(shù)量不同，小麥中至少有3種，擬南芥中至少有2種。在擬南芥蛋白質(zhì)組中檢測到至少37個E2，然而，植物E2的具體功能尚不清楚。在擬南芥基因組中有1 400多個基因編碼E3。重要的是，E3決定蛋白質(zhì)泛素化的特異性，它以時間和空間調(diào)節(jié)的方式特異性地識別和結(jié)合底物，不僅有助于細胞蛋白質(zhì)組的可塑性，而且還能調(diào)節(jié)植物對低溫等環(huán)境信號的反應(yīng)［16］。

根據(jù)存在的特征結(jié)構(gòu)域和泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白的機制將E3分為3種主要類型，即同源E6.-AP相關(guān)蛋白質(zhì)羧基末端（homologous to the E6-AP carboxyl terminus，HECT）、真正有趣的新基因（really interesting new gene，RING）和RING之間指狀蛋白質(zhì)（RING-between RING-RING，RBR）類 型E3或E3復(fù)合體［17］。

HECT類型E3的C端包含一個由350個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域，稱為HECT結(jié)構(gòu)域。HECT結(jié)構(gòu)域N端與泛素化的E2相互作用，C端含有催化作用的半胱氨酸，以雙葉形結(jié)構(gòu)為特征。2個葉由1個靈活的鉸鏈連接，便于在泛素轉(zhuǎn)移過程中葉的相對方向發(fā)生變化。HECT類型E3先將泛素轉(zhuǎn)移到E3起催化作用的半胱氨酸上，然后從E3轉(zhuǎn)移到底物。底物特異性由HECT E3的N端決定。

RING類型E3又分為單亞基E3和多亞基E3復(fù)合體。單亞基類型包括含有RING和含有U-box結(jié)構(gòu)域的RING型E3。多亞基組的Cullin-RING泛素連接酶（Cullin-RING ubiquitin ligases，CRLs）包括4個亞家族：S期激酶相關(guān)蛋白1-淘汰素-F盒（S phase kinase-associated protein1-Cullin 1-F-box，SCF）、含Bric-a-brac、Tramtrack及Broad 復(fù) 合 體結(jié)構(gòu)域蛋白（Bric-a-brac-tramtrack-broad complex，BTB）、DNA損 傷 結(jié) 合 蛋 白（DNA damage-binding domain-containing，DDB）和后期促進復(fù)合物（anaphase-promoting complex，APC）。

RING類型E3含有結(jié)合2個鋅離子的RING結(jié)構(gòu)域，負責(zé)結(jié)合泛素化的E2和刺激泛素轉(zhuǎn)移。RING類型E3作為支架，使裝載泛素的E2靶向底物蛋白，介導(dǎo)泛素直接轉(zhuǎn)移到底物。已知水稻和擬南芥分別含有至少425個和477個RING結(jié)構(gòu)域蛋白。

U-box型E3酶具有保守的約70個氨基酸U-box基序。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，U-box是一個修飾的RING指結(jié)構(gòu)域，缺乏典型環(huán)結(jié)構(gòu)域中保守的支架、鋅螯合半胱氨酸和組氨酸殘基，利用氫鍵和鹽橋來穩(wěn)定這個部位構(gòu)象，使得U-box結(jié)構(gòu)比RING-finger更保守和穩(wěn)定。在擬南芥中，約有64個U-box型E3基因已經(jīng)被鑒定。這些U-box蛋白除與熱休克蛋白70 C末端相互作用蛋白（carboxyl terminus of hsc70-interacting protein，CHIP）外，分別用序列號被系統(tǒng)地命名為植物U-box蛋白（plant U-box，PUB）。研究表明不同植物物種PUB參與許多非生物脅迫反應(yīng)。與HECT類型E3連接酶不同，RING類型E3和U-box類型E3直接介導(dǎo)泛素從E2-Ub轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白上。

