王 鵬，趙建國，劉 靜

（天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院婦瘤科，天津 300100）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1，2]，早期患者5 年生存率超過95%；然而，晚期患者術(shù)后易復(fù)發(fā)，并伴有陰道、盆腔和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致5 年生存率降至16%～45%[3]。因此，尋找有效的分子標(biāo)志物用于早期診斷和靶向治療對于提高生存率至關(guān)重要。具有表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣和Follistin 樣結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白TMEFF2（transmembrane protein with epidermal growth factor-like and two follistatin-like domains）在包括結(jié)直腸癌、胃癌等在內(nèi)的多種疾病中被證實屬于功能性因子[4]，一方面胞外區(qū)Follistatin 樣功能域，可與轉(zhuǎn)化生長因子-β 家族、血管內(nèi)皮生長因子等結(jié)合，并抑制其受體活化；另一方面胞外區(qū)EGF 樣結(jié)構(gòu)可參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。然而關(guān)于TMEFF2 在婦科癌癥中的研究有限。本研究利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，對TMEFF2 在EC 中的表達(dá)進(jìn)行了客觀分析。并進(jìn)一步收集了大量臨床樣本以確定其表達(dá)及甲基化水平與EC 患者臨床和病理特征的關(guān)系，為尋找有效的生物學(xué)分子靶點提供一定的可靠數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析 本研究中利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）分析腫瘤組織及其相應(yīng)正常組織中的差異基因表達(dá)。該數(shù)據(jù)庫是用于在線分析和挖掘可靠信息的癌癥數(shù)據(jù)庫，可根據(jù)腫瘤分期、腫瘤分級或其他臨床病理特征，分析相關(guān)基因在腫瘤組織和正常組織中的相對表達(dá)量。篩選條件為：腫瘤類型：美國公共癌癥基因數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）-UCES（Uterine Corpus Endometrial Carcinoma）；基因：TMEFF2；分析類型：腫瘤組織vs.正常組織；臨界值設(shè)置：P＜0.05，倍數(shù)變化＞2。最終通過篩選獲得了546 個EC 組織、35 個正常子宮內(nèi)膜組織的TMEFF2 基因表達(dá)的臨床數(shù)據(jù)資料。

1.2 臨床資料 選擇2018 年1 月～2021 年3 月在天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科接受初次手術(shù)的44～74歲的患者，共采集了302 例石蠟包埋的子宮內(nèi)膜標(biāo)本保存于我院病理科。按照病檢結(jié)果分為EC 組117例，包括子宮內(nèi)膜樣腺癌65 例、漿液性癌24 例、黏液性癌19 例、透明細(xì)胞癌6 例、未分化癌和去分化癌3 例；癌前病變組95 例，包括82 例子宮內(nèi)膜非典型性增生、13 例子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤；正常子宮內(nèi)膜組90 例，包括分泌型子宮內(nèi)膜55 例，增生型子宮內(nèi)膜35 例，正常子宮內(nèi)膜樣本來自入院接受診刮或由于子宮良性疾病而接受全子宮切除術(shù)的患者。所有惡性病例均按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）系統(tǒng)（2009）[6]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷、分級和分期。檢測腫瘤分化程度、肌層浸潤深度、雌激素受體（estrogen receptor，ER）和前列腺素孕激素受體（progestrone receptor，PR）的表達(dá)。本研究和所有人類樣本的收集都得到了我院機(jī)構(gòu)倫理委員會的批準(zhǔn)，且所有患者都給予了書面知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)和病理組織學(xué)診斷符合相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；EC 組患者均為原發(fā)性病變；癌前病變及正常子宮內(nèi)膜組均無子宮肌瘤、卵巢巧克力囊腫及其他雌激素依賴性疾??；②術(shù)前未接受過放療、化療、生物免疫治療等；③對于EC患者，包括子宮切除術(shù)和盆腔/腹主動脈旁淋巴結(jié)切除術(shù)。將伴有嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾?。ㄈ绺文I功能嚴(yán)重不全、心力衰竭、急性心肌梗死、腦梗死等）、合并自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病或其他部位原發(fā)惡性腫瘤者排除在本研究之外。EC 組、癌前病變組、正常子宮內(nèi)膜組年齡分別為（56.00±11.16）歲、（54.29±13.92）歲及（55.29±11.38）歲，三組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。由2 位病理學(xué)家對腫瘤組織學(xué)切片進(jìn)行篩選，選擇具有代表性的腫瘤細(xì)胞，并從每個腫瘤標(biāo)本中取出一個直徑2 mm 的組織核，置于新的受體石蠟塊中進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.3 免疫組化法檢測組織TMEFF2 蛋白定位和表達(dá)取子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本連續(xù)切片（約4 μm）。應(yīng)用免疫組化鏈霉親和素-過氧化物酶法檢測TMEFF2 蛋白表達(dá)。將切片經(jīng)二甲苯二次浸潤和乙醇分級浸潤脫蠟再水化后，進(jìn)行抗原微波修復(fù)和內(nèi)源性過氧化物酶阻斷。用10%山羊血清在37 ℃下阻斷載玻片15 min，然后用1∶75 的TMEFF2 抗體（美國Abcam公司）在4 ℃的濕箱中孵育過夜，接著用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二級抗體在37 ℃結(jié)合30min，然后用二氨基聯(lián)苯胺試劑染色，觀察TMEFF2 蛋白表達(dá)。用等體積的PBS 代替TMEFF2 抗體作為陰性對照。根據(jù)Gao LL 等[7]對染色結(jié)果進(jìn)行判讀：染色強(qiáng)度為0、1、2、3 分，分別對應(yīng)無染色、弱染色、中染色、強(qiáng)染色；以陽性細(xì)胞百分比為標(biāo)準(zhǔn)，染色范圍為0、1、2、3、4 分，分別對應(yīng)＜5%、5～25%、26～50%、51～75%、＞75%。以上2 個分?jǐn)?shù)相乘得出最終分?jǐn)?shù)如下：0～2 分（-）、≥3 分為陽性染色。為了控制誤差，將組化圖片由2 位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師獨立觀察。