一些RING類型E3由多個亞基組成，如CRLs E3。CRLs E3是一類高度多樣化的泛素連接酶，它們組裝在Cullin支架上，在N端結(jié)合RING蛋白，用于招募E2，在C端結(jié)合適配器蛋白和底物受體（負責(zé)底物特異性）［18］。CRLs E3可進一步分為SCF、BTB、DDB 3種亞型。SCF亞型E3由（Arabidopsis SKP1-like proteins，ASK1）、CUL1/2（Cullin1/2）、RBX1（RING-Box 1）和FBX（F-box）蛋白組成，以ASK1作為適配器，F(xiàn)-box作為底物受體。FBX蛋白決定底物特異性。BTB亞型E3連接酶由Cul3（Cullin3）、Rbx1和BTB（含BTB結(jié)構(gòu)域）蛋白組成。其中，BTB蛋白具有底物特異性。DDB亞型E3連接酶由CUL4（Cullin 4）、RBX1、DDB1（DNA damage-binding 1） 和DWD（WD40 domaincontaining protein）組成。CRL4利用DDB1作為適配器，DWD/DCAF作為底物受體組裝成E3復(fù)合物，DWD蛋白負責(zé)底物的特異性識別［16］。在擬南芥蛋白質(zhì)組中大約有82個DWD蛋白。DDB1與不同的DWDs相互作用的能力對于這些E3復(fù)合物的不同功能是必不可少的［19］。另一個重要的多亞基E3是后期促進復(fù)合物/細胞周期體（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C），它由19個亞基組成，包括一個RING亞基（APC11）和一個類似Cullin的亞基（APC2）。

RBR類型E3由2個RING結(jié)構(gòu)域（RING1和RING2）以及中間半胱氨酸富集區(qū)（in-between-RING，IBR）結(jié)構(gòu)域組成。RBR類型E3的RING1負責(zé)招募泛素分子連接的E2中間體，而含有活性半胱氨酸的RING2結(jié)合泛素分子并將其轉(zhuǎn)移給底物。RBR類型E3包含特定的其他結(jié)構(gòu)域，其中一些結(jié)構(gòu)域參與分子內(nèi)相互作用，使蛋白質(zhì)處于自抑制狀態(tài)。自抑制通過磷酸化或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等機制而被解除［17］。

1.3 26S蛋白酶體

26S蛋白酶體是分布在細胞質(zhì)與細胞核中的蛋白酶復(fù)合體，由20S核心顆粒（core protease，CP）和19S調(diào)節(jié)顆粒（regulatory particle，RP）組成。CP呈明顯中空的圓柱形狀，由4個堆積環(huán)裝配而成，每個環(huán)含有7個多肽，它以不依賴于ATP和泛素的方式行使蛋白水解酶功能，將底物蛋白降解成小肽或游離的氨基酸。RP結(jié)合到CP兩端，形成26S蛋白酶體，它依賴于ATP水解提供的能量，將已結(jié)合泛素的目標(biāo)蛋白遞送到蛋白酶體進行降解［20］。

2 蛋白質(zhì)泛素化介導(dǎo)的低溫脅迫反應(yīng)

2.1 蛋白質(zhì)泛素化介導(dǎo)的CBF依賴型低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

脫水響應(yīng)元件結(jié)合因子（dehydration-responsiveelement-binding1，DREB1）/胞嘧啶重復(fù)結(jié)合因子（C-repeat binding factor，CBF）轉(zhuǎn)錄因子在植物低溫脅迫響應(yīng)中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。通過結(jié)合冷調(diào)節(jié)（cold regulated，COR）、低溫誘導(dǎo)（low-temperature induced，LTI）、脫水蛋白（dehydrin，DHN）以及脫水響應(yīng)（responsive to dehydration，RD）基因啟動子區(qū)域的DRE/CRT順式作用元件，激活這些基因表達，提高植物抗凍性。有10%-15%的COR基因受到CBFs的調(diào)控［21］。擬南芥CBF表達的誘導(dǎo)物1（inducer of CBF expression 1，ICE1）為bHLH轉(zhuǎn)錄因子，能與CBFs啟動子區(qū)域的E-Box特異地結(jié)合而激活CBFs，從而調(diào)控下游目標(biāo)基因的表達，提高植株抗凍性。ICE1蛋白的轉(zhuǎn)錄激活作用受到蛋白質(zhì)翻譯后修飾的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控。擬南芥中RING類型E3滲透響應(yīng)高表達基因1（high expression of osmotically responsive gene 1，HOS1）與ICE1相互作用并使之泛素化。HOS1過表達降低了擬南芥對寒冷氣候的忍耐能力［22］（表1和圖1）。ICE1中S403被丙氨酸取代的重組ICE1與野生型蛋白相比，冷處理后積聚更多的ICE1蛋白，誘導(dǎo)更多的CBF和COR表達。此外，在重組ICE1蛋白中多聚泛素化被中斷［23］。由此推斷ICE1的絲氨酸403是控制HOS1介導(dǎo)的ICE1降解的關(guān)鍵殘基之一。有趣的是，植物中的ICE1穩(wěn)定性以HOS1依賴的方式響應(yīng)低溫而降低［22］。因此，可以認(rèn)為HOS1參與了擬南芥低溫脅迫反應(yīng)的負反饋調(diào)節(jié)，在低溫反應(yīng)開始后介導(dǎo)了ICE1的降解。

圖1 蛋白質(zhì)泛素化修飾調(diào)節(jié)CBF依賴的低溫信號途徑 Fig. 1 Protein ubiquitination regulates the CBF-dependent low temperature signaling pathway

表1 參與植物低溫脅迫反應(yīng)的E3連接酶的一般性功能描述Table 1 General functional descriptions of the E3 ligases involved low temperature stress responses in plant

氣孔開放因子（open stomata 1，OST1）是一種絲氨酸/蘇氨酸R蛋白激酶，其突變體導(dǎo)致CBF轉(zhuǎn)錄因子的激活缺陷，從而降低了抗凍性。過表達OST1則誘導(dǎo)CBF轉(zhuǎn)錄因子積聚從而提高抗凍能力。OST1介導(dǎo)的ICE1磷酸化，抑制HOS1和ICE1的相互作用［24-25］，因而維持ICE1蛋白穩(wěn)定性，提高ICE1轉(zhuǎn)錄活性，從而激活I(lǐng)CE1-CBF-COR低溫信號通路［24］。在冷處理時，含SAP和myc基因相互作用鋅指蛋白1結(jié)構(gòu)域連接酶（SAP and MIZ1，SIZ1）能夠介導(dǎo)ICE1發(fā)生SUMO化修飾。SUMO化的ICE1降低了與HOS1相互作用的能力，減弱了ICE1泛素化程度［26］。因此SIZ1是ICE1的正向調(diào)節(jié)因子，在低溫信號的早期起著穩(wěn)定ICE1蛋白的作用，也就是說SIZ1依賴的ICE1 SUMO化阻止其蛋白酶體介導(dǎo)的降解，并使CBF依賴的低溫鍛煉成為可能。此外，在持續(xù)低溫脅迫下，蛋白激酶油菜素內(nèi)酯非敏感基因2（brassinosteroid insensitive2，BIN2）的活性逐漸升高，與ICE1相互作用并使其磷酸化，促進ICE1與HOS1的相互作用，從而促進ICE1降解［27］。

研究表明，CBF蛋白也可以通過泛素介導(dǎo)的蛋白酶體途徑降解［28］，但導(dǎo)致其泛素化并隨后降解的E3連接酶尚未被鑒定。在寒冷脅迫下，冷響應(yīng)蛋白激酶（cold-responsive protein kinase1，CRPK1）磷酸化14-3-3蛋白并觸發(fā)其從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞核。在細胞核14-3-3蛋白與CBF1/3蛋白相互作用并使其失穩(wěn)，從而減弱CBF途徑，防止過度發(fā)生寒冷脅迫反應(yīng)［28］。

通過對E3 T-DNA插入突變體庫的篩選發(fā)現(xiàn)，U-box E3 PUB25/26參與植物低溫脅迫反應(yīng)。雙突變體pub25 pub26中，CBFs受冷誘導(dǎo)水平明顯低于野生型，植株表現(xiàn)出冰凍敏感表型。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PUB25/26與冷脅迫信號負調(diào)節(jié)因子MYB15相互作用，并參與在低溫處理早期MYB15的降解過程，從而提高植物抗凍性。同時，確定了PUB25/26的T95/T94位點是蛋白激酶OST1的作用位點。低溫激活OST1激酶活性，激活的OST1磷酸化PUB25/26，增強PUB25/26的E3活性，促進其對MYB15蛋白的泛素化降解，從而正調(diào)控低溫下CBFs的誘導(dǎo)表達和植物抗凍性［29］。