1.4 組織TMEFF2 基因甲基化水平檢測 采用巢式甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）法檢測組織TMEFF2 基因甲基化水平將石蠟包埋組織在37 ℃放置過夜，隨后浸泡于二甲苯中2 次15 min，然后用一系列乙醇分級脫水。用Qiagen DNA FFPE 組織提取試劑盒分離組織樣本中的DNA。EZ DNA 甲基化試劑盒用于DNA 亞硫酸氫鹽修飾。引物片段5’-GAGTTTAGTTTTTGGATGTTG-3’和5’-TACAACTCTACAACAACAAAC-3’，以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA 樣品（1:250 稀釋）為模板，進(jìn)行MSP：甲基化引物（上游）5’-AAATTTTCGAGATTATGCGC-3’和（下游）5’-CCGAAAAACACAAAATCGCG-3’；非甲基化引物（上游）5’-AAATTTTTGAGATTATGTGT-3’和（下游）5’-CCAAAAAACACAAAATCACA-3’。該反應(yīng)包括在95 ℃初始化10 min，隨后35 個周期循環(huán)（95 ℃變性30 s，57 ℃冷卻59 s，72 ℃延伸30 s）。上述過程使用GeneAmp DNA 擴(kuò)增試劑盒配制25 μl 反應(yīng)體系，在PTC-100 熱循環(huán)儀上完成，CpGenomTM 通用甲基化和非甲基化DNA 作為陽性和陰性對照，將PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，溴化乙錠染色，用紫外成像系統(tǒng)觀察。甲基化或非甲基化PCR 產(chǎn)物中只有一條帶表明兩個等位基因分別為甲基化或非甲基化；同時出現(xiàn)甲基化和非甲基化PCR 產(chǎn)物表明存在部分甲基化。將甲基化或部分甲基化并入甲基化組，否則為非甲基化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析，計量資料以（）表示，計數(shù)資料使用[n（%）]表示。采用單因素方差分析和χ2檢驗評估組間差異。雙側(cè)P＜0.05 時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于TCGA 數(shù)據(jù)庫分析 TMEFF2 在UCEC 組織中的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系原發(fā)性CESC 組織中TMEFF2 表達(dá)低于正常組織[TPM：0.001（0.001，0.036）vs 0.018（0.011，0.059），P＜0.05]，但是基因啟動子甲基化水平高于正常組織[β 值：0.139（0.050，0.320）vs 0.094（0.078，0.109），P＜0.05]。此外，TMEFF2 表達(dá)與UCES 患者無病生存率時間和總生存時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低表達(dá)亞組患者中位無病生存時間和總生存時間均長于高表達(dá)亞組患者，見圖1。