光敏色素相互作用因子（phytochrome-interacting factor 3，PIF3）是抑制光形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它在介導(dǎo)植物對各種環(huán)境信號的反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。PIF3通過直接與CBF基因的啟動子結(jié)合來下調(diào)其表達，作為擬南芥抗凍性的負調(diào)節(jié)因子。EIN3結(jié)合F結(jié)構(gòu)域蛋白（EIN3-binding f-box 1，EBF1）和EBF2（EIN3-binding f-box 2，EBF2）直接靶向PIF3進行26S蛋白酶體介導(dǎo)的降解。與野生型相比，ebf1和ebf2突變體對冷凍脅迫更敏感，pif3突變抑制了ebf1的冰凍敏感性表型。此外，寒冷處理促進了EBF1和EBF2的降解，提高了PIF3蛋白的穩(wěn)定性，從而降低了CBF基因的表達水平［30］。

An等［31］研究表明蘋果MYB30相互作用連 接 酶（MYB30-INTERACTING E3 LIGASE 1，MdMIEL1）與轉(zhuǎn)錄因子MdMYB308L互作，促進MdMYB308L的泛素化降解，從而負調(diào)控蘋果的抗寒性和花色苷積累。MdMYB308L在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上響應(yīng)低溫處理，正調(diào)控低溫脅迫反應(yīng)和花色苷合成。MdMYB308L通過與MdbHLH33直接互作，增強MdbHLH33對MdCBF2和MdDFR的轉(zhuǎn)錄活性，進而提高植物低溫脅迫抗性和花色苷積累水平［31］。

與擬南芥HOS1的作用相似，香蕉RING類型E3 MaSINA1與轉(zhuǎn)錄因子MaICE1相互作用并使之泛素化，導(dǎo)致MaICE1的降解和其轉(zhuǎn)錄活性的衰減，負調(diào)控香蕉果實的冷脅迫反應(yīng)［32］。

2.2 蛋白質(zhì)泛素化介導(dǎo)的CBF非依賴型低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

HY5是擬南芥中的BZIP轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)節(jié)包括光形態(tài)發(fā)生、激素反應(yīng)和抗凍性等關(guān)鍵過程［33-34］。HY5的表達受不依賴于CBF和ABA途徑的低溫誘導(dǎo)。低溫引起CRLs E3 中CUL4-DDB1亞類COP1的核耗竭而穩(wěn)定HY5蛋白，從而誘導(dǎo)花色苷合成，抑制ROS積累，在低溫脅迫反應(yīng)中起作用［34］。

3 蛋白質(zhì)泛素化介導(dǎo)激素信號通路調(diào)控低溫脅迫反應(yīng)

3.1 蛋白質(zhì)泛素化介導(dǎo)乙烯合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物抗凍性

低溫脅迫會改變植物許多物種的內(nèi)源乙烯水平。增強的乙烯水平和抗凍性之間存在關(guān)聯(lián)［35-36］。乙烯正影響番茄（Solanum lycopersicum cv Lichun）和煙草（Nicotiana tabacum cv NC89）的抗凍性［37-38］。 用乙烯生物合成抑制劑2-氨基乙氧基甘氨酸（Aminoethoxy vinyl glycine，AVG）處理蒺藜苜蓿A17（Medicago truncatula cv Jemalong A17）［36］、狗牙根屬（Cynodon spp.）植物［39］和擬南芥［40］，提高了它們的抗凍能力，表明乙烯負影響這幾種植物抗凍性。可見，乙烯對植物抗凍性的影響可能與物種對寒冷的敏感性和受脅迫時植物發(fā)育階段有關(guān)。此外，也有研究表明乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic，ACC）的應(yīng)用提高了在土壤中生長的擬南芥幼苗抗凍性［35］，而乙烯對在裝有MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中生長的擬南芥幼苗抗凍性具有負影響［40］。兩種試驗條件下結(jié)果的差異可能與環(huán)境相對濕度有關(guān)。Janowiak等［41］認(rèn)為在相對濕度較高的環(huán)境下，乙烯對植物抗凍性具有負影響。

3.1.1 蛋白質(zhì)泛素化介導(dǎo)乙烯的生物合成 乙烯生物合成途徑首先是由甲硫氨酸（methionine，Met）合成S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine，SAM），SAM在ACC合成酶（ACC synthase，ACS）的作用下合成ACC，這是乙烯合成的重要限速步驟，最后ACC在ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）作用下生成乙烯［42］。乙烯過量表達突變體（ethylene overproducer 1，ETO1）是 一 種BTB蛋 白，作 為CUL3a/b E3連接酶復(fù)合物的底物招募成分［43-44］。ETO1以及ETO1的同源蛋白EOL1（ETO1-like）和EOL2與2型ACS發(fā)生物理作用，并通過促進ACS的降解而負調(diào)控乙烯的生物合成［44-45］。由于eto1-3突變體產(chǎn)生截斷ETO1蛋白質(zhì)，不能靶向ACS5用于蛋白酶體降解，因此引起變異植物中乙烯的增加［44］。在土壤上生長的擬南芥eto1-3突變體提高了CBF1/2/3轉(zhuǎn)錄水平而使植株具有更強的抗凍性［46］。表明乙烯通過控制CBF基因表達來正調(diào)控抗凍性，而ETO1通過負調(diào)控ACS水平而影響植物的抗凍性。