圖1 基于TCGA 數(shù)據(jù)庫挖掘TMEFF2 在UCEC 組織中的表達(dá)情況以及與預(yù)后的關(guān)系

2.2 不同組織中TMEFF2 蛋白表達(dá)和基因甲基化狀態(tài) 經(jīng)免疫組化法和MSP 法分析，TMEFF2 蛋白主要染色于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核也偶有染色。EC組織中TMEFF2 蛋白陽性表達(dá)率低于正常組宮內(nèi)膜組和癌前病變組，同時基因高甲基化率高于正常組宮內(nèi)膜組和癌前病變組（P＜0.05）；另外癌前病變組織中TMEFF2 蛋白陽性表達(dá)率亦高于正常子宮內(nèi)膜組，且基因啟動子甲基化率低于正常子宮內(nèi)膜組（P＜0.05），見表1、圖2、圖3。

表1 不同組織中TMEFF2 表達(dá)和甲基化狀態(tài)比較[n（%）]

圖2 免疫組化法分析TMEFF2 蛋白在各組織中的典型表達(dá)情況（×400）

圖3 MSP 法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測TMEFF2 基因甲基化狀態(tài)

2.3 EC 患者組織中TMEFF2 基因啟動子甲基化狀態(tài)與TMEFF2 蛋白表達(dá)的關(guān)系 81 例TMEFF2 基因高甲基化組織中TMEFF2 蛋白陽性表達(dá)率低于非甲基化組織[4.94%（4/81）vs 83.33%（30/36）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=74.299，P＜0.05）。

2.4 EC 患者組織TMEFF2 基因甲基化狀態(tài)、蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 EC 組織中TMEFF2基因高甲基化與FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤≥1/2 有關(guān)，同時TMEFF2 蛋白陽性表達(dá)亦與FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、肌層浸潤≥1/2 有關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 EC 組織中TMEFF2 基因甲基化狀態(tài)和蛋白水平與臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

表2（續(xù)）

3 討論

EC 是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一類上皮性惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是多因素的生物學(xué)過程，涉及多個基因、多個階段[8]。然而，其準(zhǔn)確的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，也缺乏特異性的分子標(biāo)記物用于早期診斷。因此，研究影響EC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和治療靶點尤為重要。TMEFF2 是一種單通道跨膜蛋白，由于其獨特的結(jié)構(gòu)特征，在機(jī)體的許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用[9]。在本研究證實TMEFF2 蛋白在EC 組織中較正常子宮內(nèi)膜組織和癌前病變組織下降，而且EC 組織中TMEFF2 蛋白陽性表達(dá)率降低與基因啟動高甲基化狀態(tài)有關(guān)。此外EC 組織中TMEFF2 基因高甲基化與FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤≥1/2 有關(guān)，說明TMEFF2 可能在EC 發(fā)生和進(jìn)展過程中屬于功能性分子。

TMEFF2 基因位于染色體2q32-q33 上，可編碼374 個單位長度的Ⅰ型跨膜蛋白聚糖，其主要功能已被廣泛報道，一方面可刺激腦垂體前葉分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，并且通過結(jié)合淀粉樣蛋白衍生物提供神經(jīng)保護(hù)作用[10]；另一方面可通過激活JAK-STAT 通路[9]、調(diào)節(jié)一碳代謝[11]等參與多種細(xì)胞的癌變過程。TMEFF2 是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，其N 端含有一個信號肽，其次是兩個卵泡抑素樣結(jié)構(gòu)域、一個EGF 樣結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個短胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中EGF 樣結(jié)構(gòu)域由于重要的精氨酸殘基（Arg39）被組氨酸替代而顯示出功能上的無效性，而胞外區(qū)域的類卵泡抑素結(jié)構(gòu)域則被認(rèn)為是TMEFF2相關(guān)功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，例如可結(jié)合并調(diào)節(jié)各種生長因子，包括TGF 家族、血小板衍生因子和血管內(nèi)皮生長因子等[12]。由于TMEFF2 涉及多種癌癥和不同的功能，自本世紀(jì)初被發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)引起了各個領(lǐng)域的學(xué)者相當(dāng)大的興趣；然而，不同的研究結(jié)果似乎不一致，有時甚至相互矛盾。例如Mo HY 等[13]證實胃癌組織和結(jié)腸癌組織中TMEFF2 表達(dá)明顯降低，且其低表達(dá)與病理分期不良、腫瘤體積大、預(yù)后不良有關(guān)；除此以外，根據(jù)TCGA 和GSEA 數(shù)據(jù)集分析，在TMEFF2 低表達(dá)的胃癌組織中，與細(xì)胞增殖、凋亡和DNA 損傷等相關(guān)的基因表達(dá)更豐富，例如蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1 被鑒定為TMEFF2 的結(jié)合蛋白和TMEFF2 功能的中介體[14]。說明TMEFF2 在腫瘤發(fā)生中可通過增加細(xì)胞凋亡和阻斷細(xì)胞周期來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。此外Li K 等[15]在對35 例人胰腺組織及鄰近正常胰腺組織標(biāo)本，以及5 例人胰腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示與正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中TMEFF2 蛋白和基因均表達(dá)下調(diào)。而且上調(diào)胰腺癌細(xì)胞中TMEFF2 表達(dá)，可抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時抑制了p-STAT3、VEGF 表達(dá)，并增加了SHP-1 蛋白的表達(dá)，說明TMEFF2 可通過靶向結(jié)合SHP-1 調(diào)節(jié)STAT3/VEGF通路，進(jìn)而在胰腺癌中發(fā)揮抑癌作用。然而Elahi A等[16]發(fā)現(xiàn)TMEFF2 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸癌組織中均無表達(dá)，并推測TMEFF2 在大腸癌中表達(dá)缺失，可能不參與大腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。在本研究中，TMEFF2 蛋白在EC 組織中表達(dá)量普遍下調(diào)，且陽性表達(dá)率明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織或癌前病變組織，說明在子宮內(nèi)膜癌變過程中，TMEFF2 扮演著重要角色，可能是EC 發(fā)生的一個潛在的生物標(biāo)志物。