3.1.2 蛋白質(zhì)泛素化介導(dǎo)乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 在擬南芥中，乙烯由5個位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的乙烯受體1（ethylene response1，ETR1）、ETR2、乙烯傳感蛋白（ethylene response sensor1，ERS1）、ERS2和乙烯不敏感4（ethylene insensitive4，EIN4）感知。乙烯受體和激酶組成型三重反應(yīng)突變體（constitutive triple response1，CTR1）都是乙烯信號途徑中的抑制因子；乙烯不敏感2（ethylene insensitive2，EIN2）是跨膜蛋白；EIN3和EIL1（EIN3-LIKE1）蛋白存在于細胞核中，是乙烯信號途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們可以調(diào)節(jié)屬于WRKY、AP2/ERF和NAC轉(zhuǎn)錄因子基因家族的轉(zhuǎn)錄因子。在乙烯不存在的情況時，受體處于活化狀態(tài)，激活CTR1。CTR1磷酸化同樣位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白EIN2的C端結(jié)構(gòu)域。磷酸化后的EIN2 C端結(jié)構(gòu)域可以被F-box蛋白ETP1/2（EIN2 TARGETING PROTEIN1/2）識別并進入蛋白酶體降解［47-48］。EIN 3/EIL1被EBF 1/2這兩個F-box蛋白降解，從而抑制乙烯反應(yīng)。當(dāng)乙烯存在時，乙烯與受體ETR1二聚體結(jié)合，并使其失活，從而導(dǎo)致CTR1失活。CTR1對EIN2的磷酸化被抑制，EIN2被激活。一部分EIN2進入細胞核，通過有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen activated protein kinase kinase kinase，MAPK3）對EIN3/EIL1磷酸化來抑制EBF1和EBF2介導(dǎo)的EIN3/EIL1的降解，直接或間接的激活或穩(wěn)定EIN3/EIL1蛋白［49-50］。EIN3lEIL 1形成二聚體激活乙烯下游響應(yīng)基因CBF的表達，進而啟動轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)，激活或者抑制抗凍相關(guān)基因的表達（圖2和表1）。

圖2 E3s參與乙烯途徑調(diào)控擬南芥抗凍性示意圖Fig. 2 Schematic diagram depicts the involvement of E3s in regulation of freezing stress tolerance by the ethylene（ET）pathway in Arabidopsis

在擬南芥中，低溫脅迫條件下，EBF1蛋白以依賴EIN2的方式被降解，EIN3水平增加［40］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，EIN3蛋白能夠與CBFs基因和A型ARR基因的啟動子區(qū)特定元件相結(jié)合，負調(diào)控CBFs基因和ARR基因表達，從而降低擬南芥抗凍性［40］，這表明E3連接酶EBF正調(diào)控擬南芥的抗凍性。

3.2 蛋白質(zhì)泛素化介導(dǎo)茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

冷脅迫誘導(dǎo)茉莉酸（jasmonates，JA）生物合成基因（如擬南芥LOX1、AOS1和AOC1和JAR1［51］和水稻OsAOS、OsOPR1、OsAOC和OsLOX［52］）的表 達，迅速提高這些植物內(nèi)生JA水平。外源JA處理提高了擬南芥抗凍性。與野生型植物相比，擬南芥缺乏JA生物合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體（如lox2、aos、jar1和coi1）對冰凍脅迫的敏感性增加［51］。這些研究表明JA正調(diào)控植物抗凍性［53］。擬南芥茉莉酮酸酯ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白JAZ（jasmonate zim-domain）是抗凍性調(diào)節(jié)因子［51］。在非低溫脅迫條件下，JAZ1和JAZ4蛋白與ICE1和ICE2相互作用，抑制后者轉(zhuǎn)錄活性，阻止非特異性的寒冷脅迫反應(yīng)的激活［51］。在寒冷脅迫下，JA水平增加，觸發(fā)F-box E3 COI1介導(dǎo)的JAZ降解，使ICEs從抑制中釋放出來。然后，ICE1和ICE2通過與CBFs基因啟動子中DRE/CRT序列元件結(jié)合來激活CBFs的表達［51，53］。