除此以外，TMEFF2 在其啟動子區(qū)存在CpG島，從TSP 開始跨度從-650 到+1 個堿基；而且TMEFF2 基因啟動子及其5’-上游CpG 島在許多癌癥中被證實存在高甲基化[17-19]。如Chen E 等[20]通過MSP 法檢測，發(fā)現(xiàn)59.5%的腎透明細(xì)胞癌組織中存在TMEFF2 基因高甲基化情況，而且TMEFF2 基因甲基化多發(fā)生于中晚期腫瘤組織中，且與患者預(yù)后不良有關(guān)。早在本世紀(jì)初，Young J 等[21]通過RTPCR 法分析顯示，TMEFF2 在28/30 例正常黏膜組織中呈陽性表達(dá)，而在結(jié)直腸癌組織中僅有7/30 例表達(dá)，且經(jīng)雜合性缺失（LOH）分析顯示僅有1 例結(jié)直腸癌出現(xiàn)TMEFF2 基因LOH。另外46 例結(jié)直腸癌組織在49 個CpG 位點上的DNA 甲基化程度超過30%。這與本研究結(jié)果基本一致，在本研究中EC組織普遍存在TMEFF2 基因啟動高甲基化狀態(tài)，且與TMEFF2 蛋白表達(dá)缺失有關(guān)。張文濤等[22]利用DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑-5-氮雜-2’脫氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine，5-Aza-DC）處理Bca 細(xì)胞系后，TMEFF1 mRNA 和蛋白表達(dá)得到恢復(fù)，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲明顯被抑制。此外Young J 等[23]團(tuán)隊對對大腸癌體細(xì)胞和生殖系突變的全基因搜索，在63 個腫瘤和相應(yīng)的正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)TMEFF2基因的致病突變；而Chen E 等[20]團(tuán)隊對子宮內(nèi)膜病變?nèi)V中的5 個基因進(jìn)行了定量甲基化分析，證實EC 組織中TMEFF2 基因甲基化指數(shù)高于正常子宮內(nèi)膜組織。上述這些結(jié)果均表明DNA 甲基化而非LOH 是抑制TMEFF2 表達(dá)的主要影響因素，這也解釋了本研究結(jié)果。此外也說明TMEFF2 基因的啟動子甲基化是EC 中常見的表觀遺傳事件。檢測TMEFF2 基因的表觀甲基化可能是一個有價值的標(biāo)記，用于鑒別診斷癌前病變中未檢測到的EC 患者。

綜上所述，EC 組織中普遍存在TMEFF2 蛋白表達(dá)缺失以及TMEF22 基因高甲基化狀態(tài)，而且TMEFF2 基因啟動子甲基化可能是導(dǎo)致EC 組織中TMEFF2 蛋白表達(dá)降低的主要原因之一。本研究結(jié)果對于探討EC 的發(fā)病機(jī)制以及尋找早期診斷的有效生物標(biāo)志物具有重要意義，并有助于確定EC 的潛在治療靶點。