4 參與低溫脅迫反應(yīng)的功能蛋白的泛素化 修飾

F-box蛋白FBP7是擬南芥多亞基E3 SCF復(fù)合體的組成部分［54］。冷誘導(dǎo)FBP7的表達激活，而FBP7的激活是重新合成冷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)所必需的［54］。已發(fā)現(xiàn)FBP7酵母同源物YLR097c與蛋白翻譯延長因子eEF-2互作，推測它可能影響溫度脅迫后蛋白質(zhì)合成過程。另外，在擬南芥los1-1突變體中冷誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成被抑制的方式與fbp7突變體相同［55］。因此可以推測擬南芥FBP7將與LOS1蛋白（eEF-2的同源物）相互作用，但這種相互作用及其伴隨的泛素化仍有待進一步研究。由于fbp7突變體中LOS1蛋白水平?jīng)]有改變，推測FBP7可能調(diào)節(jié)LOS1活性或亞細胞定位。由于LOS1介導(dǎo)的冷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成是適當(dāng)?shù)睦漶Z化所必需的［54］，可以預(yù)測在冷馴化過程中FBP7通過調(diào)節(jié)LOS1功能而發(fā)揮作用。

辣椒PUB1（Capsicum annuum putative U-box protein 1，CaPUB1）是一種U-box E3，參與非生物脅迫早期抗性反應(yīng)，被非生物脅迫（如干旱、低溫和機械損傷）快速誘導(dǎo)表達［56］。CaPUB1在擬南芥中過表達，減少了CaPUB1底物蛋白RPN6表達量。而RPN6的減少會引起植株生長加速和增強對干旱、鹽脅迫的敏感性［56］。RPN6是26S蛋白酶體19S調(diào)節(jié)顆粒lid亞基復(fù)合物的成員之一，在蛋白質(zhì)底物降解前將泛素鏈從蛋白質(zhì)底物上剪切掉以回收再次利用（去泛素化）。RPN6含有PCI（proteasome-COP9/signalosome-eIF3）模塊，可能在蛋白酶體組裝中起腳手架作用［57］。與在擬南芥中的作用相同的是CaPUB1在水稻中過表達，與野生型植物相比也降低植株抗旱性，但同時冷脅迫誘導(dǎo)標(biāo)記基因DREB1A、DREB1B、DREB1C和細胞色素P450明顯上調(diào)，從而提高植株低溫抗性［58］。這表明CAPUB1既是干旱脅迫響應(yīng)的負調(diào)節(jié)因子，也是轉(zhuǎn)基因水稻冷脅迫響應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子。這也表明CaPUB1可能參與干旱和低溫信號通路的交叉作用。

AtCHIP是存在于擬南芥中的一個CHIP-like蛋白，它含有3個TPRs（tetratricopeptide repeats）和一個U-box結(jié)構(gòu)域，在結(jié)構(gòu)上與動物CHIP蛋白相似［59］。AtCHIP在體外具有E3泛素連接酶活性。在低溫處理條件下，AtCHIP轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，與野生型相比，過表達AtCHIP植株在冷脅迫下生長減慢并發(fā)生嚴(yán)重的膜損傷，對低溫處理的敏感性增強［59］。這些結(jié)果表明AtCHIP在溫度脅迫條件下植物細胞代謝中起重要作用。利用酵母雙雜交技術(shù)鑒定了與AtCHIP發(fā)生物理作用的蛋白之一——蛋白磷酸酶PP2A（protein phosphatase 2A）A3亞基；與野生型植物相比，過表達AtCHIP使PP2A在黑暗或低溫條件下具有更高的活性，這表明AtCHIP對PP2A的泛素化修飾在一定條件下提高了PP2A的活性［60］。因此，過表達AtCHIP植物的低溫敏感表型可能部分是由于PP2A活性的變化所引起。

除了靶向蛋白降解外，E3還可以通過對UPS相關(guān)蛋白的修飾來控制蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)。SAP9是一種20/AN1型鋅指蛋白，參與擬南芥發(fā)育和多種脅迫反應(yīng)的調(diào)控。寒冷等脅迫誘導(dǎo)SAP9的表達［61］。SAP9顯示E3泛素連接酶活性，并與Rad23d相互作用。Rad23d是將泛素化底物轉(zhuǎn)運到蛋白酶體的穿梭因子［61］。SAP9可以促進泛素化底物與RAD23的相互作用，從而保證泛素化底物的降解。

5 總結(jié)與展望

植物對低溫脅迫的抗性涉及生長發(fā)育、生理和生化變化，這些變化限制了植物受損傷程度，并重新建立穩(wěn)態(tài)，促進受損系統(tǒng)的修復(fù)。因此，了解低溫脅迫抗性的調(diào)控機制非常重要。大量研究表明低溫脅迫反應(yīng)需要一組轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用。這些轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫反應(yīng)中的重要功能可能是受翻譯后修飾調(diào)控的，包括泛素化、磷酸化、類泛素化，如ICE1。UPS在植物低溫脅迫反應(yīng)中起著重要作用。除已明確的ICE1、MBY和HY5等轉(zhuǎn)錄因子外，可能有其他的轉(zhuǎn)錄因子通過泛素化修飾調(diào)控植物低溫脅迫反應(yīng)。盡管已經(jīng)明確E3介導(dǎo)的茉莉酸和乙烯等激素信號途徑在調(diào)控植物低溫脅迫反應(yīng)中具有重要作用，但相關(guān)研究還很不足，有待于進一步深入研究。低溫引起細胞代謝的變化，最終實現(xiàn)植物低溫脅迫抗性。其中許多代謝變化受泛素化修飾調(diào)節(jié)。對參與低溫脅迫反應(yīng)的代謝產(chǎn)物合成的蛋白或酶進行泛素化修飾的E3也知之甚少。總之，目前參與植物低溫脅迫反應(yīng)的大量E3仍然是未知的。因此，發(fā)現(xiàn)并鑒定與低溫脅迫反應(yīng)相關(guān)的E3的生物學(xué)功能是一項重要的任務(wù)。此外，E3的功能取決于其靶蛋白的性質(zhì)，也就是說，目標(biāo)蛋白是否是低溫脅迫反應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子或負調(diào)節(jié)因子。因此對單個E3靶蛋白的破譯將有助于理解泛素化的更詳細、更精確的機制。通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了一些植物中低溫誘導(dǎo)了E3的明顯上調(diào)，如篤斯越桔（Vaccinium uligiuosum）的E3泛素蛋白連接酶ARI2［62］，或者通過異位表達葡萄（Vitis amurensis）的VaPUB正調(diào)控擬南芥的低溫脅迫反應(yīng)［63］，但這些E3作用的靶蛋白仍不清楚。

本綜述中描述的泛素化修飾靶蛋白大都是利用傳統(tǒng)的分子方法獲得的單一蛋白。直到最近，還沒有關(guān)于與低溫脅迫反應(yīng)有關(guān)的泛素化修飾的蛋白質(zhì)組全范圍分析的報道。大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析產(chǎn)生的結(jié)果與對低溫脅迫反應(yīng)特定關(guān)鍵效應(yīng)蛋白（或基因）的詳細遺傳學(xué)研究相結(jié)合，可以提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，以闡明控制低溫脅迫反應(yīng)的分子機制。因此，制定相應(yīng)的鑒定方案，準(zhǔn)確地揭示真正的目標(biāo)蛋白是未來的一個巨大挑戰(zhàn)。在研究了單個E3連接酶（包括分析其生物學(xué)功能和底物）之后，構(gòu)建由不同信號通路連接的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對于加深對泛素化在植物低溫脅迫反應(yīng)中的神秘作用的理解至關(guān)重要。對這些問題的回答將有助于深入了解植物低溫脅迫反應(yīng)的泛素化修飾的調(diào)控機制。

生產(chǎn)實踐中，解決農(nóng)作物及林木低溫脅迫的最主要的途徑是開發(fā)并推廣種植抗寒品種。對更多參與低溫脅迫調(diào)控的泛素連接酶的分析及其相互作用蛋白的鑒定將為植物低溫脅迫在翻譯后修飾水平上的調(diào)控研究提供新線索，并最終為構(gòu)建植物低溫脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和培育抗寒農(nóng)作物、林木新品種提供理論依據(jù)。